Name: nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium
Uploaded: 2022-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

העבודה המתוארת כאן נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (RO1-EY29410 ל- J.M.G, ומענק הליבה של NIH P30-EY08098 למחלקה לרפואת עיניים); המרכז להשתלות וטיפול חיסוני UPMC (ל- L.L.L. ו- J.M.G.); והקתדרה ע"ש א. רונלד סלוויטי לחקר רפואת עיניים (ל-J.M.G.). תמיכה נוספת התקבלה ממלגת ויגנד ברפואת עיניים (ל-L.L.L), מקרן העין והאוזניים של פיטסבורג, ומענק בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון, ניו יורק, ניו יורק. המחברים רוצים גם להודות לאמנדה פלאט על הסיוע הטכני ולד"ר יו האמר ולצוות האקוואטיקה על תמיכה מצוינת בטיפול בבעלי חיים.

כל המתודולוגיות המפורטות כאן תואמות את הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת פיטסבורג.
1. הכנה לפני איסוף עוברים של דגי זברה
<ol><li>הגדר את חממת העוברים ל-28.5 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הכינו תמיסת מלאי פי 25 של מעכב המלנוגנזה, N-פנילתיאוריאה (PTU)<sup class="...

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה להפחתה גנטית של ה-RPE וחקר מנגנונים של התנוונות והתחדשות בדגי זברה בגיל הזחל. פרוטוקול זה בוצע בהצלחה גם בדגי זברה בוגרים3 אך עם אפיון פחות נרחב, ולכן הזחלים הם המוקד כאן. היבטים קריטיים של חלק זה של הפרוטוקול (שלבים 1-4) כוללים: 1) הוספת 1.5x PTU לעוברים לפנ?...

המתודולוגיה המתוארת כאן מפרטת פרוטוקול להפחתה גנטית של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) תוך שימוש בדגי זברה זחליים. ה-RPE משתרע על גב העין ושוכן בין השכבות המרובדות של הרשתית העצבית לבין שכבת כלי הדם המרכיבה את הכורואיד. תמיכה טרופית, ספיגת אור פוטוטוקסי ושמירה על חלבוני מחזור הראייה הם רק חלק מהפונקציות הקריטיות שה-RPE מבצע, החיוניות לשמירה על הבריאות והשלמות של הרקמות הסמוכות הללו1. נזק ל- RPE של יונקים ניתן לתיקון כאשר הנגעים קטנים2; עם זאת, נזק שנגרם על ידי פציעות גדולות יותר או מחלה ניוונית מתקדמת הוא בלתי הפיך. בבני אדם, מחלות ניווניות RPE (למשל, ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) ומחלת סטארגרדט) מובילות לאובדן ראייה קבוע, ועם מעט אפשרויות טיפול זמינות, ירידה באיכות החיים של המטופלים. היכולת המוגבלת של יונקים RPE לתקן את עצמם יצרה פער ידע בתחום התהליכים הרגנרטיביים של RPE. בהתחשב ביכולת ההתחדשות החזקה של דגי הזברה בסוגי רקמות רבים ושונים, פרוטוקול זה פותח כדי להקים מערכת חוליות in vivo כדי להקל על מחקרים על RPE מתחדש במהותו ולחשוף מנגנונים המניעים תגובה זו. באמצעות פרדיגמת האבלציה המתוארת כאן, מסלול האיתות הקנוני Wnt3, מסלול mTOR4 ותגובות הקשורות למערכת החיסון5 זוהו כמתווכים קריטיים של התחדשות RPE, ככל הנראה עם פונקציות חופפות.
בפרדיגמה זו של אבלציה גנטית, Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 דגי זברה מבטאים את הגן nitroreductase שמקורו בחיידקים (NTR/nfsB)6 שהתמזג עם eGFP תחת שליטה של אלמנט משפר RPE, rpe65a7. אבלציה מושגת על ידי הוספת הפרודרוג, metronidazole (MTZ), למערכת מים המאכלסת דגי זברה. הפעלה תוך-תאית של MTZ על-ידי ניטרו-רדוקטאז גורמת להצלבת דנ"א ולאפופטוזיס בתאים המבטאים NTR/nfsB 8,9. טכנולוגיה זו נמצאת בשימוש נרחב בדגי זברה כדי לנטרל תאים של הרשתית 10,11,12,13 ורקמות אחרות 8. יחד, רכיבים אלה מאפשרים ביטוי ממוקד (rpe65a) של מתודולוגיית אבלציה של תאים אינדוקטיביים (NTR/MTZ)8,9 וסמן פלואורסצנטי (eGFP) להדמיה.
קיימים גם מודלים מעניינים אחרים של in vivo שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את הפוטנציאל הרגנרטיבי של RPE14. אלה הם רחבים וכוללים טרנסדיפרנציה של RPE לרשתית לאחר כריתת רטין בדו-חיים, שבה תאי RPE שאבדו לצמיחה מחדש של הרשתית מוחלפיםב-15,16; שחזור RPE לאחר פציעה בעכבר MRL /MpJ "סופר מרפא"17; וגירוי אקסוגני של התפשטות RPE במודל חולדות של RPE ספונטני וניוון רשתית18, בין היתר. כמו כן פותחו מודלים במבחנה, כגון תאי גזע RPE אנושיים בוגרים (RPESCs)19. מודלים אלה הם כולם כלים חשובים הפועלים לחשיפת התהליכים התאיים הקשורים להתחדשות RPE (למשל, התפשטות, התמיינות וכו '); עם זאת, דג הזברה הוא ייחודי ביכולתו לתקן RPE פנימי לאחר אבלציה.
בעוד שהמתודולוגיה כאן נכתבה כדי להתמקד בהבנת המנגנונים המניעים את התחדשות ה-RPE, ניתן להשתמש בקו Tg(rpe65a:nfsB-eGFP) ובפרוטוקול אבלציה גנטי זה כדי לחקור תהליכים תאיים אחרים כגון אפופטוזיס RPE, ניוון RPE והשפעת פגיעה ב-RPE על רקמות רשתית וכלי דם סמוכות. ניתן גם לשנות את פרוטוקול האבלציה כך שיכלול מניפולציה פרמקולוגית, שהיא אסטרטגיה ראשונית נוחה לסינון מסלולי איתות מעניינים. לדוגמה, חסימת מסלול Wnt הקנוני באמצעות מעכב של Wnt Response-1 (IWR-1)20, הוכחה כפגיעה בהתחדשות RPE3. זה חזר על עצמו כאן כדי להדריך משתמשים בניסוי מניפולציה פרמקולוגית ולשמש הוכחת היתכנות לאימות סקריפט MATLAB (RpEGEN) שנוצר כדי לכמת התחדשות RPE בהתבסס על שחזור של פיגמנטציה. בדומה לקו המהונדס ולפרוטוקול האבלציה, סקריפטי RpEGEN ניתנים להתאמה וניתן להשתמש בהם כדי לכמת סמנים/תהליכים תאיים אחרים בתוך ה-RPE.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lab Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>Catalog number is for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond tip scribing pen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-254-51</td>
			<td>Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) &#8805;99.7 %</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (large)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3720A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (mini/tabletop)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td>Or similar, with 488 nm excitation laser/filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-4</td>
			<td>Manufactured by Corning, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5.04462</td>
			<td>Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue (powder)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP117-100</td>
			<td>Also available as a premade aqeuous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole (MTZ)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3761</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td>Chemical waste, proper disposal required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (powder packets)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Used to make 10 X PBS stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PRON-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>H2010</td>
			<td>Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Or similar, with transmitted light illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Fine-tipped forceps for manual dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop rotator/shaker</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z135003</td>
			<td>3.2 mL bulb draw, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS1, TRS2, TRS5</td>
			<td>Also available from Fisher Scientific (NC0342409)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td>Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRAMM examples and how-tos</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB support</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/support.html</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) שוכן בחלק האחורי של העין ומבצע פונקציות החיוניות לשמירה על בריאותן ושלמותן של רקמות הרשתית וכלי הדם הסמוכות. נכון לעכשיו, יכולת התיקון המוגבלת של RPE של יונקים, המוגבלת לפציעות קטנות, עיכבה את ההתקדמות להבנת תהליכי התחדשות in vivo RPE. כאן, מתודולוגיה מפורטת מסופקת כדי להקל על המחקר של תיקון in vivo RPE תוך שימוש בדגי הזברה, מודל של בעלי חוליות המסוגל להתחדשות רקמות חזקה. פרוטוקול זה מתאר פרדיגמת פציעה מהונדסת בתיווך ניטרורדוקטאז/מטרונידזול (NTR/MTZ) (rpe65a:nfsB-eGFP), אשר גורמת לאבלציה של שני השלישים המרכזיים של ה-RPE לאחר טיפול של 24 שעות ב-MTZ, עם התאוששות רקמות לאחר מכן. הפוקוס מושם על אבלציות RPE בדגי זברה זחליים ומתווות גם שיטות לבדיקת ההשפעות של תרכובות פרמקולוגיות על התחדשות RPE. כמו כן נדון ביצירה ובאימות של RpEGEN, סקריפט MATLAB שנוצר כדי להפוך את הכימות של התחדשות RPE לאוטומטית המבוססת על פיגמנטציה. מעבר למנגנוני תיקון RPE פעילים, ניתן להרחיב פרוטוקול זה למחקרים על ניוון RPE ותגובות פציעה, כמו גם על ההשפעות של נזקי RPE על רקמות רשתית וכלי דם סמוכות, בין תהליכים תאיים ומולקולריים אחרים. מערכת דגי זברה זו טומנת בחובה הבטחה משמעותית בזיהוי גנים, רשתות ותהליכים המניעים התחדשות RPE ומנגנונים הקשורים למחלות RPE, במטרה ארוכת טווח ליישם ידע זה על מערכות יונקים, ובסופו של דבר, לקראת התפתחות טיפולית.

עיכוב מסלול האיתות הקנוני של Wnt ידוע כפוגע באופן משמעותי בהתחדשות RPE של דגי זברה באמצעות פרדיגמת האבלציה הגנטית (rpe65a:nfsB-eGFP) ומתודולוגיית המניפולציה הפרמקולוגית (IWR-1) המתוארת בפרוטוקול3. ניסוי זה חזר על עצמו כאן כדי לאמת שיטה אוטומטית לכימות התחדשות RPE של דגי זברה המבוססת על...

Watch this Scientific Journal Video about Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה להסרה גנטית של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) באמצעות מודל של דגי זברה מהונדסים. התאמת הפרוטוקול לשילוב אפנון מסלול איתות באמצעות תרכובות פרמקולוגיות מפורטת בהרחבה. פלטפורמת MATLAB לכימות התחדשות RPE המבוססת על פיגמנטציה פותחה והוצגה ונדונה.

ניטרורדוקטאז/אבלציה בתיווך מטרונידזול ופלטפורמת MATLAB (RpEGEN) לחקר התחדשות של אפיתל פיגמנט הרשתית של דג הזברה

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

דג הזברה הוא ייחודי ביכולתו הפנימית לחדש סוגי רקמות רבים ושונים, כולל RPE. פרוטוקול זה יכול לשמש לזיהוי מסלולים מולקולריים המניעים התחדשות RPE ומנגנונים הקשורים למחלות RPE. רב-תכליתיות היא יתרון עיקרי של מתודולוגיה זו.בנוסף לחקר התחדשות RPE, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לבחון תהליכים ניווניים של RPE ואת ההשפעות של נזקי RPE על רקמות סמוכות בעין. יונקים, כולל בני אדם, אינם מסוגלים לתקן פציעות RPE גדולות הנובעות מטראומה או ממחלות ניווניות. השימוש בדגי זברה ככלי לגילוי גורמים פרו-רגנרטיביים של RPE הוא צעד משמעותי לקראת קידום התחדשות RPE של יונקים.כדי להכין תמיסת MTZ טרייה של 10 מילימולאר, חמישה ימים לאחר ההפריה, מוסיפים אבקת MTZ למי המערכת ללא PTU ומערבבים היטב על ידי רעידות נמרצות במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. קירור תמיסת MTZ של 10 מילימולר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על מסובב שולחן או שייקר. כדי לסנן זחלי דגי זברה מהטרנסגן rpe65a:nsfB-eGFP, הפרדת זחלים חיוביים של eGFP מהונדסים מזחלים חיוביים מ-eGFP לא מהונדסים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי עם לייזר עירור של 488 ננומטר.הזחלים המוקרנים מתעוררים מיד על ידי צנרת ישירות לתוך צלחת פטרי עם PTU טרי 1.5X ללא טריקאין. עם סיום ההקרנה, יש להפריד עוד יותר את הזחלים החיוביים של eGFP לשתי קבוצות של צלחות פטרי, קבוצה אחת שתקבל טיפול MTZ וקבוצה אחת שתהיה השליטה הבלתי מעורערת. לאחר מכן יש לנטרל את אפיתל פיגמנט הרשתית על ידי הסרת 1.5X PTU מכלי הטיפול האבלציה ולהוסיף את תמיסת ה-MTZ הטרייה 10 מילימולר.כמו כן, יש להסיר 1.5X PTU מכלי הבקרה ללא הפרעה ולהוסיף מי מערכת מתוקים ללא PTU. הסר את תמיסת 10 millimolar MTZ לאחר 24 שעות בדיוק והוסף מי מערכת מתוקים ללא PTU. החליפו את מי המערכת המתוקים ללא PTU על הכלים השליליים של MTZ.מסך eGFP זחלים חיוביים בארבעה ימים לאחר ההפריה. ה-eGFP נראה ארבעה ימים לאחר ההפריה, אך נראה עמום יותר מעוצמת האות ביום החמישי. מניחים זחלים חיוביים של eGFP בצלחות של שש בארות במקום בצלחות פטרי בצפיפות של לא יותר מ-10 זחלים לכל באר לטיפול תרופתי.ייעדו לוחות נפרדים בעלי שש בארות לזחלים מעוותים ובלתי מרוסנים. קבע את הנפח של 15 מיקרומולר IWR-1 או נפח תואם לנפח בקרת רכב DMSO טיפולים מקדימים הדרושים וחייב 1.5X PTU לצינורות חרוטיים בהתאם. הוסף את מלאי IWR-1 ל-PTU של 1.5X לקבלת ריכוז סופי של 15 מיקרומולר IWR-1.הוסף נפח תואם של מלאי DMSO ל- 1.5X PTU. מערבבים היטב על ידי מערבולת ומאשרים חזותית את פירוק התרכובות. הסר 1.5X PTU מהזחלים החיוביים של eGFP בלוחות של שש בארות והוסף חמישה מיליליטרים לכל באר של טיפולי DMSO טריים של 0.06% DMSO או 15 מיקרומולר IWR-1.בטל את ה- RPE למחרת. במשך חמישה ימים לאחר ההפריה, קבעו את נפח הטיפולים הפרמקולוגיים והבקרה של כלי הרכב הדרושים הן ללוחות ששת הקידוחים והן ללוחות שש הקידוחים והבלתי מרוסנים של שש הקידוחים, ונפחים מתאימים של מי מערכת מתוקים ללא PTU או תמיסת MTZ של 10 מילימולארים לצינורות חרוטיים. הוסף פתרונות מלאי IWR-1 ו- DMSO לצינורות החרוטיים המתאימים כפי שבוצעו בעבר.מערבבים היטב על ידי מערבולת ומאשרים חזותית את פירוק התרכובות. הסר 0.06% DMSO ו-15 טיפולים מקדימים של IWR-1 מיקרומולרי ב-1.5X PTU מצלחות ייעודיות ללא ספיגה ו-15 קרם של שישה בארות. יש לחדש עם מי המערכת המתוקה המתאימה ללא טיפולי תמיסת PTU ו-MTZ.הסר 0.06% DMSO ו-15 מיקרומולר IWR-1 טיפולים בתמיסת MTZ של 10 מילימולר לאחר 24 שעות בדיוק ומלא את חידוש הטיפולים במים מתוקים במערכת טרייה ללא PTU. מלאו 0.06% DMSO ו-15 טיפולים במיקרומולר IWR-1 במים מתוקים ללא PTU על צלחת שש הקידוחים הבלתי מעורערת. עקוב אחר ההצלחה וההיקף של אבלציה in vivo באמצעות תאורת אור מועברת במיקרוסקופ סטריאו לצורך תחזוקת זחלים לאחר אבלציה גנטית.כדי ליצור את אזור העניין של RPE או ROI באמצעות פיג'י, פתח תמונת TIFF של שמונה סיביות, כיוון מחדש את התמונה כך שהצד הגבי יהיה למעלה והדיסטלי יישאר על ידי בחירת תמונה, שינוי צורה והפיכה אופקית. עבור הפקודה האחרונה, בחר את האפשרות המתאימה ביותר לכיווניות הדרושה עבור תמונה זו. התחל את מנהל ההחזר על ההשקעה על ידי בחירת ניתוח, כלים, מנהל החזר על ההשקעה.השתמש בתמונה, בזום ובמעבר בין ערוצי DAPI ו- Brightfield. השתמש בקיצורי מקשים ליעילות. זהה את הנקודה שבה הצד האפיקלי של ה-RPE צמוד מקצה הממברנה המגבילה החיצונית והשתמש בנקודת ציון אנטומית זו כנקודת ההתחלה של ההחזר על ההשקעה.צור את החזר ההשקעה של RPE עם כלי בחירת המצולעים בסרגל הכלים של פיג'י באמצעות ערוצי התמונה DAPI ו- Brightfield ופונקציית זום התמונה כדי לזהות גבולות RPE אפיים ובסיסיים. הביאו את הקצוות הגביים והגחוניים של ההחזר על ההשקעה לנקודה חדה במקום להקהות או לעגל. הוסף את ההחזר על ההשקעה על-ידי לחיצה על הוסף במנהל ההחזר על ההשקעה.שמור את קובץ ההחזר על ההשקעה על-ידי בחירה נוספת ושמור בתוך מנהל ההחזר על ההשקעה. לחץ פעמיים על ה- rpegen. קובץ m לפתיחה בחלונית העורך.תחת מקטע המשתנה המוגדר על ידי המשתמש של rpegen. m קובץ, הזן את מיקומי הספריות עבור תיקיות המכילות את קבצי ההחזר על ההשקעה, את קבצי התמונה tiff והיכן יש לשמור קבצי פלט. הזן את שם הקבוצה עבור קובץ ה- mat לייצוא ואת המיקום של ערוץ Brightfield במחסנית התמונות של TIFF.הפעל את הסקריפט על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה בתפריט העורך בחלק העליון של MATLAB. לאחר שמירת קובץ ה- MAT, תופיע דמות של שלושה פאנלים וגם תישמר כקובץ PDF בספריית הפלט עבור כל הפעלת תמונה. המתן עד שמסמכי PDF אלה של בקרת האיכות יישמרו בתיקיית הפלט והנתון האחרון ייעלם.פתחו את מסמכי ה-PDF הבודדים וודאו שכל ה-ROIs תואמים לתמונות של ברייטפילד. לחץ פעמיים על rpegen_permplot. m קובץ לפתיחה בכרטיסיית עורך חדשה.תחת מקטע משתנים המוגדרים על-ידי משתמש אחד, הזן את מיקום הספרייה עבור תיקיית הפלט המכילה את קבצי MAT מהפעלת rpegen. m סקריפט. הזן כל שם קובץ MAT לטעינה.הפעל מקטע זה של קובץ ה- Script על-ידי לחיצה על לחצן הפעל מקטע בתפריט העורך. בחלק השני, הזן את שמות שתי הקבוצות להשוואה סטטיסטית בנתונים A ובמשתני נתונים B וציין את מספר החזרות של סימולציית התמורות במשתנה החזרות. רק 2, 000 חזרות שימשו עבור הדגמה זו כדי להפחית את זמן העיבוד.הפעל מקטע זה של קובץ ה- Script על-ידי לחיצה על לחצן הפעל מקטע בתפריט העורך. הפעל איור מפת חום ותוצאות קבוצתיות ומקטעי ערך P באופן עצמאי באמצעות לחצן מקטע ההפעלה. נזק שלם של זחל לאחר ההפריה במשך חמישה ימים הראה ביטוי טרנסגני בהיר ב-RPE בזמן הסינון לאבלציה גנטית.קריוזציה רוחבית של זחלים ללא הפרעה שנמשכו שישה ימים לאחר ההפריה הראתה שהביטוי הטרנסגני מוגבל לתאי RPE בוגרים, כאשר הביטוי הבהיר ביותר מוגבל ל-2/3 המרכזי של ה-RPE. ראשי חץ מצביעים על מיקרוווילי אפיקלי. קריוזציה רוחבית של זחל בעל אבלציה של יום אחד לאחר הפציעה גילתה שיבוש במורפולוגיה החיובית של תאי eGFP.חצים מצביעים על גרעינים פיקנוטיים. נזקי הר שלמים של זחלים ללא הפרעה במשך שבעה ימים לאחר ההפריה הראו פיגמנטציה של RPE בכל העין וזחלים עם אבלציה של יומיים לאחר הפציעה הראו אזור אבלציה ללא פיגמנט במרכז RPE. עלילה שנוצרה באמצעות RpEGEN הראתה דמיון בין קבוצות DMSO ו-IWR-1 שנותרו ללא הפרעה במשך תשעה ימים לאחר ההפריה, לכל אורך ה-RPE.העלילה הראתה את עוצמת הפיקסלים הקלה יותר באופן כללי בקבוצות ה-DMSO וה-IWR-1 של ארבעת הימים שלאחר הפציעה, שנראו קלות ביותר ב-IWR-1 עם אבלציה בהשוואה לכל קבוצת טיפול אחרת. ההבדלים בפיגמנטציה המרכזית של RPE היו משמעותיים כאשר השוו את הזחלים שטופלו ב-IWR-1 לאבלציה של זחלים שטופלו ב-IWR-1 לבין בקרות שטופלו ב-DMSO. באמצעות פרדיגמת אבלציה זו של דג זברה, הצלחנו לזהות מספר מסלולי איתות מולקולריים, כגון איתות רוח שהראינו כאן, שהם מווסתים קריטיים של התחדשות RPE.

Research

JoVE Journal

Biology

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

מערכת culturing איריס תאים פיגמנט אפיתל לחקר התחדשות עדשה של ניוט

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

פרופילי הביטוי microRNA של תאי iPS האנושי, רשתית פיגמנט האפיתל נגזר משב&quot;ס, ועוברי הרשתית פיגמנט האפיתל

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea (MNU) -induced רשתית ניוון והתחדשות בדג הזברה: היסטולוגית ומאפיינים פונקציונליים

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

התא העיקרי של אפיתל הפיגמנט ברשתית העכבר תרבויות

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

בידוד של תאי אפיתל פיגמנטים ברשתית של עכברים ראשוניים

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

ייצור יעיל ועקבי של אפיתל פיגמנט רשתית/כורואיד שטוח מעיני אדם לניתוח היסטולוגי

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...