Name: detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

نشكر الدكتور شين رو وانغ من جامعة مينيسوتا على اقتراحاته وتوجيهاته الثاقبة. تم دعم هذا العمل بمنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81760374).

1. المواد والكواشف
<ol><li>استخدم الحلول والوسائط الخالية من البيروجين لزراعة الخلايا (انظر جدول المواد).</li>
	<li>استخدم المياه فائقة النقاء لإعداد جميع الحلول.</li>
	<li>كن حذرا في اختيار مصل الأبقار الجنينية (FBS) لزراعة الخلايا ، بعد عملية فحص الكثير. ملاحظة: نظرا لأن عقود FBS تخض...

<ol>
	<li>Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+crowding+and+temperature+on+Wolbachia+infection+density+among+life+cycle+stages+of+Aedes+albopictus.">Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus.</a> Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).</li><li>Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+superinfections+and+the+expression+of+cytoplasmic+incompatibility.">Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility.</a> Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).</li><li>Dobson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+distributed+throughout+insect+somatic+and+germ+line+tissues.">Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).</li><li>O'Neill, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+Wolbachia+pipientis+in+an+Aedes+albopictus+cell+line.">In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line.</a> Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).</li><li>Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+Wolbachia+wAlbB+endosymbiont+of+Aedes+albopictus.">Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus.</a> Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).</li><li>Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+and+cytoplasmic+incompatibility+in+mosquitoes.">Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).</li><li>Fallon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+properties+of+an+Aedes+albopictus+mosquito+cell+line+infected+with+Wolbachia+strain+wAlbB.">Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB.</a> In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).</li><li>Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+species+are+infected+with+Wolbachia?-A+statistical+analysis+of+current+data.">How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data.</a> Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).</li><li>Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia:+master+manipulators+of+invertebrate+biology.">Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology.</a> National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).</li><li>Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Wolbachia+infections+in+Southeast+Asian+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae).">Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).</li><li>O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).</li><li>McGraw, E. A., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+insecticides:+new+thinking+on+an+ancient+problem.">Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem.</a> National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).</li><li>Bourtzis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+mosquito-Wolbachia+symbiosis+for+vector+and+disease+control.">Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control.</a> Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).</li><li>Turelli, M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+an+inherited+incompatibility+factor+in+California+Drosophila.">Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila.</a> Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).</li><li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission.">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li><li>Walker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wMel+Wolbachia+strain+blocks+dengue+and+invades+caged+Aedes+aegypti+populations.">The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations.</a> Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).</li><li>Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+virulent+and+inhibit+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+in+Anopheles+gambiae.">Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).</li><li>Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endosymbiotic+bacterium+Wolbachia+induces+resistance+to+dengue+virus+in+Aedes+aegypti.">The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).</li><li>Moreira, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wolbachia+symbiont+in+Aedes+aegypti+limits+infection+with+dengue,+Chikungunya,+and+Plasmodium.">A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium.</a> Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).</li><li>Caragata, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+cholesterol+modulates+pathogen+blocking+by+Wolbachia.">Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).</li><li>Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+uses+a+host+microRNA+to+regulate+transcripts+of+a+methyltransferase,+contributing+to+dengue+virus+inhibition+in+Aedes+aegypti.">Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).</li><li>Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya-Wolbachia+interplay+in+Aedes+albopictus.">Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus.</a> Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).</li><li>Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+induces+density-dependent+inhibition+to+dengue+virus+in+mosquito+cells.">Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).</li><li>Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Culicoides+sonorensis+biting+midge+cell+lines+with+Wolbachia+pipientis.">Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis.</a> Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).</li><li>Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+PCR-based+classification+of+Wolbachia+strains+using+wsp+gene+sequences.">Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.</a> The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).</li><li>Park, M. S., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+PaAtg8+and+roles+of+autophagy+in+adaptation+to+starvation+with+respect+to+the+fat+body+and+midgut+of+the+Americana+cockroach,+Periplaneta+americana.">Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).</li><li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin.">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody.">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li><li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti.">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li><li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence,+Western+blotting,+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever.">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li></ol>

يعد الكشف عن عدوى Wolbachia داخل الخلايا أمرا ضروريا لدراسة التفاعلات بين Wolbachia ومضيف وتأكيد النقل الناجح للخلايا ذات السلالات الجديدة. في هذا البروتوكول ، تم استخدام أربع طرق للكشف بنجاح عن عدوى Wolbachia داخل الخلايا على مستويات الحمض النووي والبروتين. هذه الطرق التجريبية الأربع ?...

بعوضة النمر الآسيوي Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae) ، وهي ناقل رئيسي لفيروس حمى الضنك (DENV) في آسيا وأجزاء أخرى من العالم1 ، هي مضيف طبيعي لنوعين من البكتيريا داخل الخلايا ، Wolbachia (w AlbA و wAlbB) ، والتي يتم توزيعها في جميع أنحاء الخط الجرثومي والأنسجة الجسدية 2,3. يتكون خط خلايا Aa23 المشتق من أجنة A. albopictus من نوعين على الأقل من الخلايا المورفولوجية ، وكلاهما يدعم العدوى4 ويمكن علاجه من عدوى Wolbachia الأصلية باستخدام المضادات الحيوية (Aa23-T). بالنظر إلى أن Aa23 يحتفظ فقط ب wAlbB ، فهو نموذج مفيد لدراسة التفاعلات بين المضيف والتكافلالداخلي 4,5,6.
ينتقل Wolbachia عن طريق الأم ويصيب ما يقدر بنحو 65٪ من أنواع الحشرات 8,9 و 28٪ من أنواع البعوض10. يصيب مجموعة متنوعة من الأنسجة ويشكل علاقة تكافلية حميمة مع المضيف ، وعادة ما يؤدي إلى عدم توافق السيتوبلازم (CI)11 واستبدال السكان عن طريق التلاعب بالجهاز التناسلي المضيف12,13. وقد لوحظت هذه الاستجابات المضيفة في المجموعات الطبيعية من ذبابة الفاكهة simulans14 وفي A. aegypti في قفص مختبري وتجربة ميدانية15. هناك تلاعب مهم غير إنجابي أثارته Wolbachia وهو مقاومة المضيف لمجموعة متنوعة من مسببات الأمراض ، بما في ذلك DENV وفيروس Chikungunya (CHIKV) وفيروس غرب النيل (WNV) 16,17 ، والتي يمكن أن يتوسط فيها نظام المناعة الفطري المحسن للتكافل18,19 ، والمنافسة بين Wolbachia والفيروسات على الموارد المضيفة الأساسية20 ، والتلاعب بمسارات الدفاع الفيروسي المضيف21 .
تم تطوير هذا البروتوكول لدراسة هذه الآليات الأساسية للاستجابات المضادة للفيروسات المضيفة التي يسببها Wolbachia. ويستخدم أربع طرق للكشف عن عدوى Wolbachia داخل الخلايا من خلايا Aa23. توفر هذه الطرق أساسا نظريا قويا لدراسات عدوى Wolbachia داخل الخلايا للأنواع المضيفة الأخرى. الطريقة الأولى ، PCR - وهي تقنية قوية تسمح بالتضخيم الأنزيمي لمناطق محددة من الحمض النووي دون استخدام إجراءات الاستنساخ التقليدية - تم استخدامها للكشف عن الحمض النووي Wolbachia وتحديد وجود / عدم وجود عدوى Wolbachia 22. تقيس الطريقة الثانية كثافة نسخ الحمض النووي Wolbachia باستخدام PCR الكمي (qPCR) للكشف والقياس الموثوق للمنتجات التي تم إنشاؤها خلال كل دورة PCR والتي تتناسب طرديا مع كمية القالب قبل PCR23. تكتشف الطريقة الثالثة وجود بروتينات Wolbachia داخل الخلايا ، باستخدام اللطخة الغربية - واحدة من أقوى الأدوات للكشف عن بروتينات محددة في مخاليط معقدة من خلال الجمع بين قوة الفصل العالية للرحلان الكهربائي ، وخصوصية الأجسام المضادة ، وحساسية التفاعلات الأنزيمية اللونية. الطريقة النهائية هي اختبار التألق المناعي (IFA) الذي يجمع بين علم المناعة والكيمياء الحيوية والفحص المجهري للكشف عن بروتين سطح Wolbachia (wsp) من خلال تفاعل الأجسام المضادة المستضدية لتأكيد الامتصاص الخلوي ل Wolbachia وتحديد توطينه الخلوي.
تصف هذه الورقة الطرق الأربع المذكورة أعلاه للتحقق من وجود Wolbachia في الخلايا ، والتي يمكن استخدامها للكشف عما إذا كان Wolbachia الخارجي قد تم نقله بنجاح وتم مسح Wolbachia في الخلية. بعد تحديد ما إذا كانت Wolbachia موجودة في الخلايا أم لا ، يمكن إجراء مجموعة متنوعة من التحليلات المختلفة ، بما في ذلك علم الجينوم أو البروتيوميات أو الأيض. يوضح هذا البروتوكول اكتشاف Wolbachia من خلال خلايا Aa23 ولكن يمكن استخدامه أيضا في خلايا أخرى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SteREO Discovery V8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Pipetman</td>
			<td>F167380</td>
			<td>P10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cerium doped yttrium aluminum garnet</td>
			<td>MSE Supplies</td>
			<td></td>
			<td>Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip holder</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Cargille Laboratories</td>
			<td>16482</td>
			<td>Type A low viscosity 150 cSt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR light source&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LED1085L</td>
			<td>LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outer ring&#160;</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump lasers&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LD785-SE400</td>
			<td>785 nm, 400 mW, &#216;9 mm, E Pin Code, Laser Diode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raspberry Pi</td>
			<td>Raspberry Pi Fundation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td>SM1 retaining ring for &#216;1&#34; lens tubes and mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedless quartz crystal</td>
			<td>University Wafers, Inc.</td>
			<td>U01-W2-L-190514</td>
			<td>25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shim</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray beam stop</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines

باعتبارها تكافلا داخليا مؤمنا للأمهات ، تصيب Wolbachia نسبا كبيرة من مجموعات الحشرات. وقد أفادت الدراسات مؤخرا عن التنظيم الناجح لانتقال فيروس الحمض النووي الريبي باستخدام البعوض المنقول من ولبخيا. وتشمل الاستراتيجيات الرئيسية للسيطرة على الفيروسات التلاعب بتكاثر المضيف عن طريق عدم التوافق السيتوبلازمي وتثبيط النسخ الفيروسية عن طريق التحضير المناعي والتنافس على الموارد المشتقة من المضيف. ومع ذلك ، فإن الآليات الأساسية لاستجابات البعوض المنقول من Wolbachia للعدوى الفيروسية غير مفهومة بشكل جيد. تقدم هذه الورقة بروتوكولا للتعرف في المختبر على عدوى الولبخية على مستويات الحمض النووي والبروتين في خلايا الزاعجة البيضاء (Diptera: Culicidae) Aa23 لتعزيز فهم التفاعلات بين Wolbachia وناقلات الحشرات الخاصة بها. من خلال الاستخدام المشترك لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، و PCR الكمي ، واللطخة الغربية ، والطرق التحليلية المناعية ، تم وصف بروتوكول مورفولوجي قياسي للكشف عن الخلايا المصابة ب Wolbachia وهو أكثر دقة من استخدام طريقة واحدة. يمكن أيضا تطبيق هذا النهج للكشف عن عدوى Wolbachia في أنواع الحشرات الأخرى.

قبل اكتشاف Wolbachia ، تمت ملاحظة خلايا Aa23 و Aa23-T تحت المجهر الضوئي لتحديد أي اختلافات مورفولوجية بين خطي الخلية. تحتوي خلايا Aa23 و Aa23-T على مورفولوجيا خليتين على الأقل ولكن لا يوجد فرق مورفولوجي واضح بين نوعي الخلايا (الشكل 1). هنا ، تم استخدام خلايا Aa23 كنظام نموذجي ل?...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

تم استخدام أربع طرق للكشف عن Wolbachia داخل الخلايا ، والتي تكمل بعضها البعض وتحسن دقة الكشف عن عدوى Wolbachia من الزاعجة المشتقة من Aedes albopictus Aa23 و Aa23-T التي تم علاجها من عدوى Wolbachia الأصلية باستخدام المضادات الحيوية.

الكشف عن سلالة Wolbachia wAlbB في خطوط خلايا الزاعجة البيضاء

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

يساعد هذا البروتوكول على التحقق من وجود Wolbachia في الخلايا ، وهو أساس فهم التفاعل بين Wolbachia ومضيفها. في هذا البروتوكول ، تم استخدام أربع طرق للكشف بنجاح عن عدوى Wolbachia داخل الخلايا ، والتي أكدت وحسنت دقة الكشف عن عدوى Wolbachia للخلايا. سيوضح الإجراء Qiuqiu Xiao ، وهو خريج من المختبر الرئيسي لبيولوجيا مسببات الأمراض الحديثة وخصائصها.ابدأ بمراقبة خلايا Aa23 و Aa23-T غير الملطخة عند تكبير 100x باستخدام المجهر الضوئي. استزرع الخلايا لمدة خمسة إلى سبعة أيام للوصول إلى 70 إلى 80٪ من الالتقاء لكل قارورة. باستخدام ماصة ، انقل 1 مل من وسط الثقافة إلى أنبوب طرد مركزي صغير.جهاز طرد مركزي في 100 RCF لمدة خمس دقائق لحصاد الخلايا. قم بإزالة السوبرناتانت وتخزين حبيبات الخلايا الناتجة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. استزرع الخلايا لمدة خمسة إلى سبعة أيام للوصول إلى 90 إلى 100٪ التقاء لكل قارورة.أعد تعليق الكريات في 0.40 مل من PBS وانقل 50 ميكرولتر من هذا المحلول إلى أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق. أضف خمسة ميكرولترات من 20 ملغم / مل بروتين K واحتضنها عند 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم احتضان الأنابيب عند 99 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للحصول على الحمض النووي الخام وتخزينه عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، قم بإعداد خليط تفاعل إجمالي من 20 ميكرولتر وقم بتعيين شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح في مخطوطة النص. اكتشف الحمض النووي على هلام الأغاروز بنسبة 1٪ باستخدام جهاز تصوير هلام. قم بإجراء تضخيم PCR الكمي باستخدام TB Green في نظام PCR في الوقت الفعلي وسجل نتائج كل تفاعل.تحليل الحمض النووي في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر وتعيين شروط PCR الكمية كما هو موضح في مخطوطة النص. احسب أرقام نسخ الجينات WSP و RPS6 في الخلايا وفقا للمنحنى القياسي المحدد. ثم احسب الكثافة النسبية ل Wolbachia بواسطة عدد نسخ wsp/RPS6.تحليل البيانات باستخدام اختبار t عينات مستقل. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى حبيبة الخلية واحتضنها على الثلج لمدة 30 دقيقة. الطرد المركزي للليزات في 12،000 RCF لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية وشفط supernatant.قم بتحليل تركيز wsp لل supernatant باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بتحميل كميات متساوية من البروتين على جل SDS-PAGE بنسبة 15٪. انقل البروتين إلى أغشية النيتروسليلوز وقم بسد الأغشية بحليب منزوع الدسم بنسبة 5٪ لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.ثم اغسل الأغشية ثلاث مرات باستخدام TBST. احتضان الأغشية بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة ل wsp المحضرة عن طريق تخفيف الجسم المضاد الأساسي بحليب منزوع الدسم بنسبة 5٪. اغسل الجسم المضاد الأساسي ثلاث مرات باستخدام TBST.أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع بيروكسيديز الفجل إلى الأغشية واحتضنها على شاكر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الأغشية ثلاث مرات باستخدام TBST وامزج 20 ميكرولتر من المحلول A و 20 ميكرولتر من المحلول B في مجموعة الكشف عن التلألؤ الكيميائي بنسبة واحد إلى واحد. اغمر الغشاء بأكمله في محلول التلألؤ في وقت واحد وراقب الإشارات باستخدام نظام تصوير متعدد الوظائف.على طبق بتري متحد البؤرة بالليزر ، احتضن خلايا Aa23 و Aa23-T لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام عند 28 درجة مئوية تحت 5٪ من ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي. عندما تصل الخلية إلى 60 إلى 70٪ من الالتقاء ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS. إصلاح الخلايا في مل واحد من 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.اغسل الخلايا الثابتة باستخدام PBST لمدة خمس دقائق وأعد غسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. احتضن طبق بتري في مل واحد من ألبومين مصل البقر بنسبة 3٪ لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة للفئران ومصل الفأر إلى الشرائح واحتضنها بين عشية وضحاها في صندوق رطب عند أربع درجات مئوية.أخرج طبق بتري من الصندوق الرطب وأعده إلى درجة حرارة الغرفة. اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS وقم بإزالة PBS. حماية الإجراءات التالية من الضوء.احتضن طبق بتري مع 100 ميكرولتر من الجسم المضاد للماعز المقترن بالكسا فلور 488 عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. احتضن عينة طبق بتري مع 50 ميكرولتر من DAPI المخفف في PBS إلى 10 ميكروغرام / مل عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ثم اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS. راقب التلطيخ المناعي تحت المجهر البؤري.قبل اكتشاف Wolbachia ، لوحظت خلايا Aa23 و Aa23-T تحت المجهر الضوئي لتحديد الاختلافات المورفولوجية بين خطي الخلية. كان لدى خلايا Aa23 و AA23-T مورفولوجيا خليتان على الأقل ولكن لم يتم ملاحظة أي اختلافات مورفولوجية واضحة بين نوعي الخلايا. باستخدام الاشعال التشخيصية 81F / 691R ، تم الكشف عن تضخيم إيجابي لجين Wolbachia wsp في خلايا Aa23 ولكن ليس في خلايا Aa23-T.أظهر تحليل كثافة Wolbachia في خطوط الخلايا نسبة wsp / rps6 من 2.4 في خلايا Aa23 ولكن لا Wolbachia في خلايا Aa23-T. أظهر تحليل اللطخة الغربية لمستخلصات البروتين إشارة wsp قوية ل Aa23 ولكن لم يتم اكتشاف أي إشارة ل Aa23-T. كشف فحص التألق المناعي غير المباشر عن بروتين wsp في خلايا Aa23 ، في حين تم اكتشاف الحمض النووي الملون ب DAPI فقط في خلايا Aa23-T.تأكد من احتضان قوارير الاستزراع عند 28 درجة مئوية تحت 5٪ من ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي لمدة خمسة إلى سبعة أيام. يمكن اتباع هذا الإجراء بواسطة المجهر الإلكتروني حيث يحتاج المرء إلى إيلاء اهتمام خاص لإعداد العينات وتقسيمها. أكدت الطرق التجريبية الأربع المستخدمة في هذه الدراسة دقة الكشف عن عدوى Wolbachia في الخلايا ، والتي تنطبق أيضا على أنواع أخرى من الخلايا والأنسجة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

اشتقاق خطوط التوتة تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية من أجهزة الصراف الآلي -- / --</sup و البروتين p53 -- / --</sup الفئران

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

إنشاء فيروس ابشتاين بار النمو وتحولت خطوط الخليوي Lymphoblastoid

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

كشف الجليكوجين في خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى مع الدوري حمض شيف تلطيخ

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

الوقاية من الإجهاد الحراري الآثار السلبية في الجرذان التي كتبها<emالعصوية الرقيقة&gt;</em&gt; الانفعال

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

كشف اللحاء شظايا خلال البكتيرية سبور الإنبات

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

وبسيط خلية الدم الحمراء تحلل طريقة لإنشاء خطوط الخلايا B Lymphoblastoid

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

طريقة فعالة وبسيطة وضع ناغورني كاراباخ وخطوط الخلايا T من المرضى المصابين بالعدوى المزمنة النشطة فيروس ابشتاين-بار

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

طرق "كشف السامة للخلايا أميلويدس التالية العدوى من الرئة خلايا بطانية" الزائفة الزّنجاريّة

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

تحليلات كفاءة النواقل على بعوض Aedes aegypti باستخدام فيروس زيكا

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

انتشار الطفيلي Microsporidian Edhazardia aedis في Aedes aegypti البعوض

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...