Name: detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

Vi takker Dr. Xin-Ru Wang fra University of Minnesota for indsigtsfulde forslag og vejledning. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr. 81760374).

1. Materialer og reagenser
<ol><li>Brug pyrogenfrie opløsninger og medier til cellekultur (se materialetabellen).</li>
	<li>Brug ultrarent vand til at forberede alle opløsninger.</li>
	<li>Vær forsigtig med at vælge føtalt bovint serum (FBS) til cellekultur efter en massekontrolproces. BEMÆRK: Da FBS-partier kan ændres regelmæssigt, er det umuligt at angive de relevante katalog- og lotnumre i denne protokol.</li>
	<li>Vælg Aa23-cellestammer afledt af A. albopictus-æg</...

<ol>
	<li>Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+crowding+and+temperature+on+Wolbachia+infection+density+among+life+cycle+stages+of+Aedes+albopictus.">Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus.</a> Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).</li><li>Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+superinfections+and+the+expression+of+cytoplasmic+incompatibility.">Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility.</a> Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).</li><li>Dobson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+distributed+throughout+insect+somatic+and+germ+line+tissues.">Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).</li><li>O'Neill, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+Wolbachia+pipientis+in+an+Aedes+albopictus+cell+line.">In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line.</a> Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).</li><li>Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+Wolbachia+wAlbB+endosymbiont+of+Aedes+albopictus.">Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus.</a> Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).</li><li>Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+and+cytoplasmic+incompatibility+in+mosquitoes.">Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).</li><li>Fallon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+properties+of+an+Aedes+albopictus+mosquito+cell+line+infected+with+Wolbachia+strain+wAlbB.">Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB.</a> In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).</li><li>Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+species+are+infected+with+Wolbachia?-A+statistical+analysis+of+current+data.">How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data.</a> Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).</li><li>Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia:+master+manipulators+of+invertebrate+biology.">Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology.</a> National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).</li><li>Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Wolbachia+infections+in+Southeast+Asian+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae).">Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).</li><li>O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).</li><li>McGraw, E. A., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+insecticides:+new+thinking+on+an+ancient+problem.">Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem.</a> National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).</li><li>Bourtzis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+mosquito-Wolbachia+symbiosis+for+vector+and+disease+control.">Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control.</a> Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).</li><li>Turelli, M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+an+inherited+incompatibility+factor+in+California+Drosophila.">Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila.</a> Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).</li><li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission.">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li><li>Walker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wMel+Wolbachia+strain+blocks+dengue+and+invades+caged+Aedes+aegypti+populations.">The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations.</a> Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).</li><li>Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+virulent+and+inhibit+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+in+Anopheles+gambiae.">Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).</li><li>Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endosymbiotic+bacterium+Wolbachia+induces+resistance+to+dengue+virus+in+Aedes+aegypti.">The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).</li><li>Moreira, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wolbachia+symbiont+in+Aedes+aegypti+limits+infection+with+dengue,+Chikungunya,+and+Plasmodium.">A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium.</a> Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).</li><li>Caragata, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+cholesterol+modulates+pathogen+blocking+by+Wolbachia.">Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).</li><li>Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+uses+a+host+microRNA+to+regulate+transcripts+of+a+methyltransferase,+contributing+to+dengue+virus+inhibition+in+Aedes+aegypti.">Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).</li><li>Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya-Wolbachia+interplay+in+Aedes+albopictus.">Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus.</a> Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).</li><li>Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+induces+density-dependent+inhibition+to+dengue+virus+in+mosquito+cells.">Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).</li><li>Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Culicoides+sonorensis+biting+midge+cell+lines+with+Wolbachia+pipientis.">Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis.</a> Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).</li><li>Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+PCR-based+classification+of+Wolbachia+strains+using+wsp+gene+sequences.">Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.</a> The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).</li><li>Park, M. S., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+PaAtg8+and+roles+of+autophagy+in+adaptation+to+starvation+with+respect+to+the+fat+body+and+midgut+of+the+Americana+cockroach,+Periplaneta+americana.">Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).</li><li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin.">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody.">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li><li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti.">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li><li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence,+Western+blotting,+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever.">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li></ol>

Påvisning af intracellulær Wolbachia-infektion er afgørende for undersøgelsen af Wolbachia-værtsinteraktioner og bekræftelsen af vellykket transfektion af celler med nye stammer. I denne protokol blev fire metoder anvendt til succesfuldt at detektere intracellulær Wolbachia-infektion ved nukleinsyre- og proteinniveauerne. Disse fire eksperimentelle metoder bekræftede og forbedrede detektionsnøjagtigheden af Wolbachia-infektion af celler. 
PCR blev b...

Den asiatiske tigermyg Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), som er en nøglevektor for denguevirus (DENV) i Asien og andre dele af verden1, er en naturlig vært for to typer af de intracellulære bakterier, Wolbachia (wAlbA og wAlbB), som er fordelt over hele kimlinjen og somatisk væv 2,3. Aa23-cellelinjen afledt af A. albopictus-embryoner består af mindst to morfologiske celletyper, som begge understøtter infektion4 og kan helbredes for indfødt Wolbachia-infektion ved hjælp af antibiotika (Aa23-T). I betragtning af at Aa23 kun bevarer wAlbB, er det en nyttig model til undersøgelse af vært-endosymbiontinteraktioner 4,5,6.
Wolbachia overføres moderen og inficerer anslået 65% afinsektarterne 8,9 og 28% af myggene10. Det inficerer en række væv og danner et intimt symbiotisk forhold til værten, hvilket normalt inducerer cytoplasmisk inkompatibilitet (CI)11 og populationsudskiftning ved at manipulere værts reproduktive system12,13. Disse værtsresponser er blevet observeret i naturlige populationer af Drosophila simulans14 og i A. aegypti i et laboratoriebur og feltforsøg15. En vigtig ikke-produktiv manipulation fremkaldt af Wolbachia er induceret værtsresistens over for en række patogener, herunder DENV, Chikungunya-virus (CHIKV) og West Nile-virus (WNV)16,17, der kan medieres af et forbedret medfødt immunsystem af symbionten 18,19, konkurrence mellem Wolbachia og vira om væsentlige værtsressourcer20 og manipulation af værtsvirusforsvarsveje21 .
Denne protokol er udviklet til at studere disse underliggende mekanismer for Wolbachia-inducerede værts antivirale reaktioner. Det bruger fire metoder til påvisning af intracellulær Wolbachia-infektion af Aa23-celler. Disse metoder giver et stærkt teoretisk grundlag for undersøgelser af intracellulær Wolbachia-infektion af andre værtsarter. Den første metode, PCR - en kraftfuld teknik, der muliggør enzymatisk amplifikation af specifikke regioner af DNA uden at anvende konventionelle kloningsprocedurer - blev brugt til at detektere Wolbachia DNA og bestemme tilstedeværelsen / fraværet af Wolbachia-infektion 22. Den anden metode måler Wolbachia DNA-kopitæthed ved hjælp af kvantitativ PCR (qPCR) til pålidelig påvisning og måling af produkter genereret under hver PCR-cyklus, der er direkte proportional med mængden af skabelon før PCR23. Den tredje metode detekterer tilstedeværelsen af intracellulære Wolbachia-proteiner ved hjælp af western blot-et af de mest kraftfulde værktøjer til påvisning af specifikke proteiner i komplekse blandinger ved at kombinere elektroforesens høje separationskraft, antistoffernes specificitet og følsomheden af kromoogene enzymatiske reaktioner. Den endelige metode er et immunofluorescensassay (IFA), der kombinerer immunologi, biokemi og mikroskopi for at detektere Wolbachia-overfladeproteinet (wsp) gennem en antigen-antistofreaktion for at bekræfte den cellulære optagelse af Wolbachia og bestemme dens cellulære lokalisering.
Dette papir beskriver de fire metoder, der er anført ovenfor for at verificere eksistensen af Wolbachia i cellerne, som kan bruges til at detektere, om den eksogene Wolbachia blev transficeret med succes, og Wolbachia i cellen blev ryddet. Efter at have fastslået, om Wolbachia er til stede i cellerne eller ej, kan der udføres en række forskellige analyser, herunder genomik, proteomik eller metabolomics. Denne protokol demonstrerer påvisning af Wolbachia gennem Aa23-celler, men kan også anvendes i andre celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SteREO Discovery V8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Pipetman</td>
			<td>F167380</td>
			<td>P10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cerium doped yttrium aluminum garnet</td>
			<td>MSE Supplies</td>
			<td></td>
			<td>Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip holder</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Cargille Laboratories</td>
			<td>16482</td>
			<td>Type A low viscosity 150 cSt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR light source&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LED1085L</td>
			<td>LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outer ring&#160;</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump lasers&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LD785-SE400</td>
			<td>785 nm, 400 mW, &#216;9 mm, E Pin Code, Laser Diode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raspberry Pi</td>
			<td>Raspberry Pi Fundation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td>SM1 retaining ring for &#216;1&#34; lens tubes and mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedless quartz crystal</td>
			<td>University Wafers, Inc.</td>
			<td>U01-W2-L-190514</td>
			<td>25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shim</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray beam stop</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines

Som en moderligt forankret endosymbiont inficerer Wolbachia store andele af insektpopulationer. Undersøgelser har for nylig rapporteret den vellykkede regulering af RNA-virusoverførsel ved hjælp af Wolbachia-transinficerede myg. Nøglestrategier til bekæmpelse af vira inkluderer manipulation af værtsgengivelse via cytoplasmisk inkompatibilitet og hæmning af virale transkripter via immunpriming og konkurrence om værtsafledte ressourcer. Imidlertid er de underliggende mekanismer for reaktionerne fra Wolbachia-transinficerede myg til virusinfektion dårligt forstået. Dette papir præsenterer en protokol til in vitro identifikation af Wolbachia-infektion ved nukleinsyre- og proteinniveauerne i Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-celler for at forbedre forståelsen af interaktionerne mellem Wolbachia og dets insektvektorer. Gennem kombineret anvendelse af polymerasekædereaktion (PCR), kvantitativ PCR, western blot og immunologiske analysemetoder er der beskrevet en standardmorfologisk protokol til påvisning af Wolbachia-inficerede celler, der er mere nøjagtig end brugen af en enkelt metode. Denne fremgangsmåde kan også anvendes til påvisning af Wolbachia-infektion i andre insekttaxa.

Før Wolbachia blev detekteret, blev Aa23- og Aa23-T-celler observeret under et lysmikroskop for at bestemme eventuelle morfologiske forskelle mellem de to cellelinjer. Aa23- og Aa23-T-celler har mindst to cellemorfologier, men ingen åbenbar morfologisk forskel mellem de to celletyper (figur 1). Her blev Aa23-celler brugt som et modelsystem til at detektere Wolbachia-infektion ved hjælp af fire metoder. Positiv forstærkning af Wolbachiawsp-genet...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Fire metoder blev brugt til at detektere intracellulær Wolbachia, som supplerede hinanden og forbedrede detektionsnøjagtigheden af Wolbachia-infektion af Aedes albopictus-afledt Aa23 og Aa23-T helbredt af native Wolbachia-infektion ved hjælp af antibiotika.

Påvisning af Wolbachia-stamme wAlbB i Aedes albopictus-cellelinjer

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Denne protokol hjælper med at verificere eksistensen af Wolbachia i celler, hvilket er grundlaget for at forstå samspillet mellem Wolbachia og dets vært. I denne protokol blev fire metoder anvendt til succesfuldt at detektere intracellulær Wolbachia-infektion, hvilket bekræftede og forbedrede detektionsnøjagtigheden af Wolbachia-infektion af celler. Demonstration af proceduren vil være Qiuqiu Xiao, en postgraduate fra Key Laboratory of Modern Pathogen Biology and Characteristics.Begynd med at observere ufarvede Aa23- og Aa23-T-celler ved 100x forstørrelse ved hjælp af lysmikroskopi. Cellerne dyrkes i fem til syv dage for at nå 70 til 80% sammenløb pr. Kolbe. Brug en pipette til at overføre 1 ml af kulturmediet til et mikrocentrifugerør.Centrifuger ved 100 RCF i fem minutter for at høste cellerne. Fjern supernatanten og opbevar den resulterende cellepellet ved minus 20 grader Celsius. Cellerne dyrkes i fem til syv dage for at nå 90 til 100% sammenløb pr. Kolbe.Pellets resuspenderes i 0,40 ml PBS, og 50 mikroliter af denne opløsning overføres til et mikrocentrifugerør. Tilsæt fem mikroliter af 20 mg / ml proteinase K og inkuberes ved 55 grader Celsius i en time. Derefter inkuberes rørene ved 99 grader Celsius i 15 minutter for at opnå det rå DNA og opbevar det ved minus 20 grader Celsius.For at udføre PCR skal du forberede en samlet reaktionsblanding på 20 mikroliter og indstille PCR-betingelserne som beskrevet i tekstmanuskriptet. Registrer DNA'et på en 1% agarosegel ved hjælp af et gelbillede. Udfør kvantitativ PCR-forstærkning ved hjælp af TB Green i et REALTIDS PCR-system, og registrer resultaterne af hver reaktion.Analyser DNA'et i et samlet reaktionsvolumen på 20 mikroliter og indstil de kvantitative PCR-betingelser som beskrevet i tekstmanuskriptet. Beregn WSP- og RPS6-genkopinumrene i cellerne i henhold til den etablerede standardkurve. Beregn derefter Wolbachia relative tæthed med kopinummeret wsp / RPS6.Analyser dataene ved hjælp af en uafhængig stikprøve t-test. Tilsæt 200 mikroliter lysisbuffer til cellepillen og inkuberes på is i 30 minutter. Centrifuger lysaterne ved 12.000 RCF i 10 minutter ved fire grader Celsius og aspirerer supernatanten.Analyser wsp-koncentrationen af supernatanten ved hjælp af et BCA-proteinassaysæt efter producentens anvisninger. Indfør lige store mængder protein på en 15% SDS-PAGE gel. Overfør proteinet til nitrocellulosemembraner og bloker membranerne med 5% skummetmælk i to timer ved stuetemperatur.Vask derefter membranerne tre gange med TBST. Membranerne inkuberes natten over ved 4 grader Celsius med 100 mikroliter polyklonalt antistof fremstillet ved fortynding af det primære antistof med 5% skummetmælk. Vask det primære antistof tre gange med TBST.Tilsæt 100 mikroliter peberrodperoxidasekonjugeret sekundært antistof til membranerne og inkuber det på en ryster i en time ved stuetemperatur. Membranerne vaskes tre gange med TBST, og 20 mikroliter opløsning A og 20 mikroliter opløsning B blandes i kemiluminescensdetekteringssættet i et forhold mellem en og en. Nedsænk hele membranen i luminescensopløsningen samtidigt og observer signalerne ved hjælp af et multifunktionelt billeddannelsessystem.På en laserkonfokal petriskål inkuberes Aa23- og Aa23-T-celler i tre til fire dage ved 28 grader Celsius under 5% atmosfærisk kuldioxid. Når cellen når 60 til 70% sammenløb, vaskes cellerne tre gange med PBS. Fastgør cellerne i en ml 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved fire grader Celsius.De faste celler vaskes med PBST i fem minutter, og cellerne vaskes to gange med PBS. Petriskålen inkuberes i en ml 3% bovint serumalbumin i en time ved 37 grader Celsius. Tilsæt 100 mikroliter museantiwsp polyklonalt antistof og museserum til diasene og inkuber det natten over i en våd kasse ved fire grader Celsius.Fjern petriskålen fra vådkassen og returner den til stuetemperatur. Vask dem tre gange med PBS, og fjern PBS'et. Beskyt følgende procedurer mod lys.Inkuber petriskålen med 100 mikroliter af et Alexa Fluor 488-konjugeret gede-antimuseantistof ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Prøven petriskål inkuberes med 50 mikroliter DAPI fortyndet i PBS til 10 mikrogram/ml ved 37 grader Celsius i fem minutter, og de vaskes derefter tre gange med PBS. Overhold immunostaining under et konfokalt mikroskop.Før påvisning af Wolbachia blev Aa23- og Aa23-T-celler observeret under et lysmikroskop for at bestemme morfologiske forskelle mellem de to cellelinjer. Aa23- og AA23-T-cellerne havde mindst to cellemorfologier, men der blev ikke observeret nogen tilsyneladende morfologiske forskelle mellem de to celletyper. Ved anvendelse af de diagnostiske primere 81F/691R blev positiv amplifikation af Wolbachia wsp-genet påvist i Aa23-celler, men ikke i Aa23-T-celler.Analysen af Wolbachia-tætheden i cellelinjerne viste et wsp / rps6-forhold på 2,4 i Aa23-celler, men ingen Wolbachia i Aa23-T-celler. Western blot-analyse af proteinekstrakter viste et stærkt wsp-signal for Aa23, men der blev ikke påvist noget signal for Aa23-T. Det indirekte immunfluorescensassay detekterede wsp-proteinet i Aa23-celler, mens kun DAPI-farvet DNA blev påvist i Aa23-T-celler.Sørg for, at kulturkolberne inkuberes ved 28 grader Celsius under 5% atmosfærisk kuldioxid i fem til syv dage. Denne procedure kan efterfølges af elektronmikroskopi, hvor man skal være særlig opmærksom på prøveforberedelse og sektionering. De fire eksperimentelle metoder, der blev anvendt i denne undersøgelse, bekræftede detektionsnøjagtigheden af Wolbachia-infektion i celler, hvilket også gælder for andre typer celler og væv.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Etablering af Epstein-Barr virus Vækst-transformerede lymfoblastoide cellelinjer

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Afsløring glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodic Acid Schiff Farvning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Forebyggelse af varmestress bivirkninger i rotter ved<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Strain

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Afsløring Cortex Fragmenter Under Bakteriel Spore Spiring

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

En simpel Red Blood Cell Lysis metode til fastsættelse af B lymfoblastoidcellelinier

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

En effektiv og enkel metode til at etablere NK og T-cellelinier fra patienter med kronisk aktiv Epstein - Barr virusinfektion

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Metoder til påvisning af cytotoksiske Amyloids følgende infektion af pulmonal endotelceller af Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vektor kompetence analyser på Aedes aegypti Myg ved hjælp af Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Udbredelse af microsporidian parasit Edhazardia aedis i Aedes aegypti Myg

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...