Name: nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium
Uploaded: 2022-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Arbeidet som er beskrevet her, ble støttet av National Institutes of Health (RO1-EY29410 til J.M.G, og NIH CORE Grant P30-EY08098 til Institutt for oftalmologi); UPMC immuntransplantasjons- og terapisenter (til L.L.L. og J.M.G.); og E. Ronald Salvitti-stolen i oftalmologiforskning (til J.M.G.). Ytterligere støtte ble mottatt fra Wiegand Fellowship i Oftalmologi (til L.L.L), Eye &Ear Foundation of Pittsburgh, og et ubegrenset stipend fra Research to Prevent Blindness, New York, NY. Forfattere ønsker også å takke Amanda Platt for teknisk assistanse og Dr. Hugh Hammer og vannpersonalet for utmerket dyrepleiestøtte.

Alle metoder som er skissert her, er i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Pittsburgh.
1. Tilberedning før sebrafisk embryosamling
<ol><li>Sett embryoinkubatoren til 28,5 °C.</li>
	<li>Forbered en 25x lagerløsning av melanogenesehemmeren, N-fenylthiourea (PTU)21,22. Denne lagerløsningen er skalert fra en vanlig oppskrift22 og 1x er lik...

Denne protokollen beskriver metodikk for å genetisk fyre opp RPE og studiemekanismer for degenerasjon og regenerering i larve-alderen sebrafisk. Denne protokollen har også blitt utført i voksen sebrafisk3, men med mindre omfattende karakterisering, og derfor er larver fokus her. Kritiske aspekter ved denne delen av protokollen (trinn 1-4) inkluderer: 1) legge 1,5x PTU til embryoer før utbruddet av melanogenese, 2) dechorionating PTU-behandlede embryoer på 2-3 dpf, 3) forsiktig screening for e...

Metodikken beskrevet heri beskriver en protokoll for genetisk å fyre opp retinal pigment epitel (RPE) ved hjelp av larval sebrafisk. RPE strekker seg over baksiden av øyet og ligger mellom de stratifiserte lagene i nevral netthinnen og laget av vaskulatur som utgjør koroiden. Trofisk støtte, absorpsjon av fototoksisk lys og vedlikehold av visuelle syklusproteiner er bare noen av de kritiske funksjonene RPE utfører som er avgjørende for å opprettholde helsen og integriteten til disse tilstøtende vevene1. Skade på pattedyr RPE er reparerbar når lesjoner er små2; Imidlertid er skade forårsaket av større skader eller progressiv degenerativ sykdom irreversibel. Hos mennesker fører RPE degenerative sykdommer (f.eks. aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) og Stargardt sykdom) til permanent synstap og, med få behandlingsalternativer tilgjengelig, redusert pasientkvalitet på livet. Den begrensede evnen for pattedyr RPE til selvreparasjon har skapt et kunnskapsgap innen RPE regenerative prosesser. Gitt den robuste regenerative kapasiteten til sebrafisken på tvers av mange forskjellige vevstyper, ble denne protokollen utviklet for å etablere et in vivo vertebratsystem for å lette studier på iboende regenerering av RPE og avdekke mekanismer som driver den responsen. Ved hjelp av ablasjonsparadigmet som er skissert her, har den kanoniske Wnt-signalveien3, mTOR-bane4 og immunrelaterte responser5 blitt identifisert som kritiske formidlere av RPE-regenerering, sannsynligvis med overlappende funksjoner.
I dette genetiske ablasjonsparadigmet uttrykker Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 sebrafisk det bakterieavledede nitroreductase (NTR/nfsB) gen6 smeltet sammen til eGFP under kontroll av RPE-forsterkerelementet, rpe65a7. Ablasjon oppnås ved å legge til prodrug, metronidazol (MTZ), til systemvannhus sebrafisk. Intracellulær aktivering av MTZ ved nitroreductase resulterer i DNA-krysskobling og apoptose i NTR/nfsB-uttrykkende celler 8,9. Denne teknologien har blitt mye brukt i sebrafisk for å fyre opp celler i netthinnen 10,11,12,13 og andre vev 8. Sammen muliggjør disse elementene målrettet uttrykk (rpe65a) av en induserbar celleablasjonsmetodikk (NTR/MTZ)8,9 og en fluorescerende markør (eGFP) for visualisering.
Andre interessante in vivo-modeller eksisterer også som kan brukes til å studere det regenerative potensialet til RPE14. Disse er brede og inkluderer RPE-til-netthinne transdifferentiation post-retinectomy i amfibier, der RPE celler tapt til retinal gjenvekst erstattes 15,16; RPE restaurering etter skade i "super healing" MRL / MpJ mus17; og eksogen stimulering av RPE-spredning i en rottemodell av spontan RPE og retinal degenerasjon18, blant andre. In vitro-modeller, som voksne humane RPE stamceller (RPESCs)19, er også utviklet. Disse modellene er alle verdifulle verktøy som arbeider for å avdekke cellulære prosesser relatert til RPE-regenerering (f.eks. spredning, differensiering, etc.); Sebrafisken er imidlertid unik i sin kapasitet for egen RPE-reparasjon etter ablasjon.
Mens metodikken her er skrevet for å fokusere på å forstå mekanismene som driver RPE-regenerering, kan Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)- linjen og denne genetiske ablasjonsprotokollen brukes til å studere andre cellulære prosesser som RPE-apoptose, RPE-degenerasjon og effekten av RPE-skade på tilstøtende retinal og vaskulært vev. Ablasjonsprotokollen kan også endres for å inkludere farmakologisk manipulasjon, som er en praktisk foreløpig strategi for å screene signalveier av interesse. For eksempel har blokkering av den kanoniske Wnt-banen ved hjelp av Inhibitor of Wnt Response-1 (IWR-1)20 vist seg å svekke RPE-regenerering3. Dette ble gjentatt her for å veilede brukere gjennom et farmakologisk manipulasjonseksperiment og tjene som konseptgodkjenning for å validere et MATLAB-skript (RpEGEN) opprettet for å kvantifisere RPE-regenerering basert på utvinning av pigmentering. I likhet med den transgene linjen og ablasjonsprotokollen, kan RpEGEN-skriptene tilpasses og kan brukes til å kvantifisere andre markører / cellulære prosesser i RPE.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lab Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>Catalog number is for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond tip scribing pen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-254-51</td>
			<td>Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) &#8805;99.7 %</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (large)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3720A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (mini/tabletop)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td>Or similar, with 488 nm excitation laser/filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-4</td>
			<td>Manufactured by Corning, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5.04462</td>
			<td>Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue (powder)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP117-100</td>
			<td>Also available as a premade aqeuous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole (MTZ)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3761</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td>Chemical waste, proper disposal required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (powder packets)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Used to make 10 X PBS stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PRON-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>H2010</td>
			<td>Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Or similar, with transmitted light illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Fine-tipped forceps for manual dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop rotator/shaker</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z135003</td>
			<td>3.2 mL bulb draw, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS1, TRS2, TRS5</td>
			<td>Also available from Fisher Scientific (NC0342409)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td>Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRAMM examples and how-tos</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB support</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/support.html</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium

Retinal pigment epitel (RPE) ligger på baksiden av øyet og utfører funksjoner som er avgjørende for å opprettholde helsen og integriteten til tilstøtende retinal og vaskulært vev. For tiden har den begrensede reparative kapasiteten til pattedyr RPE, som er begrenset til små skader, hindret fremgang i å forstå in vivo RPE regenerative prosesser. Her er det gitt en detaljert metodikk for å lette studiet av in vivo RPE-reparasjon ved hjelp av sebrafisken, en virveldyrmodell som er i stand til robust vevregenerering. Denne protokollen beskriver en transgen nitroreductase/metronidazol (NTR/MTZ)-mediert skadeparadigme (rpe65a:nfsB-eGFP), som resulterer i ablasjon av de sentrale to tredjedeler av RPE etter 24 timers behandling med MTZ, med påfølgende vevsgjenvinning. Fokus er plassert på RPE-ablasjoner i larval sebrafisk og metoder for å teste effekten av farmakologiske forbindelser på RPE-regenerering er også skissert. Generering og validering av RpEGEN, et MATLAB-skript opprettet for å automatisere kvantifisering av RPE-regenerering basert på pigmentering, diskuteres også. Utover aktive RPE-reparasjonsmekanismer kan denne protokollen utvides til studier av RPE-degenerasjon og skaderesponser, samt effekten av RPE-skade på tilstøtende netthinne- og vaskulært vev, blant andre cellulære og molekylære prosesser. Dette sebrafisksystemet har et betydelig løfte om å identifisere gener, nettverk og prosesser som driver RPE-regenerering og RPE sykdomsrelaterte mekanismer, med det langsiktige målet om å anvende denne kunnskapen på pattedyrsystemer og til slutt mot terapeutisk utvikling.

Hemming av den kanoniske Wnt-signalveien er kjent for å betydelig svekke sebrafisk RPE-regenerering ved hjelp av det genetiske ablasjonsparadigmet (rpe65a:nfsB-eGFP) og farmakologisk manipulasjonsmetodikk (IWR-1) beskrevet i protokollen3. Dette eksperimentet ble gjentatt her for å validere en automatisert metode for kvantifisering av sebrafisk RPE-regenerering basert på pigmentering. Resultatene oppsummert nedenfor omfattet alle trinnene i protokollen, fra befruktningsdagen (0 dpf) til...

Watch this Scientific Journal Video about Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

Denne protokollen beskriver metodikken for å genetisk fyre opp retinal pigment epitel (RPE) ved hjelp av en transgen sebrafiskmodell. Tilpasning av protokollen for å inkorporere signalveimodulering ved hjelp av farmakologiske forbindelser er omfattende detaljert. En MATLAB-plattform for kvantifisering av RPE-regenerering basert på pigmentering ble utviklet og presentert og diskutert.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediert ablasjon og en MATLAB-plattform (RpEGEN) for å studere regenerering av Sebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Sebrafisken er unik i sin egen evne til å regenerere mange forskjellige vevstyper, inkludert RPE. Denne protokollen kan brukes til å identifisere molekylære veier som driver RPE-regenerering og RPE sykdomsrelaterte mekanismer. Allsidighet er en primær fordel med denne metodikken.I tillegg til å studere RPE-regenerering, kan denne protokollen brukes til å undersøke RPE degenerative prosesser og effekten av RPE-skade på tilstøtende vev i øyet. Pattedyr, inkludert mennesker, er ikke i stand til å reparere store RPE-skader som følge av traumer eller degenerativ sykdom. Å bruke sebrafisk som et verktøy for å oppdage RPE pro-regenerative faktorer er et betydelig skritt mot å fremme pattedyr RPE regenerering.For å forberede en frisk 10 millimolar MTZ-løsning, fem dager etter befruktning, tilsett MTZ-pulver til systemvann uten PTU og bland grundig ved kraftig risting i en time ved 37 grader Celsius. Avkjøl 10 millimolar MTZ-oppløsning i en time ved romtemperatur på en bordplaterotator eller shaker. For å screene sebrafisk larver fra rpe65a:nsfB-eGFP transgene, skille transgene eGFP positive larver fra ikke-transgene eGFP negative larver ved hjelp av et fluorescerende stereomikroskop med en 488 nanometer eksitasjonslaser.Våkn opp skjermede larver umiddelbart ved å pipetter direkte inn i en Petri-tallerken med frisk 1,5X PTU uten trikain. Etter ferdigstillelse av screening, separat eGFP positive larver ytterligere i to grupper av Petri retter, en gruppe for å motta MTZ behandling og en gruppe for å være unablated kontroll. Deretter fyrer du av retinal pigmentepitelet ved å fjerne 1,5X PTU fra de ablerte behandlingsrettene og tilsett den nylagde 10 millimolar MTZ-løsningen.Fjern også 1,5X PTU fra de uavsatte kontrollrettene og tilsett ferskvann uten PTU. Fjern den 10 millimolar MTZ-løsningen etter nøyaktig 24 timer og tilsett ferskvann uten PTU. Bytt ferskvann uten PTU på MTZ negative retter.Screen eGFP positive larver på fire dager etter befruktning. eGFP er synlig fire dager etter befruktning, men fremstår som svakere enn signalintensiteten på den femte dagen. Plasser eGFP positive larver i seks-brønns plater i stedet for Petri retter med en tetthet på ikke mer enn 10 larver per brønn for farmakologisk behandling.Angi separate seks-brønns plater for ablated og unablated larver. Bestem volumet på 15 mikromolar IWR-1 eller volumtilpassede DMSO-kjøretøykontrollforbehandlinger som trengs og aliquot 1,5X PTU i koniske rør tilsvarende. Legg IWR-1 lager til 1,5X PTU for en endelig konsentrasjon på 15 mikromolar IWR-1.Legg til et samsvarende volum DMSO-lager i 1,5X PTU. Bland godt ved å virvelere og visuelt bekrefte oppløsningen av forbindelser. Fjern 1,5X PTU fra eGFP positive larver i seks-brønns plater og tilsett fem milliliter per brønn med nylagde 0,06% DMSO eller 15 mikromolar IWR-1 behandlinger.Ablate RPE neste dag. På fem dager etter befruktning, bestemme volumet av farmakologiske og kjøretøy kontroll behandlinger som trengs for både unablated og ablated seks-brønns plater og aliquot passende volumer av enten ferskvann uten PTU eller 10 millimolar MTZ løsning i koniske rør. Legg til IWR-1- og DMSO-lagerløsninger i respektive koniske rør som utført tidligere.Bland godt ved å virvelere og visuelt bekrefte oppløsningen av forbindelser. Fjern 0,06% DMSO og 15 mikromolar IWR-1 pre-behandlinger i 1,5X PTU fra utpekte unablated og ablated seks-brønns plater. Fyll på med riktig ferskvann uten PTU- og MTZ-løsningsbehandlinger.Fjern 0,06% DMSO og 15 mikromolar IWR-1 behandlinger i 10 millimolar MTZ-løsning etter nøyaktig 24 timer og fyll på med behandlinger i ferskvann uten PTU. Fyll på 0,06% DMSO og 15 mikromolar IWR-1 behandlinger i ferskvann uten PTU på den uavløste seksbrønnsplaten. Overvåk suksessen og omfanget av ablasjon in vivo ved hjelp av overført lysbelysning på et stereomikroskop for larvvedlikehold etter genetisk ablasjon.Hvis du vil generere RPE-området av interesse eller avkastning ved hjelp av Fiji, åpner du et åtte-biters TIFF-bilde, omorganiserer bildet slik at dorsalsiden er oppe og distal er igjen ved å velge bilde, transformere og vende vannrett. For den siste kommandoen velger du alternativet som passer best til retningen som trengs for bildet. Start ROI-lederen ved å velge analyse, verktøy, avkastningssjef.Bruk bilde, zoom og veksle mellom DAPI- og Brightfield-kanalene. Bruk hurtigtaster for effektivitet. Identifiser punktet der den apikale siden av RPE ligger ved siden av spissen av den ytre begrensende membranen, og bruk dette anatomiske landemerket som roi-utgangspunkt.Opprett RPE ROI med verktøyet for mangekantvalg på Fiji-verktøylinjen ved hjelp av både DAPI- og Brightfield-bildekanalene og bildezoomfunksjonen for å identifisere apikale og basale RPE-grenser. Få de dorsale og ventrale endene av avkastningen til et skarpt punkt i stedet for å stumpe eller avrunde. Legg til avkastningen ved å klikke på legg til i ROI-lederen.Lagre ROI-filen ved å velge mer og lagre i ROI-behandling. Dobbeltklikk på rpegen. m fil som skal åpnes i redigeringsruten.Under den brukerdefinerte variabeldelen av rpegen. m angir du mappeplasseringene for mapper som inneholder roi-filene, TIFF-bildefilene og hvor utdatafiler skal lagres. Angi gruppenavnet for matfilen som skal eksporteres, og plasseringen av Brightfield-kanalen i TIFF-bildestakken.Kjør skriptet ved å klikke på kjør-knappen i redigeringsmenyen øverst på MATLAB. Etter at du har lagret MAT-filen, vises en trepanelfigur og lagres også som en PDF-fil i utdatakatalogen for hver bildekjøring. Vent til disse PDF-filene for kvalitetskontroll er lagret i utdatamappen, og den siste figuren er forsvunnet.Åpne de enkelte PDF-filene, og kontroller at alle ROIer samsvarer med Brightfield-bildene. Dobbeltklikk på rpegen_permplot. m fil som skal åpnes i en ny redigeringsfane.Under seksjon enbrukerdefinerte variabler angir du mappeplasseringen for utdatamappen som inneholder MAT-filene, fra rpegen. m skript. Skriv inn hvert MAT-filnavn som skal lastes inn.Kjør denne delen av skriptet ved å klikke på kjør-delen-knappen i redigeringsmenyen. I del to skriver du inn navnene på de to gruppene for en statistisk sammenligning i data A- og data B-variablene og angir antall repetisjoner for permutasjonssimulering i repetisjonsvariabelen. Bare 2000 reps ble brukt til denne demoen for å redusere behandlingstiden.Kjør denne delen av skriptet ved å klikke på kjør-delen-knappen i redigeringsmenyen. Kjør varmekartfigur og grupperesultater og P-verdiseksjoner uavhengig av hverandre ved hjelp av run section-knappen. Hele monteringsskader av en fem-dagers post-befruktningslarve viste lyse transgene uttrykk i RPE på tidspunktet for screening for genetisk ablasjon.Tverrgående kryoseksjon av unablated seks-dagers post-befruktning larve viste transgene uttrykk var begrenset til modne RPE celler med det lyseste uttrykket begrenset til den sentrale 2/3 av RPE. Pilspisser indikerer apikale mikrovilli. Tverrgående kryoseksjon av en ablated en-dags etterskade larve avslørte forstyrrelse av eGFP positiv cellemorfologi.Piler indikerer pyknotiske kjerner. Hele monteringsskader av unablated syv-dagers post-befruktning larver viste RPE pigmentering gjennom hele øyet og ablated to-dagers post-skade larver viste en ablasjon sone fraværende pigment i den sentrale RPE. Et plott generert ved hjelp av RpEGEN viste likhet mellom de uavhentede ni-dagers postbefruktningsgruppene DMSO og IWR-1 på tvers av lengden på RPE.Plottet viste generelt lettere pikselintensitet i de ablerte fire-dagers DMSO- og IWR-1-gruppene etter skade, som virket letteste i den ablerte IWR-1 sammenlignet med en hvilken som helst annen behandlingsgruppe. Forskjeller i sentral RPE-pigmentering var signifikante når man sammenlignet ablated IWR-1-behandlede larver med ablated DMSO-behandlede kontroller. Ved hjelp av dette sebrafiskens ablasjonsparadigme har vi vært i stand til å identifisere flere molekylære signalveier, for eksempel vindsignalering som vi har vist her, som er kritiske regulatorer for RPE-regenerering.

Research

JoVE Journal

Biology

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MikroRNA uttrykk profiler av menneskelige iPS celler, retinal pigment epitelet avledet fra iPS, og Fetal Netthinne Pigment Epitel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea (MNU) -indusert Retinal degenerasjon og regenerasjon i Sebrafisk: histologiske og funksjonelle egenskaper

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primært cellekulturer fra musen netthinnens Pigment epitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Isolering av primære retinale retinale pigmenterte epitelceller

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Effektiv og konsistent generering av retinal pigmentepitel / choroid flatmounts fra Human Eyes for histologisk analyse

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...