Name: nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium
Uploaded: 2022-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Burada açıklanan çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri (RO1-EY29410'dan J.M.G'ye ve NIH CORE Grant P30-EY08098'den Oftalmoloji Bölümü'ne) tarafından desteklenmiştir; UPMC Bağışıklık Nakli ve Terapi Merkezi (L.L.L. ve J.M.G.'ye); ve E. Ronald Salvitti Oftalmoloji Araştırmaları Kürsüsü (J.M.G.'ye). Wiegand Oftalmoloji Bursu'ndan (L.L.L.'ye), Pittsburgh Göz ve Kulak Vakfı'ndan ve New York, NY'daki Körlüğü Önleme Araştırması'ndan sınırsız bir hibe alındı. Yazarlar ayrıca teknik yardım için Amanda Platt'a ve mükemmel hayvan bakımı desteği için Dr. Hugh Hammer ve su sporları personeline teşekkür etmek istiyor.

Burada özetlenen tüm metodolojiler, Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ile uyumludur.
1. Zebra balığı embriyo toplama işleminden önce hazırlık
<ol><li>Embriyo inkübatörünü 28.5 ° C'ye ayarlayın.</li>
	<li>Melanogenez inhibitörü, N-feniltiourea (PTU) 21,22'nin 25x stok çözeltisini hazırlayın. Bu stok çözeltisi ortak bir reçete<sup class="...

Bu protokol, RPE'yi genetik olarak ablate etmek ve larval yaşlı zebra balıklarında dejenerasyon ve rejenerasyon mekanizmalarını incelemek için metodolojiyi açıklamaktadır. Bu protokol yetişkin zebra balığı3'te de başarıyla gerçekleştirilmiştir, ancak daha az kapsamlı karakterizasyona sahiptir, bu nedenle larvalar burada odak noktasıdır. Protokolün bu bölümünün kritik yönleri (adım 1-4) şunları içerir: 1) melanogenezin başlamasından önce embriyolara 1.5x PTU eklen...

Burada açıklanan metodoloji, larva zebra balığı kullanarak retinal pigment epitelini (RPE) genetik olarak ablate etmek için bir protokolü detaylandırmaktadır. RPE gözün arkasına uzanır ve nöral retinanın tabakalaşmış tabakaları ile koroidi oluşturan vaskülatür tabakası arasında bulunur. Trofik destek, fototoksik ışığın emilimi ve görsel döngü proteinlerinin bakımı, RPE'nin bu bitişik dokuların sağlığını ve bütünlüğünü sürdürmek için gerekli olan kritik işlevlerden sadecebirkaçıdır 1. Memeli RPE'sine verilen hasar, lezyonlar küçük olduğunda onarılabilir2; Bununla birlikte, daha büyük yaralanmaların veya ilerleyici dejeneratif hastalıkların maruz kaldığı hasar geri dönüşümsüzdür. İnsanlarda, RPE dejeneratif hastalıkları (örneğin, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ve Stargardt hastalığı) kalıcı görme kaybına ve az sayıda tedavi seçeneği ile hastanın yaşam kalitesinin düşmesine neden olur. Memeli RPE'nin kendi kendini onarma yeteneğinin sınırlı olması, RPE rejeneratif süreçleri alanında bir bilgi boşluğu yaratmıştır. Zebra balıklarının birçok farklı doku tipinde sağlam rejeneratif kapasitesi göz önüne alındığında, bu protokol, içsel olarak yenilenen RPE ile ilgili çalışmaları kolaylaştırmak ve bu yanıtı yönlendiren mekanizmaları ortaya çıkarmak için in vivo omurgalı bir sistem kurmak için geliştirilmiştir. Burada özetlenen ablasyon paradigması kullanılarak, kanonik Wnt sinyal yolu3, mTOR yolu4 ve bağışıklık ile ilgili yanıtlar5 , muhtemelen örtüşen işlevlerle RPE rejenerasyonunun kritik mediatörleri olarak tanımlanmıştır.
Bu genetik ablasyon paradigmasında, Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 zebra balığı, RPE arttırıcı elementin kontrolü altında eGFP'ye kaynaşmış bakteri kaynaklı nitroredüktaz (NTR / nfsB) gen 6'yı eksprese eder, rpe65a7. Ablasyon, zebra balığı barındıran sisteme ön ilaç metronidazol (MTZ) eklenerek elde edilir. MTZ'nin nitroredüktaz ile hücre içi aktivasyonu, NTR / nfsB eksprese eden hücrelerde DNA çapraz bağlanması ve apoptoz ile sonuçlanır 8,9. Bu teknoloji, zebra balıklarında retina10,11,12,13 hücrelerini ve diğer dokuları ablate etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır8. Bu elemanlar birlikte, indüklenebilir hücre ablasyon metodolojisinin (NTR / MTZ) 8,9 ve görselleştirme için bir floresan işaretleyicinin (eGFP) hedeflenen ekspresyonunu (rpe65a) sağlar.
RPE14'ün rejeneratif potansiyelini incelemek için kullanılabilecek diğer ilginç in vivo modeller de mevcuttur. Bunlar geniştir ve amfibilerde retinektomi sonrası RPE-retina transdiferansiyasyonunu içerir, burada retinal yeniden büyümeye kaybedilen RPE hücreleri değiştirilir15,16; "Süper şifa" MRL / MpJ fare17'de yaralanma sonrası RPE restorasyonu; ve diğerlerinin yanı sıra spontan RPE ve retinal dejenerasyon18'in bir sıçan modelinde RPE proliferasyonunun eksojen uyarılması. Yetişkin insan RPE kök hücreleri (RPESC'ler)19 gibi in vitro modeller de geliştirilmiştir. Bu modellerin tümü, RPE rejenerasyonu ile ilgili hücresel süreçleri ortaya çıkarmak için çalışan değerli araçlardır (örneğin, proliferasyon, farklılaşma, vb.); Bununla birlikte, zebra balığı, ablasyon sonrası içsel RPE onarımı için kapasitesinde benzersizdir.
Buradaki metodoloji, RPE rejenerasyonunu yönlendiren mekanizmaları anlamaya odaklanmak için yazılmış olsa da, Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) hattı ve bu genetik ablasyon protokolü, RPE apoptozisi, RPE dejenerasyonu ve RPE hasarının bitişik retinal ve vasküler dokular üzerindeki etkisi gibi diğer hücresel süreçleri incelemek için kullanılabilir. Ablasyon protokolü, ilgilenilen sinyal yollarını taramak için uygun bir ön strateji olan farmakolojik manipülasyonu içerecek şekilde de değiştirilebilir. Örneğin, Wnt Yanıt-1 İnhibitörü (IWR-1)20 kullanılarak kanonik Wnt yolunun bloke edilmesinin, RPE rejenerasyonunu bozduğugösterilmiştir 3. Bu, kullanıcılara farmakolojik bir manipülasyon deneyi boyunca rehberlik etmek ve pigmentasyonun geri kazanımına dayalı RPE rejenerasyonunu ölçmek için oluşturulan bir MATLAB komut dosyasını (RpEGEN) doğrulamak için kavram kanıtı olarak hizmet etmek için burada tekrarlandı. Transgenik çizgi ve ablasyon protokolü gibi, RpEGEN komut dosyaları uyarlanabilir ve RPE içindeki diğer belirteçleri / hücresel süreçleri ölçmek için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lab Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>Catalog number is for 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond tip scribing pen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-254-51</td>
			<td>Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) &#8805;99.7 %</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (large)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3720A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo incubator (mini/tabletop)</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td>Or similar, with 488 nm excitation laser/filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-4</td>
			<td>Manufactured by Corning, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5.04462</td>
			<td>Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue (powder)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP117-100</td>
			<td>Also available as a premade aqeuous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole (MTZ)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3761</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Check instiutional chemical waste disposal requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td>Chemical waste, proper disposal required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (powder packets)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Used to make 10 X PBS stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PRON-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>H2010</td>
			<td>Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Or similar, with transmitted light illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Fine-tipped forceps for manual dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop rotator/shaker</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z135003</td>
			<td>3.2 mL bulb draw, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS1, TRS2, TRS5</td>
			<td>Also available from Fisher Scientific (NC0342409)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td>Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRAMM examples and how-tos</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB support</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/support.html</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitroreductase/metronidazole-mediated ablation and a matlab platform (rpegen) for studying regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium

Retinal pigment epiteli (RPE) gözün arkasında bulunur ve komşu retinal ve vasküler dokuların sağlığını ve bütünlüğünü korumak için gerekli işlevleri yerine getirir. Günümüzde, küçük yaralanmalarla sınırlı olan memeli RPE'nin sınırlı onarıcı kapasitesi, in vivo RPE rejeneratif süreçlerini anlamadaki ilerlemeyi engellemiştir. Burada, sağlam doku rejenerasyonu yapabilen omurgalı bir model olan zebra balığı kullanılarak in vivo RPE onarımının incelenmesini kolaylaştırmak için ayrıntılı bir metodoloji sağlanmaktadır. Bu protokol, transgenik bir nitroredüktaz / metronidazol (NTR / MTZ) aracılı yaralanma paradigmasını (rpe65a: nfsB-eGFP) tanımlar, bu da MTZ ile 24 saatlik tedaviden sonra RPE'nin merkezi üçte ikisinin ablasyonuna ve ardından doku iyileşmesine neden olur. Larva zebra balığında RPE ablasyonlarına odaklanılmış ve farmakolojik bileşiklerin RPE rejenerasyonu üzerindeki etkilerini test etmek için yöntemler de özetlenmiştir. Pigmentasyona dayalı RPE rejenerasyonunun nicelleştirilmesini otomatikleştirmek için oluşturulan bir MATLAB betiği olan RpEGEN'in oluşturulması ve doğrulanması da tartışılmaktadır. Aktif RPE onarım mekanizmalarının ötesinde, bu protokol, RPE dejenerasyonu ve yaralanma yanıtlarının yanı sıra RPE hasarının diğer hücresel ve moleküler süreçlerin yanı sıra bitişik retinal ve vasküler dokular üzerindeki etkileri üzerine yapılan çalışmalara genişletilebilir. Bu zebra balığı sistemi, RPE rejenerasyonunu ve RPE hastalığıyla ilgili mekanizmaları yönlendiren genleri, ağları ve süreçleri tanımlamada, bu bilgiyi memeli sistemlerine ve nihayetinde terapötik gelişime doğru uygulamak için uzun vadeli bir amaç doğrultusunda önemli bir umut vaat etmektedir.

Kanonik Wnt sinyal yolunu inhibe etmenin, protokol3'te açıklanan genetik ablasyon paradigması (rpe65a: nfsB-eGFP) ve farmakolojik manipülasyon metodolojisi (IWR-1) kullanılarak zebra balığı RPE rejenerasyonunu önemli ölçüde bozduğu bilinmektedir. Bu deney, pigmentasyona dayalı zebra balığı RPE rejenerasyonunu ölçmek için otomatik bir yöntemi doğrulamak için burada tekrarlandı. Aşağıda özetlenen sonuçlar, döllenme gününden (0 dpf) RpEGEN kullanarak RPE rejen...

Watch this Scientific Journal Video about Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

Bu protokol, transgenik zebra balığı modeli kullanarak retinal pigment epitelini (RPE) genetik olarak ablate etme metodolojisini açıklamaktadır. Farmakolojik bileşikler kullanarak sinyal yolu modülasyonunu içerecek şekilde protokolün uyarlanması kapsamlı bir şekilde detaylandırılmıştır. Pigmentasyona dayalı RPE rejenerasyonunu ölçmek için bir MATLAB platformu geliştirildi ve sunuldu ve tartışıldı.

Zebra Balığı Retinal Pigment Epitelinin Rejenerasyonunu İncelemek için Nitroredüktaz / Metronidazol Aracılı Ablasyon ve Bir MATLAB Platformu (RpEGEN)

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Zebra balığı, RPE de dahil olmak üzere birçok farklı doku tipini yenilemek için içsel yeteneği bakımından benzersizdir. Bu protokol, RPE rejenerasyonunu ve RPE hastalığı ile ilgili mekanizmaları yönlendiren moleküler yolları tanımlamak için kullanılabilir. Çok yönlülük, bu metodolojinin birincil avantajıdır.RPE rejenerasyonunu incelemeye ek olarak, bu protokol RPE dejeneratif süreçlerini ve RPE hasarının gözdeki bitişik dokular üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir. İnsanlar da dahil olmak üzere memeliler, travma veya dejeneratif hastalıktan kaynaklanan büyük RPE yaralanmalarını onaramazlar. Zebra balığının RPE pro-rejeneratif faktörlerini keşfetmek için bir araç olarak kullanılması, memeli RPE rejenerasyonunu teşvik etmek için önemli bir adımdır.Taze bir 10 milimolar MTZ çözeltisi hazırlamak için, gübrelemeden beş gün sonra, PTU olmadan sistem suyuna MTZ tozu ekleyin ve 37 santigrat derecede bir saat boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalayarak iyice karıştırın. 10 milimolar MTZ çözeltisini bir masa üstü rotatör veya çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında bir saat soğutun. Zebra balığı larvalarını rpe65a: nsfB-eGFP transgeninden taramak için, transgenik eGFP pozitif larvalarını, 488 nanometre uyarma lazerine sahip bir floresan stereo mikroskop kullanarak transgenik olmayan eGFP negatif larvalardan ayırın.Uyanın, larvaları trikainsiz taze 1.5X PTU ile doğrudan bir Petri kabına pipetleyerek hemen taradı. Taramanın tamamlanmasının ardından, eGFP pozitif larvaları iki Petri kabı grubuna, MTZ tedavisi almak için bir gruba ve bir grup da unblated kontrol olmak üzere ayırın. Daha sonra, ablatlanmış tedavi kaplarından 1.5X PTU'yu çıkararak retinal pigment epitelini ablate edin ve taze yapılmış 10 milimolar MTZ çözeltisini ekleyin.Ayrıca unblated kontrol kaplarından 1,5X PTU'yu çıkarın ve PTU olmadan tatlı sistem suyu ekleyin. 10 milimolar MTZ çözeltisini tam olarak 24 saat sonra çıkarın ve PTU olmadan tatlı sistem suyu ekleyin. MTZ negatif tabaklarda PTU olmadan tatlı sistem suyunu değiştirin.Döllenmeden sonraki dört günde eGFP pozitif larvaları tarayın. eGFP, döllenmeden dört gün sonra görülebilir, ancak beşinci günde sinyal yoğunluğundan daha sönük görünür. Farmakolojik tedavi için eGFP pozitif larvaları, Petri yemekleri yerine kuyu başına en fazla 10 larva yoğunluğunda altı kuyucuklu plakalara yerleştirin.Ablatlanmış ve ablatlanmış larvalar için ayrı altı kuyucuklu plakalar belirleyin. Gerekli 15 mikromolar IWR-1 veya hacim uyumlu DMSO araç kontrol ön işlemlerinin hacmini ve buna göre konik tüplere aliquot 1.5X PTU'nun hacmini belirleyin. 15 mikromolar IWR-1'in son konsantrasyonu için 1,5X PTU'ya IWR-1 stoğu ekleyin.1,5X PTU'ya eşleşen bir DMSO stok hacmi ekleyin. Vorteksleme ile iyice karıştırın ve bileşiklerin çözünmesini görsel olarak onaylayın. Altı delikli plakalarda eGFP pozitif larvalarından 1.5X PTU'yu çıkarın ve taze yapılmış% 0.06 DMSO veya 15 mikromolar IWR-1 tedavilerinin kuyusu başına beş mililitre ekleyin.Ertesi gün RPE'yi abartın. Döllenmeden sonraki beş günde, hem ablatlanmış hem de ablatlanmış altı kuyucuklu plakalar için gerekli farmakolojik ve araç kontrol işlemlerinin hacmini belirleyin ve PTU'suz tatlı sistem suyunun veya konik tüplere 10 milimolar MTZ çözeltisinin uygun hacimlerini belirleyin. Daha önce yapıldığı gibi ilgili konik tüplere IWR-1 ve DMSO stok çözümleri ekleyin.Vorteksleme ile iyice karıştırın ve bileşiklerin çözünmesini görsel olarak onaylayın. 1.5X PTU'da% 0.06 DMSO ve 15 mikromolar IWR-1 ön işlemlerini, belirlenmiş unblated ve ablated altı kuyucuklu plakalardan çıkarın. PTU ve MTZ çözelti arıtmaları olmadan uygun tatlı sistem suyuyla doldurun.Tam 24 saat sonra 10 milimolar MTZ çözeltisinde% 0.06 DMSO ve 15 mikromolar IWR-1 işlemlerini çıkarın ve PTU'suz tatlı sistem suyunda arıtmalarla doldurun. %0,06 DMSO ve 15 mikromolar IWR-1 işlemlerini, yarım delikli plaka üzerinde PTU olmadan tatlı sistem suyunda doldurun. Genetik ablasyon sonrası larva bakımı için stereo mikroskopta iletilen ışık aydınlatmasını kullanarak in vivo ablasyonun başarısını ve kapsamını izleyin.Fiji'yi kullanarak ilgilenilen RPE bölgesini veya yatırım getirisini oluşturmak için sekiz bitlik bir TIFF görüntüsü açın, görüntüyü yatay olarak dönüştürmeyi ve çevirmeyi seçerek sırt tarafı yukarı ve distal kalacak şekilde yeniden yönlendirin. Son komut için, söz konusu görüntü için gereken yönselliğe en uygun seçeneği belirleyin. Analiz, araçlar, YG yöneticisini seçerek YG yöneticisini başlatın.Görüntüyü kullanın, yakınlaştırın ve DAPI ile Brightfield kanalları arasında geçiş yapın. Verimlilik için klavye kısayollarını kullanın. RPE'nin apikal tarafının dış sınırlayıcı membranın ucundan bitişik olduğu noktayı tanımlayın ve bu anatomik dönüm noktasını ROI başlangıç noktası olarak kullanın.Apikal ve bazal RPE sınırlarını tanımlamak için hem DAPI hem de Brightfield görüntü kanallarını ve görüntü yakınlaştırma işlevini kullanarak Fiji araç çubuğundaki çokgen seçimleri aracıyla RPE yatırım getirisini oluşturun. ROI'nin dorsal ve ventral uçlarını köreltmek veya yuvarlamak yerine keskin bir noktaya getirin. YG yöneticisinde ekle'ye tıklayarak YG'yi ekleyin.Daha fazlasını seçerek YG dosyasını kaydedin ve YG yöneticisine kaydedin. Rpegen'e çift tıklayın. m dosyası düzenleyici bölmesinde açılır.Rpegen'in kullanıcı tanımlı değişken bölümünün altında. m dosyasında, ROI dosyalarını, tiff görüntü dosyalarını ve çıktı dosyalarının kaydedilmesi gereken yerleri içeren klasörler için dizin konumlarını girin. Dışa aktarılacak mat dosyasının grup adını ve TIFF görüntü yığınındaki Brightfield kanalının konumunu girin.MATLAB'ın üst kısmındaki düzenleyici menüsündeki çalıştır düğmesine tıklayarak komut dosyasını çalıştırın. MAT dosyasını kaydettikten sonra, üç panelli bir şekil görünecek ve ayrıca her görüntü çalıştırması için çıktı dizinine PDF olarak kaydedilecektir. Bu kalite kontrol PDF'leri çıktı klasörüne kaydedilene ve son rakam kaybolana kadar bekleyin.Tek tek PDF'leri açın ve tüm YG'lerin Brightfield görüntüleriyle eşleştiğini doğrulayın. rpegen_permplot çift tıklayın. m dosyası yeni bir düzenleyici sekmesinde açılır.Tek kullanıcı tanımlı değişkenler bölümünün altında, rpegen'i çalıştırırken MAT dosyalarını içeren çıktı klasörünün dizin konumunu girin. m betiği. Yüklenecek her MAT dosya adını girin.Düzenleyici menüsündeki bölüm çalıştır düğmesine tıklayarak komut dosyasının bu bölümünü çalıştırın. İkinci bölümde, veri A ve veri B değişkenlerinde istatistiksel bir karşılaştırma için iki grubun adlarını girin ve reps değişkenindeki permütasyon simülasyonu tekrarlarının sayısını belirtin. İşlem süresini azaltmak için bu demo için yalnızca 2.000 temsilci kullanıldı.Düzenleyici menüsündeki bölüm çalıştır düğmesine tıklayarak komut dosyasının bu bölümünü çalıştırın. Isı haritası figürünü çalıştırın ve sonuçları ve P değeri bölümlerini çalıştır düğmesini kullanarak bağımsız olarak çalıştırın. Döllenme sonrası beş günlük larvaların tüm montaj hasarı, genetik ablasyon taraması sırasında RPE'de parlak transgen ekspresyonu gösterdi.Döllenme sonrası altı günlük larvaların transvers kriyoskopisi, transgen ekspresyonunun, RPE'nin merkezi 2 / 3'ü ile sınırlı olan en parlak ekspresyon ile olgun RPE hücreleri ile sınırlı olduğunu gösterdi. Ok uçları apikal mikrovillusları gösterir. Yaralanma sonrası bir günlük ablatlanmış larvaların transvers kriyoseksiyonu, eGFP pozitif hücre morfolojisinin bozulmasını ortaya çıkardı.Oklar piknotik çekirdekleri gösterir. Döllenme sonrası yedi günlük larvaların tüm binek hasarları göz boyunca RPE pigmentasyonu gösterdi ve ablatlanmış iki günlük yaralanma sonrası larvalar, merkezi RPE'de pigment bulunmayan bir ablasyon bölgesi gösterdi. RpEGEN kullanılarak oluşturulan bir grafik, RPE'nin uzunluğu boyunca döllenmeden dokuz günlük döllenme sonrası DMSO ve IWR-1 grupları arasında benzerlik gösterdi.Grafik, ablatlanmış dört günlük yaralanma sonrası DMSO ve IWR-1 gruplarında genel olarak daha hafif piksel yoğunluğu gösterdi ve bu, diğer herhangi bir tedavi grubuna kıyasla ablatlanmış IWR-1'de en hafif görünüyordu. Santral RPE pigmentasyonundaki farklılıklar, ablatlanmış IWR-1 ile tedavi edilen larvaları ablated DMSO ile tedavi edilen kontroller karşılaştırırken anlamlıydı. Bu zebra balığı ablasyon paradigmasını kullanarak, burada gösterdiğimiz rüzgar sinyalizasyonu gibi, RPE rejenerasyonunun kritik düzenleyicileri olan çeşitli moleküler sinyal yollarını tanımlayabildik.

Research

JoVE Journal

Biology

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Newt Lens Rejenerasyon Eğitim Kültürleme İris Pigment Epitel Hücreler için Sistem

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Histolojik ve Fonksiyonel Özellikleri: Methylnitrosourea (MNU) Retina Dejenerasyonu ve Rejenerasyon Zebra balığı -kaynaklı

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Fare retina Pigment epiteli birincil hücre kültürleri

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Histolojik Analiz için İnsan Gözünden Retinal Pigment Epitel/Koroid Flatmount'larının Verimli ve Tutarlı Üretimi

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Caudal Peduncle Cryoinjury in Adult Zebrafish

A Cryoinjury Model for Studying Skeletal Muscle Regeneration of the Caudal Peduncle in Adult Zebrafish

A Cryoinjury Model for Studying Skeletal Muscle Regeneration of the Caudal Peduncle in Adult Zebrafish (Video) | JoVE 

Yetişkin zebra balıklarında kaudal pedinkülün iskelet kası rejenerasyonunu incelemek için bir kriyoyaralanma modeli

Skeletal muscle undergoes renewal and restoration after minor injury through the activation of satellite-like stem cells. Severe injuries of the ...

Modeling and Analyzing Retinal Degeneration

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

Unraveling the Pathogenesis of Age-Related Macular Degeneration and Discovering Potential Therapies (Video) | JoVE

LipidUNet-Machine Learning Tabanlı iPSC Kaynaklı Retinal Pigment Epiteli Kullanılarak Lipid Birikintilerinin Karakterizasyonu ve Nicelleştirilmesi Yöntemi