Name: nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium
Uploaded: 2022-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

El trabajo descrito en este documento fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (RO1-EY29410 a J.M.G, y NIH CORE Grant P30-EY08098 al Departamento de Oftalmología); el UpMC Immune Transplant & Therapy Center (a L.L.L. y J.M.G.); y la Cátedra E. Ronald Salvitti en Investigación en Oftalmología (a J.M.G.). Se recibió apoyo adicional de la Beca Wiegand en Oftalmología (a L.L.L), la Fundación Eye & Ear de Pittsburgh, y una subvención sin restricciones de Research to Prevent Blindness, Nueva York, NY. Los autores también desean agradecer a Amanda Platt por la asistencia técnica y al Dr. Hugh Hammer y al personal acuático por su excelente apoyo para el cuidado de los animales.

Todas las metodologías descritas en este documento cumplen con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Pittsburgh.
1. Preparación previa a la recogida de embriones de pez cebra
<ol><li>Ajuste la incubadora de embriones a 28,5 °C.</li>
	<li>Preparar una solución madre 25x del inhibidor de la melanogénesis, N-feniltiorea (PTU)21,22. Esta solución madre se escala...

Este protocolo describe la metodología para extirpar genéticamente el EPR y estudiar los mecanismos de degeneración y regeneración en peces cebra de edad larvaria. Este protocolo también se ha realizado con éxito en peces cebraadultos 3 pero con una caracterización menos extensa, por lo que las larvas son el foco aquí. Los aspectos críticos de esta parte del protocolo (pasos 1-4) incluyen: 1) agregar 1.5x PTU a los embriones antes del inicio de la melanogénesis, 2) descoorizar embriones ...

La metodología descrita aquí detalla un protocolo para extirpar genéticamente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) utilizando larvas de pez cebra. El EPR se extiende sobre la parte posterior del ojo y reside entre las capas estratificadas de la retina neural y la capa de vasculatura que constituye la coroides. El soporte trófico, la absorción de luz fototóxica y el mantenimiento de las proteínas del ciclo visual son solo algunas de las funciones críticas que realiza el EPR que son esenciales para mantener la salud y la integridad de estos tejidos adyacentes1. El daño al EPR de mamíferos es reparable cuando las lesiones son pequeñas2; sin embargo, el daño sufrido por lesiones más grandes o enfermedad degenerativa progresiva es irreversible. En los seres humanos, las enfermedades degenerativas de EPR (por ejemplo, la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) y la enfermedad de Stargardt) conducen a la pérdida permanente de la visión y, con pocas opciones de tratamiento disponibles, disminuyen la calidad de vida del paciente. La capacidad limitada del EPR de mamíferos para autorrepararse ha creado una brecha de conocimiento en el campo de los procesos regenerativos del EPR. Dada la robusta capacidad regenerativa del pez cebra en muchos tipos de tejidos diferentes, este protocolo se desarrolló para establecer un sistema de vertebrados in vivo para facilitar los estudios sobre el EPR intrínsecamente regenerador y descubrir mecanismos que impulsan esa respuesta. Utilizando el paradigma de ablación descrito aquí, la vía de señalización canónica Wnt3, la vía mTOR4 y las respuestas relacionadas con el sistema inmunológico5 se han identificado como mediadores críticos de la regeneración de RPE, probablemente con funciones superpuestas.
En este paradigma de ablación genética, el pez cebra Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 expresa el gen6 de la nitrorreductasa derivada de bacterias (NTR/nfsB) fusionado con eGFP bajo control del elemento potenciador de RPE, rpe65a7. La ablación se logra agregando el profármaco, metronidazol (MTZ), al sistema de agua que alberga el pez cebra. La activación intracelular de MTZ por nitrorreductasa da como resultado la reticulación del ADN y la apoptosis en células que expresan NTR/nfsB 8,9. Esta tecnología ha sido ampliamente utilizada en el pez cebra para extirpar células de la retina 10,11,12,13 y otros tejidos 8. Juntos, estos elementos permiten la expresión dirigida (rpe65a) de una metodología de ablación celular inducible (NTR/MTZ)8,9 y un marcador fluorescente (eGFP) para la visualización.
También existen otros modelos in vivo interesantes que se pueden utilizar para estudiar el potencial regenerativo del RPE14. Estos son amplios e incluyen la transdiferenciación de EPR a retina después de la retinectomía en anfibios, en la que las células de EPR perdidas por el recrecimiento retiniano se reemplazan15,16; Restauración de RPE post-lesión en el ratón MRL/MpJ "súper curativo"17; y estimulación exógena de la proliferación de EPR en un modelo de rata de EPR espontáneo y degeneración retiniana18, entre otros. También se han desarrollado modelos in vitro, como las células madre de EPR humanas adultas (RPESCs)19. Todos estos modelos son herramientas valiosas que trabajan para descubrir los procesos celulares relacionados con la regeneración de RPE (por ejemplo, proliferación, diferenciación, etc.); sin embargo, el pez cebra es único en su capacidad para la reparación intrínseca de RPE después de la ablación.
Si bien la metodología aquí está escrita para centrarse en la comprensión de los mecanismos que impulsan la regeneración de RPE, la línea Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) y este protocolo de ablación genética podrían utilizarse para estudiar otros procesos celulares como la apoptosis de RPE, la degeneración de RPE y el efecto de la lesión de RPE en los tejidos retinianos y vasculares adyacentes. El protocolo de ablación también se puede modificar para incluir la manipulación farmacológica, que es una estrategia preliminar conveniente para detectar vías de señalización de interés. Por ejemplo, se ha demostrado que el bloqueo de la vía Wnt canónica mediante el Inhibidor de la Respuesta Wnt-1 (IWR-1)20 perjudica la regeneracióndel EPR 3. Esto se repitió aquí para guiar a los usuarios a través de un experimento de manipulación farmacológica y servir como prueba de concepto para validar un script de MATLAB (RpEGEN) creado para cuantificar la regeneración de RPE basada en la recuperación de la pigmentación. Al igual que la línea transgénica y el protocolo de ablación, los scripts RpEGEN son adaptables y podrían usarse para cuantificar otros marcadores / procesos celulares dentro del RPE.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lab Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>Catalog number is for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond tip scribing pen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-254-51</td>
			<td>Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) &#8805;99.7 %</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (large)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3720A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (mini/tabletop)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td>Or similar, with 488 nm excitation laser/filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-4</td>
			<td>Manufactured by Corning, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5.04462</td>
			<td>Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue (powder)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP117-100</td>
			<td>Also available as a premade aqeuous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole (MTZ)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3761</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td>Chemical waste, proper disposal required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (powder packets)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Used to make 10 X PBS stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PRON-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>H2010</td>
			<td>Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Or similar, with transmitted light illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Fine-tipped forceps for manual dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop rotator/shaker</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z135003</td>
			<td>3.2 mL bulb draw, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS1, TRS2, TRS5</td>
			<td>Also available from Fisher Scientific (NC0342409)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td>Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRAMM examples and how-tos</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB support</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/support.html</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) reside en la parte posterior del ojo y realiza funciones esenciales para mantener la salud y la integridad de los tejidos retinianos y vasculares adyacentes. En la actualidad, la limitada capacidad reparadora de la EPR de mamíferos, que se limita a pequeñas lesiones, ha obstaculizado el progreso hacia la comprensión de los procesos regenerativos de EPR in vivo . Aquí, se proporciona una metodología detallada para facilitar el estudio de la reparación in vivo de RPE utilizando el pez cebra, un modelo de vertebrados capaz de regeneración de tejidos robustos. Este protocolo describe un paradigma de lesión mediada por nitrorreductasa/metronidazol transgénico (NTR/MTZ) (rpe65a:nfsB-eGFP), que da como resultado la ablación de los dos tercios centrales del EPR después de 24 h de tratamiento con MTZ, con posterior recuperación tisular. Se hace hincapié en las ablaciones de EPR en larvas de pez cebra y también se describen los métodos para probar los efectos de los compuestos farmacológicos en la regeneración de EPR. También se discute la generación y validación de RpEGEN, un script de MATLAB creado para automatizar la cuantificación de la regeneración de RPE basada en la pigmentación. Más allá de los mecanismos activos de reparación del EPR, este protocolo se puede ampliar a estudios de la degeneración del EPR y las respuestas a las lesiones, así como a los efectos del daño del EPR en los tejidos retinianos y vasculares adyacentes, entre otros procesos celulares y moleculares. Este sistema de pez cebra es muy prometedor en la identificación de genes, redes y procesos que impulsan la regeneración de RPE y los mecanismos relacionados con la enfermedad de RPE, con el objetivo a largo plazo de aplicar este conocimiento a los sistemas de mamíferos y, en última instancia, hacia el desarrollo terapéutico.

Se sabe que la inhibición de la vía canónica de señalización Wnt perjudica significativamente la regeneración del RPE del pez cebra utilizando el paradigma de ablación genética (rpe65a: nfsB-eGFP) y la metodología de manipulación farmacológica (IWR-1) descrita en el protocolo3. Este experimento se repitió aquí para validar un método automatizado para cuantificar la regeneración de RPE del pez cebra basada en la pigmentación. Los resultados resumidos a continuación abarcar...

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Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

Este protocolo describe la metodología para extirpar genéticamente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) utilizando un modelo de pez cebra transgénico. La adaptación del protocolo para incorporar la modulación de la vía de señalización utilizando compuestos farmacológicos es ampliamente detallada. Se desarrolló una plataforma de MATLAB para cuantificar la regeneración de RPE basada en la pigmentación, que se presenta y discute.

Ablación mediada por nitrorreductasa/metronidazol y una plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudiar la regeneración del epitelio pigmentario de la retina del pez cebra

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

El pez cebra es único en su capacidad intrínseca para regenerar muchos tipos de tejidos diferentes, incluido el EPR. Este protocolo se puede utilizar para identificar las vías moleculares que impulsan la regeneración de RPE y los mecanismos relacionados con la enfermedad de RPE. La versatilidad es una ventaja principal de esta metodología.Además de estudiar la regeneración de RPE, este protocolo se puede utilizar para examinar los procesos degenerativos de RPE y los efectos del daño de RPE en los tejidos adyacentes en el ojo. Los mamíferos, incluidos los humanos, no pueden reparar grandes lesiones por EPR como resultado de traumatismos o enfermedades degenerativas. El uso del pez cebra como herramienta para descubrir los factores pro-regenerativos del EPR es un paso significativo hacia la promoción de la regeneración del EPR en mamíferos.Para preparar una solución fresca de MTZ de 10 milimolares, cinco días después de la fertilización, agregue polvo de MTZ al agua del sistema sin PTU y mezcle bien agitando vigorosamente durante una hora a 37 grados centígrados. Enfríe la solución MTZ de 10 milimolares durante una hora a temperatura ambiente en un rotador o agitador de mesa. Para detectar larvas de pez cebra del transgén rpe65a:nsfB-eGFP, separe las larvas transgénicas eGFP positivas de las larvas negativas eGFP no transgénicas utilizando un microscopio estéreo fluorescente con un láser de excitación de 488 nanómetros.Wake criabilizó las larvas inmediatamente pipeteando directamente en una placa de Petri con PTU fresca de 1.5X sin tricaína. Al finalizar el cribado, separe aún más las larvas positivas de eGFP en dos grupos de placas de Petri, un grupo para recibir tratamiento MTZ y un grupo para ser el control no abierto. Luego abole el epitelio pigmentario de la retina eliminando 1.5X PTU de los platos de tratamiento ablacionados y agregue la solución MTZ de 10 milimolares recién hecha.También elimine 1.5X PTU de los platos de control no abiertos y agregue agua fresca del sistema sin PTU. Retire la solución MTZ de 10 milimolares después de exactamente 24 horas y agregue agua fresca del sistema sin PTU. Cambie el agua fresca del sistema sin PTU en los platos negativos MTZ.Criba larvas eGFP positivas en cuatro días después de la fertilización. La eGFP es visible cuatro días después de la fertilización, pero parece más tenue que la intensidad de la señal en el quinto día. Coloque las larvas positivas de eGFP en placas de seis pocillos en lugar de placas de Petri a una densidad de no más de 10 larvas por pozo para el tratamiento farmacológico.Designe placas separadas de seis pocillos para larvas ablacionadas y no ablacionadas. Determine el volumen de 15 micromolares IWR-1 o el volumen emparejado de los pretratamientos de control de vehículos DMSO necesarios y alícuota 1.5X PTU en tubos cónicos en consecuencia. Agregue el stock IWR-1 a 1.5X PTU para una concentración final de 15 micromolares IWR-1.Agregue un volumen coincidente de stock DMSO a 1.5X PTU. Mezclar bien por vórtice y confirmar visualmente la disolución de los compuestos. Retire 1.5X PTU de las larvas positivas de eGFP en placas de seis pocillos y agregue cinco mililitros por pocillo de tratamientos recién hechos con DMSO 0.06% o 15 micromolares IWR-1.Ablate el RPE al día siguiente. En cinco días después de la fertilización, determine el volumen de tratamientos farmacológicos y de control de vehículos necesarios para las placas de seis pocillos no ablacionadas y ablacionadas y alícuota los volúmenes apropiados de agua fresca del sistema sin PTU o solución de MTZ de 10 milimolares en tubos cónicos. Agregue soluciones de stock IWR-1 y DMSO a los tubos cónicos respectivos como se realizó anteriormente.Mezclar bien por vórtice y confirmar visualmente la disolución de los compuestos. Elimine los pretratamientos 0.06% DMSO y 15 micromolares IWR-1 en 1.5X PTU de placas designadas de seis pocillos no abraminadas y ablacionadas. Reponga con el agua fresca adecuada del sistema sin tratamientos de solución PTU y MTZ.Retire los tratamientos 0.06% DMSO y 15 micromolares IWR-1 en solución MTZ de 10 milimolares después de exactamente 24 horas y reponga con tratamientos en agua dulce del sistema sin PTU. Reponga 0.06% DMSO y 15 tratamientos micromolares IWR-1 en agua dulce del sistema sin PTU en la placa de seis pocillos no ablacionada. Monitoree el éxito y el alcance de la ablación in vivo utilizando la iluminación de luz transmitida en un microscopio estereoscópico para el mantenimiento larvario después de la ablación genética.Para generar la región RPE de interés o ROI utilizando Fiji, abra una imagen TIFF de ocho bits, reoriente la imagen para que el lado dorsal esté hacia arriba y el distal se deje eligiendo imagen, transforme y voltee horizontalmente. Para el último comando, elija la opción que mejor se adapte a la direccionalidad necesaria para esa imagen. Inicie el administrador de ROI eligiendo análisis, herramientas, administrador de ROI.Utilice la imagen, el zoom y alternar entre los canales DAPI y Brightfield. Utilice métodos abreviados de teclado para mayor eficiencia. Identifique el punto en el que el lado apical del RPE está adyacente desde la punta de la membrana limitante externa y utilice este punto de referencia anatómico como punto de partida del ROI.Cree el ROI de RPE con la herramienta de selección de polígonos en la barra de herramientas de Fiji utilizando los canales de imagen DAPI y Brightfield y la función de zoom de imagen para identificar los límites de RPE apicales y basales. Lleve los extremos dorsal y ventral del ROI a un punto agudo en lugar de embotar o redondear. Agregue el ROI haciendo clic en agregar en el administrador de ROI.Guarde el archivo roi eligiendo más y guarde dentro del administrador de ROI. Haga doble clic en el rpegen. m para abrir en el panel del editor.En la sección de variable definida por el usuario del rpegen. m, ingrese las ubicaciones del directorio para las carpetas que contienen los archivos roi, los archivos de imagen tiff y dónde se deben guardar los archivos de salida. Introduzca el nombre del grupo para el archivo mat que se va a exportar y la ubicación del canal Brightfield en la pila de imágenes TIFF.Ejecute el script haciendo clic en el botón Ejecutar en el menú del editor en la parte superior de MATLAB. Después de guardar el archivo MAT, aparecerá una figura de tres paneles y también se guardará como PDF en el directorio de salida para cada ejecución de imagen. Espere hasta que estos pdf de control de calidad se hayan guardado en la carpeta de salida y la última cifra haya desaparecido.Abra los pdf individuales y compruebe que todos los ROI coincidan con las imágenes de Brightfield. Haga doble clic en el rpegen_permplot. m para abrir en una nueva pestaña del editor.En la sección Variables definidas por un usuario, escriba la ubicación del directorio de la carpeta de salida que contiene los archivos MAT de la ejecución del rpegen. m script. Introduzca cada nombre de archivo MAT que se va a cargar.Ejecute esta sección del script haciendo clic en el botón ejecutar sección en el menú del editor. En la sección dos, introduzca los nombres de los dos grupos para una comparación estadística en las variables de datos A y B y designe el número de repeticiones de simulación de permutación en la variable reps. Solo se utilizaron 2,000 repeticiones para esta demostración para disminuir el tiempo de procesamiento.Ejecute esta sección del script haciendo clic en el botón ejecutar sección en el menú del editor. Ejecute la figura del mapa de calor y los resultados del grupo y las secciones de valor P de forma independiente utilizando el botón Ejecutar sección. El daño de montaje completo de una larva de cinco días después de la fertilización mostró una expresión transgénica brillante en el EPR en el momento de la detección de la ablación genética.La criosección transversal de larvas no pobladas de seis días después de la fertilización mostró que la expresión transgénica se restringió a células RPE maduras con la expresión más brillante confinada a los 2/3 centrales del EPR. Las puntas de flecha indican microvellosidades apicales. La criosección transversal de una larva ablacionada un día después de la lesión reveló una interrupción de la morfología celular positiva de eGFP.Las flechas indican núcleos picnóticos. Los daños de montaje entero de larvas post-fertilización de siete días no abraminadas mostraron pigmentación de EPR en todo el ojo y las larvas ablacionadas de dos días después de la lesión mostraron una zona de ablación ausente de pigmento en el EPR central. Una gráfica generada utilizando RpEGEN mostró similitud entre los grupos DMSO de nueve días post-fertilización no abiertos e IWR-1 a lo largo de la RPE.La gráfica mostró una intensidad general de píxeles más ligera en los grupos DMSO e IWR-1 de cuatro días después de la lesión ablacionados, que parecían más ligeros en el IWR-1 ablacionado en comparación con cualquier otro grupo de tratamiento. Las diferencias en la pigmentación central de RPE fueron significativas al comparar las larvas tratadas con IWR-1 ablacionadas con los controles tratados con DMSO ablacionados. Usando este paradigma de ablación del pez cebra, hemos podido identificar varias vías de señalización molecular, como la señalización del viento que hemos mostrado aquí, que son reguladores críticos de la regeneración de RPE.

Research

JoVE Journal

Biology

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Un sistema para el cultivo de células epiteliales del pigmento del iris para el Estudio de Regeneración del objetivo de Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Investigación

Biología

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

La ablación con láser de la pronefros pez cebra para el Estudio de la regeneración epitelial renal

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

Perfiles de expresión de microARN de las células iPS humanas, de la retina del epitelio pigmentario Derivado de Ips y Fetal epitelio pigmentario de la retina

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Metilnitrosourea (MNU) inducida por la Retina Degeneración y Regeneración en el pez cebra: características histológicas y funcionales

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Cultivos celulares primarios de células del epitelio pigmentario de la retina del ratón

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Aislamiento de células primarias del epitelio pigmentado de la retina del ratón

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Generación eficiente y consistente de epitelio pigmentario retiniano/cordoides de montaje plano a partir de ojos humanos para análisis histológico

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Caudal Peduncle Cryoinjury in Adult Zebrafish

A Cryoinjury Model for Studying Skeletal Muscle Regeneration of the Caudal Peduncle in Adult Zebrafish

A Cryoinjury Model for Studying Skeletal Muscle Regeneration of the Caudal Peduncle in Adult Zebrafish (Video) | JoVE 

Un modelo de criolesión para estudiar la regeneración del músculo esquelético del pedúnculo caudal en peces cebra adultos

Skeletal muscle undergoes renewal and restoration after minor injury through the activation of satellite-like stem cells. Severe injuries of the ...

Modeling and Analyzing Retinal Degeneration

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

Unraveling the Pathogenesis of Age-Related Macular Degeneration and Discovering Potential Therapies (Video) | JoVE

LipidUNet-Machine Learning Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to ...

Staining of Sub-Retinal Pigment Epithelium (RPE) Deposits

Staining of Sub-Retinal Pigment Epithelium (RPE) Deposits (Video) | JoVE 

Tinción de depósitos de epitelio pigmentario subretiniano (EPR)