Name: nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium
Uploaded: 2022-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

본원에 기재된 작업은 국립 보건원 (RO1-EY29410 내지 J.M.G, 및 NIH CORE 그랜트 P30-EY08098 내지 안과)에 의해 지원되었다; UPMC 면역 이식 및 치료 센터 (L.L.L. 및 J.M.G.); 안과 연구의 E. Ronald Salvitti Chair (J.M.G.). 안과 Wiegand Fellowship in Ophthalmology (L.L.L), 피츠버그의 Eye & Ear Foundation, 그리고 실명 방지를위한 연구, 뉴욕, 뉴욕의 무제한 보조금으로부터 추가 지원이 접수되었습니다. 저자는 또한 기술 지원에 대한 아만다 플랫과 휴 해머 박사와 우수한 동물 관리 지원에 대한 수생 스태프에게 감사하고 싶습니다.

여기에 설명 된 모든 방법론은 피츠버그 대학의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)를 준수합니다.
1. 제브라피쉬 배아 채취 전의 제조
<ol><li>배아 배양기를 28.5°C로 설정합니다.</li>
	<li>멜라닌 생성 억제제인 N-페닐티오우레아(PTU)21,22의 25x 원액을 제조하였다. 이 원액은 일반적인 레시피22?...

이 프로토콜은 RPE를 유전적으로 완화시키는 방법론을 설명하고 유충 노화 제브라 피쉬에서 퇴행 및 재생 메커니즘을 연구합니다. 이 프로토콜은 또한 성인 제브라 피쉬3에서 성공적으로 수행되었지만 덜 광범위한 특성화로 인해 애벌레가 여기에 초점을 맞추고 있습니다. 프로토콜의이 부분의 중요한 측면 (단계 1-4)은 1) 멜라닌 생성의 발병 전에 배아에 1.5x PTU를 추가, 2) 2-3 dpf ?...

본원에 기재된 방법론은 유충 제브라피쉬를 이용하는 망막 색소 상피(RPE)를 유전적으로 절제하기 위한 프로토콜을 상세히 기술한다. RPE는 눈 뒤쪽으로 확장되어 신경 망막의 층층과 맥락막을 구성하는 혈관 구조 층 사이에 있습니다. 영양 지원, 광독성 광의 흡수 및 시각 주기 단백질의 유지는 RPE가 수행하는 중요한 기능 중 일부에 불과하며, 이는 이러한 인접한 조직의 건강 및 완전성을 유지하는 데 필수적인1. 포유동물 RPE에 대한 손상은 병변이 작을 때 회복가능하다2; 그러나 더 큰 부상이나 진행성 퇴행성 질환으로 인한 손상은 돌이킬 수 없습니다. 인간에서 RPE 퇴행성 질환 (예를 들어, 연령 관련 황반 변성 (AMD) 및 Stargardt 질환)은 영구적 인 시력 상실을 초래하고 사용 가능한 치료 옵션이 거의 없기 때문에 환자의 삶의 질을 떨어 뜨립니다. 포유류 RPE가 자체 복구 할 수있는 제한된 능력은 RPE 재생 프로세스 분야에서 지식 격차를 창출했습니다. 다양한 조직 유형에 걸쳐 제브라피쉬의 강력한 재생 능력을 감안할 때,이 프로토콜은 본질적으로 재생 RPE에 대한 연구를 용이하게하고 그 반응을 유도하는 메커니즘을 밝히기 위해 생체 내 척추 동물 시스템을 구축하기 위해 개발되었습니다. 여기에 요약된 절제 패러다임을 사용하여, 정준 Wnt 신호전달 경로(3), mTOR 경로(4), 및 면역-관련 반응(5 )이 RPE 재생의 중요한 매개체로서 확인되었으며, 아마도 중첩된 기능을 갖는다.
이 유전자 절제 패러다임에서, Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 제브라피쉬는 RPE 인핸서 요소인 rpe65a7의 제어하에 eGFP에 융합된 박테리아 유래 니트로리덕타제(NTR/nfsB) 유전자 6을 발현한다. 절제술은 전구 약물 인 메트로니다졸 (MTZ)을 시스템 수거용 제브라 피쉬에 첨가함으로써 달성됩니다. 니트로리덕타제에 의한 MTZ의 세포내 활성화는 NTR/nfsB 발현 세포 8,9에서 DNA 가교결합 및 아폽토시스를 초래한다. 이 기술은 망막10,11,12,13 및 기타 조직8의 세포를 제거하기 위해 제브라 피쉬에서 널리 사용되었습니다. 함께, 이들 요소들은 유도성 세포 절제 방법론(NTR/MTZ)8,9 및 시각화를 위한 형광 마커(eGFP)의 표적화된 발현(rpe65a)을 가능하게 한다.
RPE14의 재생 잠재력을 연구하는데 사용될 수 있는 다른 흥미로운 생체내 모델도 존재한다. 이들은 광범위하며 양서류에서 RPE-망막으로의 전분화 후 망막 절제술을 포함하며, 여기서 망막 재성장으로 손실된 RPE 세포는15,16으로 대체된다; RPE 회복 후 부상 후 "슈퍼 치유" MRL/MpJ 마우스17; 및 자발적 RPE 및 망막 변성의 래트 모델에서 RPE 증식의 외인성 자극및 18, 그 중에서도. 성체 인간 RPE 줄기 세포 (RPESCs)19와 같은 시험관내 모델도 또한 개발되었다. 이러한 모델은 RPE 재생과 관련된 세포 과정(예를 들어, 증식, 분화 등)을 밝히기 위해 작용하는 모든 유용한 도구이다; 그러나 제브라 피쉬는 절제 후 고유 한 RPE 수리 용량이 독특합니다.
여기의 방법론은 RPE 재생을 유도하는 메커니즘을 이해하는 데 초점을 맞추기 위해 작성되었지만 Tg (rpe65a : nfsB-eGFP) 라인과이 유전 적 절제 프로토콜은 RPE 아폽토시스, RPE 변성 및 인접한 망막 및 혈관 조직에 대한 RPE 손상의 효과와 같은 다른 세포 과정을 연구하는 데 활용 될 수 있습니다. 절제 프로토콜은 또한 약리학적 조작을 포함하도록 변형될 수 있으며, 이는 관심 있는 신호전달 경로를 스크리닝하기 위한 편리한 예비 전략이다. 예를 들어, Wnt Response-1 (IWR-1)20의 억제제를 사용하여 정준 Wnt 경로를 차단하면, RPE 재생3을 손상시키는 것으로 나타났다. 이것은 약리학 적 조작 실험을 통해 사용자를 안내하고 색소 침착의 회복을 기반으로 RPE 재생을 정량화하기 위해 생성 된 MATLAB 스크립트 (RpEGEN)를 검증하기위한 개념 증명 역할을하기 위해 여기에서 반복되었습니다. 트랜스제닉 라인 및 절제 프로토콜과 마찬가지로 RpEGEN 스크립트는 적응이 가능하며 RPE 내의 다른 마커/세포 프로세스를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Lab Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>Catalog number is for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond tip scribing pen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-254-51</td>
			<td>Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) &#8805;99.7 %</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (large)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3720A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (mini/tabletop)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td>Or similar, with 488 nm excitation laser/filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-4</td>
			<td>Manufactured by Corning, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5.04462</td>
			<td>Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue (powder)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP117-100</td>
			<td>Also available as a premade aqeuous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole (MTZ)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3761</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td>Chemical waste, proper disposal required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (powder packets)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Used to make 10 X PBS stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PRON-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>H2010</td>
			<td>Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Or similar, with transmitted light illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Fine-tipped forceps for manual dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop rotator/shaker</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z135003</td>
			<td>3.2 mL bulb draw, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS1, TRS2, TRS5</td>
			<td>Also available from Fisher Scientific (NC0342409)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td>Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRAMM examples and how-tos</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB support</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/support.html</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium

망막 색소 상피 (RPE)는 눈 뒤쪽에 상주하며 인접한 망막 및 혈관 조직의 건강과 무결성을 유지하는 데 필수적인 기능을 수행합니다. 현재, 작은 부상으로 제한되는 포유류 RPE의 제한된 회복 능력은 생체 내 RPE 재생 과정을 이해하는 데 진전을 방해했습니다. 여기에서, 강력한 조직 재생이 가능한 척추동물 모델인 제브라피쉬를 활용한 생체내 RPE 복구의 연구를 용이하게 하기 위한 상세한 방법론이 제공된다. 이 프로토콜은 트랜스제닉 니트로환원효소/메트로니다졸(NTR/MTZ) 매개 손상 패러다임(rpe65a:nfsB-eGFP)을 기술하며, 이는 MTZ로 24시간 치료 후 RPE의 중앙 2분의 2를 절제하고 후속 조직 회복을 초래합니다. 유충 제브라 피쉬의 RPE 절제술에 중점을두고 RPE 재생에 대한 약리학 적 화합물의 효과를 테스트하는 방법도 요약되어 있습니다. 색소침착을 기반으로 RPE 재생의 정량화를 자동화하기 위해 만들어진 MATLAB 스크립트인 RpEGEN의 생성 및 검증도 논의됩니다. 활성 RPE 복구 메카니즘을 넘어, 이 프로토콜은 RPE 변성 및 손상 반응에 대한 연구뿐만 아니라 다른 세포 및 분자 과정 중에서도 인접한 망막 및 혈관 조직에 대한 RPE 손상의 영향으로 확장될 수 있다. 이 제브라피쉬 시스템은 RPE 재생 및 RPE 질병 관련 메커니즘을 유도하는 유전자, 네트워크 및 프로세스를 식별하는 데 중요한 약속을 가지고 있으며,이 지식을 포유류 시스템에 적용하고 궁극적으로 치료 개발에 적용하는 장기적인 목표를 가지고 있습니다.

정준 Wnt 신호전달 경로를 억제하는 것은 프로토콜3에 기재된 유전자 절제 패러다임(rpe65a:nfsB-eGFP) 및 약리학적 조작 방법론(IWR-1)을 사용하여 제브라피쉬 RPE 재생을 유의하게 손상시키는 것으로 알려져 있다. 이 실험은 색소침착에 기초한 제브라피쉬 RPE 재생을 정량화하는 자동화된 방법을 검증하기 위해 여기에서 반복되었다. 아래에 요약 된 결과는 수정 일 (0dpf)부터 RpEGEN...

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Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

이 프로토콜은 형질전환 제브라피쉬 모델을 사용하여 망막 색소 상피(RPE)를 유전적으로 제거하는 방법론을 기술한다. 약리학적 화합물을 이용한 신호전달 경로 조절을 통합하도록 프로토콜을 적응시키는 것은 광범위하게 상세하다. 색소침착을 기반으로 RPE 재생을 정량화하기 위한 MATLAB 플랫폼이 개발되어 발표되고 논의됩니다.

니트로환원효소/메트로니다졸 매개 절제 및 제브라피쉬 망막 색소 상피의 재생 연구를 위한 MATLAB 플랫폼(RpEGEN)

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

제브라피쉬는 RPE를 포함한 다양한 조직 유형을 재생하는 고유 한 능력에서 독특합니다. 이 프로토콜은 RPE 재생 및 RPE 질환 관련 메카니즘을 구동하는 분자 경로를 확인하는데 사용될 수 있다. 다양성은이 방법론의 주요 이점입니다.RPE 재생을 연구하는 것 외에도, 이 프로토콜은 RPE 퇴행성 과정과 눈의 인접한 조직에 대한 RPE 손상의 영향을 검사하는 데 활용될 수 있습니다. 인간을 포함한 포유류는 외상이나 퇴행성 질환으로 인한 대규모 RPE 부상을 복구 할 수 없습니다. RPE 재생 인자를 발견하는 도구로 제브라피쉬를 사용하는 것은 포유류 RPE 재생을 촉진하기 위한 중요한 단계입니다.수정 후 5 일 동안 신선한 10 밀리몰 MTZ 용액을 준비하려면 MTZ 분말을 PTU가없는 시스템 물에 넣고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 격렬하게 흔들어서 완전히 섞으십시오. 10 밀리몰 MTZ 용액을 탁상 회전기 또는 쉐이커에서 실온에서 1 시간 동안 냉각하십시오. rpe65a:nsfB-eGFP 트랜스진으로부터 제브라피쉬 유충을 스크리닝하기 위해, 488 나노미터 여기 레이저가 있는 형광 스테레오 현미경을 사용하여 트랜스제닉 eGFP 음성 유충으로부터 트랜스제닉 eGFP 양성 유충을 분리한다.각성 선별 된 애벌레는 트리카인이없는 신선한 1.5X PTU가있는 페트리 접시에 직접 피펫팅하여 즉시 위로 올라갑니다. 스크리닝이 완료되면, eGFP 양성 유충을 페트리 디쉬의 두 그룹으로 더 분리하고, 한 그룹은 MTZ 치료를 받고 한 그룹은 절제되지 않은 대조군이 될 것이다. 그런 다음 절제 처리 접시에서 1.5X PTU를 제거하여 망막 색소 상피를 절제하고 새로 만든 10 밀리몰 MTZ 용액을 첨가한다.또한 절제되지 않은 제어 접시에서 1.5X PTU를 제거하고 PTU없이 신선한 시스템 물을 추가하십시오. 정확히 24 시간 후에 10 밀리몰 MTZ 용액을 제거하고 PTU가없는 신선한 시스템 물을 추가하십시오. MTZ 네거티브 접시에 PTU가없는 신선한 시스템 물을 바꿉니다.수정 후 나흘에 eGFP 양성 유충을 선별합니다. eGFP는 수정 후 나흘 동안 볼 수 있지만 다섯 번째 날에는 신호 강도보다 어두워 보입니다. eGFP 양성 유충을 약리학 적 치료를 위해 웰 당 10 마리 이하의 유충의 밀도로 페트리 접시 대신 여섯 웰 플레이트에 넣으십시오.절제 및 절제되지 않은 유충을위한 별도의 여섯 웰 플레이트를 지정하십시오. 필요한 15 마이크로몰 IWR-1 또는 부피 매칭된 DMSO 비히클 제어 전처리 및 그에 따라 원뿔형 튜브에 1.5X PTU의 분취량을 결정한다. IWR-1 스톡을 1.5X PTU에 첨가하여 15 마이크로몰 IWR-1의 최종 농도를 달성한다.일치하는 DMSO 스톡의 볼륨을 1.5X PTU에 추가합니다. 볼텍싱에 의해 잘 혼합하고 화합물의 용해를 육안으로 확인한다. 6 웰 플레이트의 eGFP 양성 유충에서 1.5X PTU를 제거하고 갓 만든 0.06 % DMSO 또는 15 마이크로 몰 IWR-1 처리의 웰 당 5 밀리리터를 추가하십시오.다음날 RPE를 폐지하십시오. 수정 후 5 일 동안 절제되지 않은 여섯 웰 플레이트와 PTU가없는 담체계 물 또는 원뿔형 튜브에 10 밀리몰 MTZ 용액의 적절한 부피를 분취량하는 데 필요한 약리학 적 및 비히클 제어 처리의 양을 결정하십시오. IWR-1 및 DMSO 스톡 솔루션을 이전에 수행한 각 원뿔형 튜브에 추가합니다.볼텍싱에 의해 잘 혼합하고 화합물의 용해를 육안으로 확인한다. 지정된 비절제 및 절제 6웰 플레이트에서 1.5X PTU로 0.06%DMSO 및 15마이크로몰 IWR-1 전처리를 제거한다. PTU 및 MTZ 용액 처리없이 적절한 담수 시스템으로 보충하십시오.정확히 24 시간 후에 10 밀리몰 MTZ 용액에서 0.06 % DMSO 및 15 마이크로 몰 IWR-1 처리를 제거하고 PTU가없는 담수 처리수에서 처리하여 보충하십시오. 0.06%DMSO 및 15 마이크로몰 IWR-1 처리를 절제되지 않은 6웰 플레이트에 PTU가 없는 담수에서 보충하십시오. 유전자 절제 후 유충 유지를 위해 스테레오 현미경에서 투과 광 조명을 사용하여 생체 내에서 절제의 성공과 정도를 모니터링합니다.피지를 사용하여 RPE 영역 또는 ROI를 생성하려면 여덟 비트 TIFF 이미지를 열고 이미지를 선택하여 등쪽이 위로 올라가고 원위가 남도록 이미지의 방향을 바꿉니다. 마지막 명령의 경우 해당 이미지에 필요한 방향성에 가장 적합한 옵션을 선택합니다. 분석, 도구, ROI 관리자를 선택하여 ROI 관리자를 시작하십시오.이미지, 확대/축소 및 DAPI와 브라이트필드 채널 간에 전환을 사용합니다. 효율성을 위해 바로 가기 키를 사용합니다. RPE의 정점 측면이 외부 제한 멤브레인의 팁에서 인접하는 지점을 식별하고 이 해부학적 랜드마크를 ROI 시작점으로 사용합니다.피지 도구 모음에서 다각형 선택 도구를 사용하여 DAPI 및 Brightfield 이미지 채널과 이미지 확대/축소 기능을 사용하여 RPE ROI를 생성하여 정점 및 기본 RPE 경계를 식별합니다. ROI의 등쪽 및 복부 끝을 무뚝뚝 거리거나 반올림하는 대신 날카로운 지점으로 가져 오십시오. ROI 관리자에서 추가를 클릭하여 ROI를 추가합니다.더 많은 것을 선택하여 ROI 파일을 저장하고 ROI 관리자 내에 저장하십시오. rpegen을 두 번 클릭하십시오. m 파일을 편집기 창에서 엽니다.rpegen의 사용자 정의 변수 섹션 아래에서. m 파일, roi 파일, tiff 이미지 파일 및 출력 파일을 저장해야하는 폴더의 디렉토리 위치를 입력하십시오. 내보낼 매트 파일의 그룹 이름과 TIFF 이미지 스택에서 Brightfield 채널의 위치를 입력합니다.MATLAB의 맨 위에 있는 편집기 메뉴에서 실행 단추를 클릭하여 스크립트를 실행합니다. MAT 파일을 저장하면 세 개의 패널 그림이 나타나고 각 이미지 실행에 대한 출력 디렉토리에 PDF로 저장됩니다. 이러한 품질 관리 PDF가 출력 폴더에 저장되고 마지막 그림이 사라질 때까지 기다리십시오.개별 PDF를 열고 모든 ROI가 브라이트필드 이미지와 일치하는지 확인합니다. rpegen_permplot을 두 번 클릭합니다. m 파일을 새 편집기 탭에서 엽니다.단일 사용자 정의 변수 섹션 아래에 rpegen을 실행할 MAT 파일이 들어 있는 출력 폴더의 디렉토리 위치를 입력합니다. m 스크립트. 로드할 각 MAT 파일 이름을 입력합니다.편집기 메뉴에서 실행 섹션 단추를 클릭하여 스크립트의 이 섹션을 실행합니다. 두 번째 섹션에서는 데이터 A 및 데이터 B 변수에 통계 비교를 위해 두 그룹의 이름을 입력하고 reps 변수의 순열 시뮬레이션 반복 횟수를 지정합니다. 이 데모에는 처리 시간을 줄이기 위해 2, 000 reps 만 사용되었습니다.편집기 메뉴에서 실행 섹션 단추를 클릭하여 스크립트의 이 섹션을 실행합니다. 히트 맵 그림 및 그룹 결과 및 P-값 섹션을 실행 섹션 단추를 사용하여 독립적으로 실행합니다. 수정 후 5 일 유충의 전체 마운트 손상은 유전자 절제에 대한 스크리닝 당시 RPE에서 밝은 전이유전자 발현을 보였다.수정후 6일간 절제되지 않은 유충의 횡단 냉동절은 전이유전자 발현이 RPE의 중심 2/3에 국한된 가장 밝은 발현을 갖는 성숙한 RPE 세포로 제한됨을 보여주었다. 화살촉은 정점 미세 융모를 나타냅니다. 손상 후 하루 동안 절제된 유충의 횡단 냉동 절제술은 eGFP 양성 세포 형태학의 파괴를 드러냈다.화살표는 pyknotic 핵을 나타냅니다. 절제되지 않은 칠일 후 수정 후 유충의 전체 마운트 손상은 눈 전체에 RPE 색소 침착을 나타냈고, 완화된 이틀 후 부상 후 유충은 중앙 RPE에 색소가 없는 절제 구역을 나타냈다. RpEGEN을 사용하여 생성된 플롯은 RPE의 길이에 걸쳐 절제되지 않은 9일 후 수정 후 DMSO와 IWR-1 그룹 사이의 유사성을 보여주었다.플롯은 완화된 나흘간의 손상 후 DMSO 및 IWR-1 그룹에서 전체적으로 더 가벼운 픽셀 강도를 나타냈으며, 이는 다른 치료 그룹과 비교했을 때 절제된 IWR-1에서 가장 가벼워 보였다. 중앙 RPE 색소침착의 차이는 절제된 IWR-1 처리된 유충을 절제된 DMSO 처리된 대조군과 비교할 때 유의하였다. 이 제브라피쉬 절제 패러다임을 사용하여, 우리는 RPE 재생의 중요한 조절자인 바람 신호와 같은 몇 가지 분자 신호 전달 경로를 확인할 수 있었습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

뉴트의 렌즈 재생을 공부 Culturing 이리스 안료 상피 세포에 대한 시스템

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

연구

생물학

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Zebrafish의 Pronephros의 레이저 절제는 신장 상피 조직이 재생된를 공부

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

조직 학적 및 기능적 특성 : Methylnitrosourea (MNU)는 망막 변성과 재생 제브라 피쉬에서 유도 된

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

마우스 망막 안료 상피에서 1 차 셀 문화

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

조직학적 분석을 위해 인간의 눈에서 망막 색소 상피/맥락막 플랫마운트의 효율적이고 일관된 생성

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Caudal Peduncle Cryoinjury in Adult Zebrafish

A Cryoinjury Model for Studying Skeletal Muscle Regeneration of the Caudal Peduncle in Adult Zebrafish

A Cryoinjury Model for Studying Skeletal Muscle Regeneration of the Caudal Peduncle in Adult Zebrafish (Video) | JoVE 

성인 제브라피쉬에서 꼬리 꽃자루의 골격근 재생을 연구하기 위한 냉동 손상 모델

Skeletal muscle undergoes renewal and restoration after minor injury through the activation of satellite-like stem cells. Severe injuries of the ...

Modeling and Analyzing Retinal Degeneration

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

Unraveling the Pathogenesis of Age-Related Macular Degeneration and Discovering Potential Therapies (Video) | JoVE

LipidUNet-iPSC 유래 망막 색소 상피를 이용한 지질 침전물의 특성화 및 정량화의 기계 학습 기반 방법

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to ...

Staining of Sub-Retinal Pigment Epithelium (RPE) Deposits

Staining of Sub-Retinal Pigment Epithelium (RPE) Deposits (Video) | JoVE 

망막하 색소 상피(RPE) 침전물의 염색