Name: nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium
Uploaded: 2022-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Arbetet som beskrivs här stöddes av National Institutes of Health (RO1-EY29410 till J.M.G och NIH CORE Grant P30-EY08098 till Institutionen för oftalmologi); UPMC Immune Transplant & Therapy Center (till L.L.L. och J.M.G.); och E. Ronald Salvitti-professuren i oftalmologiforskning (till J.M.G.). Ytterligare stöd erhölls från Wiegand Fellowship in Ophthalmology (till L.L.L), Eye & Ear Foundation of Pittsburgh, och ett obegränsat bidrag från Research to Prevent Blindness, New York, NY. Författarna vill också tacka Amanda Platt för teknisk hjälp och Dr. Hugh Hammer och vattenpersonalen för utmärkt djurvårdsstöd.

Alla metoder som beskrivs här är förenliga med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Pittsburgh.
1. Beredning före insamling av zebrafiskembryo
<ol><li>Ställ in embryoinkubatorn på 28,5 °C.</li>
	<li>Bereda en 25x stamlösning av melanogeneshämmaren, N-fenylthiourea (PTU)21,22. Denna stamlösning skalas från ett vanligt recept22 och 1x är lika...

Detta protokoll beskriver metodik för att genetiskt ablatera RPE och studera mekanismer för degenerering och regenerering hos larvåldrade zebrafiskar. Detta protokoll har också framgångsrikt utförts hos vuxnazebrafiskar 3 men med mindre omfattande karakterisering, varför larver är i fokus här. Kritiska aspekter av denna del av protokollet (steg 1-4) inkluderar: 1) tillsats av 1,5x PTU till embryon före melanogenesens början, 2) dechorionating PTU-behandlade embryon på 2-3 dpf, 3) noggr...

Metoden som beskrivs här beskriver ett protokoll för att genetiskt ablate retinal pigmentepitel (RPE) med hjälp av larvzebrafisk. RPE sträcker sig över ögats baksida och ligger mellan de stratifierade skikten i den neurala näthinnan och skiktet av vaskulatur som utgör koroiden. Trofiskt stöd, absorption av fototoxiskt ljus och underhåll av visuella cykelproteiner är bara några av de kritiska funktioner som RPE utför som är väsentliga för att upprätthålla hälsan och integriteten hos dessa intilliggande vävnader1. Skador på däggdjurs RPE kan repareras när lesionerna är små2; Skador som drabbas av större skador eller progressiv degenerativ sjukdom är dock irreversibla. Hos människor leder RPE-degenerativa sjukdomar (t.ex. åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) och Stargardts sjukdom) till permanent synförlust och, med få behandlingsalternativ tillgängliga, minskad patientlivskvalitet. Den begränsade förmågan för däggdjurs RPE att självreparera har skapat en kunskapslucka inom RPE-regenerativa processer. Med tanke på zebrafiskens robusta regenerativa kapacitet över många olika vävnadstyper utvecklades detta protokoll för att upprätta ett in vivo ryggradsdjurssystem för att underlätta studier om inneboende regenererande RPE och avslöja mekanismer som driver det svaret. Med hjälp av ablationsparadigmet som beskrivs här har den kanoniska Wnt-signalvägen3, mTOR-vägen4 och immunrelaterade svar5 identifierats som kritiska mediatorer för RPE-regenerering, sannolikt med överlappande funktioner.
I detta genetiska ablationsparadigm uttrycker Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 zebrafiskar den bakteriehärledda nitroreduktasgenen (NTR/nfsB)6 smält samman med eGFP under kontroll av RPE-förstärkarelementet, rpe65a7. Ablation uppnås genom tillsats av prodrug, metronidazol (MTZ), till systemvattenhus zebrafisk. Intracellulär aktivering av MTZ genom nitroreduktas resulterar i DNA-tvärbindning och apoptos i NTR/nfsB-uttryckande celler 8,9. Denna teknik har använts i stor utsträckning i zebrafisk för att ablatera celler i näthinnan 10,11,12,13 och andra vävnader 8. Tillsammans möjliggör dessa element riktat uttryck (rpe65a) av en inducerbar cellablationsmetodik (NTR / MTZ) 8,9 och en fluorescerande markör (eGFP) för visualisering.
Andra intressanta in vivo-modeller finns också som kan användas för att studera RPE14: s regenerativa potential. Dessa är breda och inkluderar RPE-till-näthinnan-transdifferentiering efter retinektomi hos amfibier, där RPE-celler som förlorats till retinal återväxt ersätts15,16; RPE-restaurering efter skada i "superläkning" MRL / MpJ-mus17; och exogen stimulering av RPE-proliferation i en råttmodell av bland annat spontan RPE och retinal degeneration18. In vitro-modeller, såsom vuxna humana RPE-stamceller (RPESC)19 har också utvecklats. Dessa modeller är alla värdefulla verktyg som arbetar för att avslöja de cellulära processerna relaterade till RPE-regenerering (t.ex. spridning, differentiering etc.); Zebrafisken är dock unik i sin kapacitet för inneboende RPE-reparation efter ablation.
Medan metoden här är skriven för att fokusera på att förstå mekanismerna som driver RPE-regenerering, kan Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) - linjen och detta genetiska ablationsprotokoll användas för att studera andra cellulära processer som RPE-apoptos, RPE-degeneration och effekten av RPE-skada på intilliggande retinala och vaskulära vävnader. Ablationsprotokollet kan också modifieras för att inkludera farmakologisk manipulation, vilket är en bekväm preliminär strategi för att screena signalvägar av intresse. Till exempel har blockering av den kanoniska Wnt-vägen med hjälp av Inhibitor of Wnt Response-1 (IWR-1)20 visat sig försämra RPE-regenerering3. Detta upprepades här för att vägleda användare genom ett farmakologiskt manipulationsexperiment och fungera som proof-of-concept för att validera ett MATLAB-skript (RpEGEN) skapat för att kvantifiera RPE-regenerering baserat på återvinning av pigmentering. Liksom det transgena linje- och ablationsprotokollet är RpEGEN-skripten anpassningsbara och kan användas för att kvantifiera andra markörer / cellulära processer inom RPE.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lab Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>Catalog number is for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond tip scribing pen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-254-51</td>
			<td>Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) &#8805;99.7 %</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (large)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3720A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (mini/tabletop)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td>Or similar, with 488 nm excitation laser/filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-4</td>
			<td>Manufactured by Corning, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5.04462</td>
			<td>Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue (powder)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP117-100</td>
			<td>Also available as a premade aqeuous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole (MTZ)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3761</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td>Chemical waste, proper disposal required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (powder packets)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Used to make 10 X PBS stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PRON-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>H2010</td>
			<td>Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Or similar, with transmitted light illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Fine-tipped forceps for manual dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop rotator/shaker</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z135003</td>
			<td>3.2 mL bulb draw, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS1, TRS2, TRS5</td>
			<td>Also available from Fisher Scientific (NC0342409)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td>Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRAMM examples and how-tos</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB support</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/support.html</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium

Retinal pigmentepitelet (RPE) finns på baksidan av ögat och utför funktioner som är väsentliga för att upprätthålla hälsan och integriteten hos intilliggande retinala och vaskulära vävnader. För närvarande har den begränsade reparativa kapaciteten hos däggdjurs RPE, som är begränsad till små skador, hindrat framsteg mot att förstå RPE-regenerativa processer in vivo . Här tillhandahålls en detaljerad metod för att underlätta studien av in vivo RPE-reparation med zebrafisken, en ryggradsdjursmodell som kan robust vävnadsregenerering. Detta protokoll beskriver ett transgent nitroreduktas/metronidazol (NTR/MTZ)-medierat skadeparadigm (rpe65a:nfsB-eGFP), vilket resulterar i ablation av de centrala två tredjedelarna av RPE efter 24 timmars behandling med MTZ, med efterföljande vävnadsåterhämtning. Fokus läggs på RPE-ablationer i larvzebrafiskar och metoder för att testa effekterna av farmakologiska föreningar på RPE-regenerering beskrivs också. Generering och validering av RpEGEN, ett MATLAB-skript skapat för att automatisera kvantifiering av RPE-regenerering baserat på pigmentering, diskuteras också. Utöver aktiva RPE-reparationsmekanismer kan detta protokoll utvidgas till studier av RPE-degenerering och skaderespons samt effekterna av RPE-skador på intilliggande retinala och vaskulära vävnader, bland andra cellulära och molekylära processer. Detta zebrafisksystem har ett betydande löfte om att identifiera gener, nätverk och processer som driver RPE-regenerering och RPE-sjukdomsrelaterade mekanismer, med det långsiktiga målet att tillämpa denna kunskap på däggdjurssystem och i slutändan mot terapeutisk utveckling.

Att hämma den kanoniska Wnt-signalvägen är känd för att avsevärt försämra zebrafiskens RPE-regenerering med hjälp av det genetiska ablationsparadigmet (rpe65a: nfsB-eGFP) och farmakologisk manipulationsmetodik (IWR-1) som beskrivs i protokollet3. Detta experiment upprepades här för att validera en automatiserad metod för kvantifiering av zebrafiskens RPE-regenerering baserat på pigmentering. Resultaten som sammanfattas nedan omfattade alla steg i protokollet, från befruktnin...

Watch this Scientific Journal Video about Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

Detta protokoll beskriver metoden för att genetiskt ablate retinal pigmentepitel (RPE) med hjälp av en transgen zebrafiskmodell. Att anpassa protokollet för att införliva signalvägsmodulering med hjälp av farmakologiska föreningar är utförligt detaljerat. En MATLAB-plattform för kvantifiering av RPE-regenerering baserat på pigmentering har utvecklats och presenteras och diskuteras.

Nitroreduktas/metronidazolmedierad ablation och en MATLAB-plattform (RpEGEN) för att studera regenerering av zebrafiskens retinala pigmentepitel

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Zebrafisken är unik i sin inneboende förmåga att regenerera många olika vävnadstyper, inklusive RPE. Detta protokoll kan användas för att identifiera molekylära vägar som driver RPE-regenerering och RPE-sjukdomsrelaterade mekanismer. Mångsidighet är en primär fördel med denna metodik.Förutom att studera RPE-regenerering kan detta protokoll användas för att undersöka RPE-degenerativa processer och effekterna av RPE-skador på intilliggande vävnader i ögat. Däggdjur, inklusive människor, kan inte reparera stora RPE-skador till följd av trauma eller degenerativ sjukdom. Att använda zebrafisk som ett verktyg för att upptäcka RPE-proregenerativa faktorer är ett viktigt steg mot att främja RPE-regenerering av däggdjur.För att förbereda en ny 10 millimolär MTZ-lösning, fem dagar efter befruktning, tillsätt MTZ-pulver till systemvatten utan PTU och blanda noggrant genom kraftig skakning i en timme vid 37 grader Celsius. Kyl 10 millimolär MTZ-lösning i en timme vid rumstemperatur på en bordsrotator eller shaker. För att screena zebrafisklarver från rpe65a: nsfB-eGFP-transgenen, separera transgena eGFP-positiva larver från icke-transgena eGFP-negativa larver med hjälp av ett fluorescerande stereomikroskop med en 488 nanometer excitationslaser.Vakna upp screenade larver omedelbart genom att pipettera direkt i en petriskål med färsk 1,5X PTU utan trikain. Efter avslutad screening separeras de eGFP-positiva larverna ytterligare i två grupper av petriskålar, en grupp för att få MTZ-behandling och en grupp som ska vara den oablaterade kontrollen. Ablatera sedan retinalpigmentepitelet genom att ta bort 1,5X PTU från de ablaterade behandlingsskålarna och tillsätt den nygjorda 10 millimolära MTZ-lösningen.Ta också bort 1,5X PTU från de oablaterade kontrollskålarna och tillsätt färskt systemvatten utan PTU. Ta bort 10 millimolär MTZ-lösningen efter exakt 24 timmar och tillsätt färskt systemvatten utan PTU. Byt färskt systemvatten utan PTU på MTZ-negativa rätter.Screen eGFP-positiva larver på fyra dagar efter befruktning. EGFP är synlig fyra dagar efter befruktningen, men verkar svagare än signalintensiteten den femte dagen. Placera eGFP-positiva larver i sexbrunnsplattor istället för petriskålar med en densitet av högst 10 larver per brunn för farmakologisk behandling.Utse separata sexbrunnsplattor för ablaterade och oablaterade larver. Bestäm volymen av 15 mikromolära IWR-1 eller volymmatchade DMSO-fordonskontrollförbehandlingar som behövs och alikvot 1,5X PTU i koniska rör i enlighet därefter. Tillsätt IWR-1-beståndet till 1,5X PTU för en slutlig koncentration av 15 mikromolära IWR-1.Lägg till en matchad volym DMSO-lager till 1,5X PTU. Blanda väl genom virvel och visuellt bekräfta upplösningen av föreningar. Ta bort 1,5X PTU från de eGFP-positiva larverna i sexbrunnsplattor och tillsätt fem milliliter per brunn nygjorda 0,06% DMSO eller 15 mikromolära IWR-1-behandlingar.Ablate RPE nästa dag. På fem dagar efter befruktningen, bestäm volymen av farmakologiska och fordonskontrollerbehandlingar som behövs för både oablaterade och ablaterade sexbrunnsplattor och alikvot lämpliga volymer av antingen färskt systemvatten utan PTU eller 10 millimolär MTZ-lösning i koniska rör. Lägg till IWR-1 och DMSO lagerlösningar till respektive koniska rör som utförts tidigare.Blanda väl genom virvel och visuellt bekräfta upplösningen av föreningar. Ta bort 0,06% DMSO och 15 mikromolära IWR-1-förbehandlingar i 1,5X PTU från utsedda oablaterade och ablaterade sexbrunnsplattor. Fyll på med lämpligt färskt systemvatten utan PTU- och MTZ-lösningsbehandlingar.Ta bort 0,06% DMSO och 15 mikromolära IWR-1-behandlingar i 10 millimolär MTZ-lösning efter exakt 24 timmar och fyll på med behandlingar i färskt systemvatten utan PTU. Fyll på 0,06% DMSO och 15 mikromolära IWR-1-behandlingar i färskt systemvatten utan PTU på den oablaterade sexbrunnsplattan. Övervaka framgången och omfattningen av ablation in vivo med hjälp av överförd ljusbelysning på ett stereomikroskop för larvunderhåll efter genetisk ablation.För att generera RPE-regionen av intresse eller ROI med Fiji, öppna en åtta bitars TIFF-bild, omorientera bilden så att dorsalsidan är uppe och distal lämnas genom att välja bild, transformera och vända horisontellt. För det sista kommandot väljer du det alternativ som bäst passar den riktning som behövs för den bilden. Starta ROI-hanteraren genom att välja analysera, verktyg, ROI-chef.Använd bild, zoom och växla mellan DAPI- och Brightfield-kanalerna. Använd kortkommandon för effektivitet. Identifiera den punkt där den apikala sidan av RPE ligger intill spetsen av det yttre begränsande membranet och använd detta anatomiska landmärke som ROI-utgångspunkt.Skapa RPE ROI med polygonvalsverktyget i Fiji-verktygsfältet med både DAPI- och Brightfield-bildkanalerna och bildzoomfunktionen för att identifiera apikala och basala RPE-gränser. Ta de dorsala och ventrala ändarna av ROI till en skarp punkt snarare än att avtrubba eller avrunda. Lägg till ROI genom att klicka på lägg till i ROI-hanteraren.Spara ROI-filen genom att välja mer och spara i ROI-hanteraren. Dubbelklicka på rpegen. m-fil som ska öppnas i redigeringsfönstret.Under det användardefinierade variabelavsnittet i rpegen. m-fil, ange katalogplatserna för mappar som innehåller roi-filerna, tiff-bildfilerna och var utdatafiler ska sparas. Ange gruppnamnet för mattfilen som ska exporteras och platsen för Brightfield-kanalen i TIFF-bildstacken.Kör skriptet genom att klicka på körknappen i redigeringsmenyn högst upp i MATLAB. När du har sparat MAT-filen visas en figur med tre paneler och sparas också som en PDF i utdatakatalogen för varje bildkörning. Vänta tills dessa PDF-filer för kvalitetskontroll har sparats i utdatamappen och den sista siffran har försvunnit.Öppna de enskilda PDF-filerna och kontrollera att alla ROI:er matchar Brightfield-bilderna. Dubbelklicka på rpegen_permplot. m-fil som ska öppnas på en ny redigeringsflik.Under avsnitt enanvändardefinierade variabler anger du katalogplatsen för utdatamappen som innehåller MAT-filerna från att köra rpegen. m skript. Ange varje MAT-filnamn som ska läsas in.Kör det här avsnittet av skriptet genom att klicka på knappen Kör avsnitt i redigeringsmenyn. I avsnitt två anger du namnen på de två grupperna för en statistisk jämförelse i data A- och data B-variablerna och anger antalet permutationssimuleringsrepetitioner i reps-variabeln. Endast 2000 reps användes för denna demo för att minska bearbetningstiden.Kör det här avsnittet av skriptet genom att klicka på knappen Kör avsnitt i redigeringsmenyn. Kör värmekartfigur och gruppera resultat och P-värdessektioner oberoende av detta med knappen Köravsnitt. Hela monteringsskador av en fem dagars larv efter befruktning visade ljust transgenuttryck i RPE vid tidpunkten för screening för genetisk ablation.Tvärgående kryosektion av unablated sex dagars larv efter befruktning visade att transgenuttryck var begränsat till mogna RPE-celler med det ljusaste uttrycket begränsat till rpe-centrala 2/3. Pilspetsar indikerar apikala mikrovilli. Tvärgående kryosektion av en ablaterad en-dag efter skada larv avslöjade störning av eGFP-positiv cellmorfologi.Pilar indikerar pyknotiska kärnor. Hela monteringsskador av oablaterade sju dagars larver efter befruktning visade RPE-pigmentering i hela ögat och ablaterade två dagars larver efter skada visade en ablationszon frånvarande pigment i centrala RPE. Ett diagram genererat med rpEGEN visade likhet mellan de osablaterade nio dagars DMSO- och IWR-1-grupperna efter befruktning över RPE: s längd.Diagrammet visade den totala ljusare pixelintensiteten i de ablaterade fyra dagars DMSO- och IWR-1-grupperna efter skada, som verkade lättast i den ablaterade IWR-1 jämfört med någon annan behandlingsgrupp. Skillnader i central RPE-pigmentering var signifikanta när man jämförde ablaterade IWR-1-behandlade larver med ablaterade DMSO-behandlade kontroller. Med hjälp av detta zebrafiskablationsparadigm har vi kunnat identifiera flera molekylära signalvägar, såsom vindsignalering som vi har visat här, som är kritiska regulatorer för RPE-regenerering.

Research

JoVE Journal

Biology

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Ett system för odling Iris Pigment epitelceller att studera Lens Regenerering vid Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Laser Ablation av Zebrafish Pronephros att studera Nedsatt Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MikroRNA Expression Profiler av Human iPS-celler, pigmentepitelet härledas från iPS, och Fetal pigmentepitelet

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea (MNU) -inducerad Retinal Degeneration och Regeneration i Zebrafish: Histologisk och funktionella egenskaper

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primära cellkulturer från mus Retinal pigmentepitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Isolering av primära musretinala pigmenterade epitelceller

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Effektiv och konsekvent generering av retinal pigmentepitel / choroid flatmounts från mänskliga ögon för histologisk analys

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...