Name: detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

We bedanken Dr. Xin-Ru Wang van de Universiteit van Minnesota voor inzichtelijke suggesties en begeleiding. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (No.81760374).

1. Materialen en reagentia
<ol><li>Gebruik pyrogene oplossingen en media voor celkweek (zie de Tabel van Materialen).</li>
	<li>Gebruik ultrapuur water om alle oplossingen voor te bereiden.</li>
	<li>Wees voorzichtig bij het selecteren van foetaal runderserum (FBS) voor celkweek, na een veelcontroleproces. OPMERKING: Aangezien FBS-partijen regelmatig kunnen worden gewijzigd, is het onmogelijk om de relevante catalogus en lotnummers in dit protocol te vermelden.</li>
	<li>Selecteer A...

<ol>
	<li>Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+crowding+and+temperature+on+Wolbachia+infection+density+among+life+cycle+stages+of+Aedes+albopictus.">Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus.</a> Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).</li><li>Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+superinfections+and+the+expression+of+cytoplasmic+incompatibility.">Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility.</a> Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).</li><li>Dobson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+distributed+throughout+insect+somatic+and+germ+line+tissues.">Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).</li><li>O'Neill, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+Wolbachia+pipientis+in+an+Aedes+albopictus+cell+line.">In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line.</a> Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).</li><li>Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+Wolbachia+wAlbB+endosymbiont+of+Aedes+albopictus.">Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus.</a> Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).</li><li>Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+and+cytoplasmic+incompatibility+in+mosquitoes.">Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).</li><li>Fallon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+properties+of+an+Aedes+albopictus+mosquito+cell+line+infected+with+Wolbachia+strain+wAlbB.">Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB.</a> In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).</li><li>Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+species+are+infected+with+Wolbachia?-A+statistical+analysis+of+current+data.">How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data.</a> Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).</li><li>Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia:+master+manipulators+of+invertebrate+biology.">Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology.</a> National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).</li><li>Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Wolbachia+infections+in+Southeast+Asian+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae).">Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).</li><li>O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).</li><li>McGraw, E. A., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+insecticides:+new+thinking+on+an+ancient+problem.">Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem.</a> National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).</li><li>Bourtzis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+mosquito-Wolbachia+symbiosis+for+vector+and+disease+control.">Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control.</a> Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).</li><li>Turelli, M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+an+inherited+incompatibility+factor+in+California+Drosophila.">Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila.</a> Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).</li><li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission.">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li><li>Walker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wMel+Wolbachia+strain+blocks+dengue+and+invades+caged+Aedes+aegypti+populations.">The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations.</a> Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).</li><li>Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+virulent+and+inhibit+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+in+Anopheles+gambiae.">Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).</li><li>Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endosymbiotic+bacterium+Wolbachia+induces+resistance+to+dengue+virus+in+Aedes+aegypti.">The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).</li><li>Moreira, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wolbachia+symbiont+in+Aedes+aegypti+limits+infection+with+dengue,+Chikungunya,+and+Plasmodium.">A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium.</a> Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).</li><li>Caragata, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+cholesterol+modulates+pathogen+blocking+by+Wolbachia.">Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).</li><li>Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+uses+a+host+microRNA+to+regulate+transcripts+of+a+methyltransferase,+contributing+to+dengue+virus+inhibition+in+Aedes+aegypti.">Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).</li><li>Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya-Wolbachia+interplay+in+Aedes+albopictus.">Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus.</a> Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).</li><li>Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+induces+density-dependent+inhibition+to+dengue+virus+in+mosquito+cells.">Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).</li><li>Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Culicoides+sonorensis+biting+midge+cell+lines+with+Wolbachia+pipientis.">Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis.</a> Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).</li><li>Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+PCR-based+classification+of+Wolbachia+strains+using+wsp+gene+sequences.">Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.</a> The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).</li><li>Park, M. S., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+PaAtg8+and+roles+of+autophagy+in+adaptation+to+starvation+with+respect+to+the+fat+body+and+midgut+of+the+Americana+cockroach,+Periplaneta+americana.">Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).</li><li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin.">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody.">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li><li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti.">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li><li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence,+Western+blotting,+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever.">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li></ol>

Detectie van intracellulaire Wolbachia-infectie is essentieel voor de studie van Wolbachia-gastheerinteracties en de bevestiging van succesvolle transfectie van cellen met nieuwe stammen. In dit protocol werden vier methoden gebruikt om intracellulaire Wolbachia-infectie met succes te detecteren op het nucleïnezuur- en eiwitniveau. Deze vier experimentele methoden bevestigden en verbeterden de detectienauwkeurigheid van Wolbachia-infectie van cellen. 
PCR w...

De Aziatische tijgermug Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), een belangrijke vector van het denguevirus (DENV) in Azië en andere delen van de wereld1, is een natuurlijke gastheer van twee soorten intracellulaire bacteriën, Wolbachia (wAlbA en wAlbB), die verspreid zijn over de kiembaan en somatisch weefsel 2,3. De Aa23-cellijn afgeleid van A. albopictus-embryo's bestaat uit ten minste twee morfologische celtypen, die beide infectie4 ondersteunen en kunnen worden genezen van inheemse Wolbachia-infectie met behulp van antibiotica (Aa23-T). Aangezien Aa23 alleen albbbehoudt, is het een bruikbaar model voor de studie van gastheer-endosymbionten interacties 4,5,6.
Wolbachia wordt door de moeder overgedragen en infecteert naar schatting 65% van de insectensoorten 8,9 en 28% van de muggensoorten10. Het infecteert een verscheidenheid aan weefsels en vormt een intieme symbiotische relatie met de gastheer, meestal induceren cytoplasmatische incompatibiliteit (CI)11 en populatievervanging door het manipuleren van het voortplantingssysteem van de gastheer12,13. Deze gastheerresponsen zijn waargenomen in natuurlijke populaties van Drosophila simulans14 en in A. aegypti in een laboratoriumkooi en veldproef15. Een belangrijke niet-productieve manipulatie die door Wolbachia wordt uitgelokt, is geïnduceerde gastheerresistentie tegen een verscheidenheid aan pathogenen, waaronder DENV, Chikungunya-virus (CHIKV) en West-Nijlvirus (WNV)16,17, dat kan worden gemedieerd door een verbeterd aangeboren immuunsysteem van de symbiont18,19, concurrentie tussen Wolbachia en virussen voor essentiële gastheerbronnen20, en manipulatie van gastheer virale verdedigingsroutes21 .
Dit protocol is ontwikkeld voor het bestuderen van deze onderliggende mechanismen van Wolbachia-geïnduceerde gastheer antivirale responsen. Het maakt gebruik van vier methoden voor de detectie van intracellulaire Wolbachia-infectie van Aa23-cellen. Deze methoden bieden een sterke theoretische basis voor studies van intracellulaire Wolbachia-infectie van andere gastheersoorten. De eerste methode, PCR - een krachtige techniek die de enzymatische amplificatie van specifieke DNA-regio's mogelijk maakt zonder gebruik te maken van conventionele kloonprocedures - werd gebruikt om Wolbachia-DNA te detecteren en de aanwezigheid / afwezigheid van Wolbachia-infectie te bepalen 22. De tweede methode meet de dichtheid van Wolbachia DNA-kopieën met behulp van kwantitatieve PCR (qPCR) voor betrouwbare detectie en meting van producten die tijdens elke PCR-cyclus worden gegenereerd en die direct evenredig is met de hoeveelheid sjabloon vóór PCR23. De derde methode detecteert de aanwezigheid van intracellulaire Wolbachia-eiwitten , met behulp van western blot - een van de krachtigste hulpmiddelen voor het detecteren van specifieke eiwitten in complexe mengsels door de hoge scheidingskracht van elektroforese, de specificiteit van antilichamen en de gevoeligheid van chromogene enzymatische reacties te combineren. De laatste methode is een immunofluorescentietest (IFA) die immunologie, biochemie en microscopie combineert om het Wolbachia-oppervlakte-eiwit (wsp) te detecteren via een antigeen-antilichaamreactie om de cellulaire opname van Wolbachia te bevestigen en de cellulaire lokalisatie ervan te bepalen.
Dit artikel beschrijft de vier hierboven genoemde methoden om het bestaan van Wolbachia in de cellen te verifiëren, die kunnen worden gebruikt om te detecteren of de exogene Wolbachia met succes is getransfecteerd en de Wolbachia in de cel is gewist. Na het bepalen of Wolbachia al dan niet in de cellen aanwezig is, kunnen verschillende analyses worden uitgevoerd, waaronder genomics, proteomics of metabolomics. Dit protocol demonstreert de detectie van Wolbachia via Aa23-cellen, maar kan ook in andere cellen worden gebruikt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SteREO Discovery V8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Pipetman</td>
			<td>F167380</td>
			<td>P10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cerium doped yttrium aluminum garnet</td>
			<td>MSE Supplies</td>
			<td></td>
			<td>Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip holder</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Cargille Laboratories</td>
			<td>16482</td>
			<td>Type A low viscosity 150 cSt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR light source&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LED1085L</td>
			<td>LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outer ring&#160;</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump lasers&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LD785-SE400</td>
			<td>785 nm, 400 mW, &#216;9 mm, E Pin Code, Laser Diode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raspberry Pi</td>
			<td>Raspberry Pi Fundation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td>SM1 retaining ring for &#216;1&#34; lens tubes and mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedless quartz crystal</td>
			<td>University Wafers, Inc.</td>
			<td>U01-W2-L-190514</td>
			<td>25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shim</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray beam stop</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines

Als moederlijk gekoesterde endosymbiont infecteert Wolbachia grote delen van de insectenpopulaties. Studies hebben onlangs de succesvolle regulatie van RNA-virusoverdracht gemeld met behulp van Wolbachia-getransfecteerde muggen. Belangrijke strategieën om virussen te beheersen zijn de manipulatie van de reproductie van de gastheer via cytoplasmatische incompatibiliteit en de remming van virale transcripties via immuunpriming en concurrentie voor van de gastheer afgeleide bronnen. De onderliggende mechanismen van de reacties van Wolbachia-getransfecteerde muggen op virale infectie zijn echter slecht begrepen. Dit artikel presenteert een protocol voor de in vitro identificatie van Wolbachia-infectie op het nucleïnezuur- en eiwitgehalte in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-cellen om het begrip van de interacties tussen Wolbachia en zijn insectenvectoren te verbeteren. Door het gecombineerde gebruik van polymerasekettingreactie (PCR), kwantitatieve PCR, western blot en immunologische analytische methoden is een standaard morfologisch protocol beschreven voor de detectie van Wolbachia-geïnfecteerde cellen dat nauwkeuriger is dan het gebruik van een enkele methode. Deze aanpak kan ook worden toegepast op de detectie van Wolbachia-infectie in andere insectentaxa.

Voordat Wolbachia werd gedetecteerd, werden Aa23- en Aa23-T-cellen waargenomen onder een lichtmicroscoop om eventuele morfologische verschillen tussen de twee cellijnen te bepalen. Aa23- en Aa23-T-cellen hebben ten minste twee celmorfologieën, maar geen duidelijk morfologisch verschil tussen de twee celtypen (figuur 1). Hier werden Aa23-cellen gebruikt als een modelsysteem om Wolbachia-infectie te detecteren met behulp van vier methoden. Positieve amplific...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Vier methoden werden gebruikt om intracellulaire Wolbachia te detecteren, die elkaar aanvulden en de detectienauwkeurigheid van Wolbachia-infectie van Aedes albopictus-afgeleide Aa23 en Aa23-T genezen van inheemse Wolbachia-infectie met behulp van antibiotica verbeterden.

Detectie van Wolbachia Stam wAlbB in Aedes albopictus cellijnen

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Dit protocol helpt het bestaan van Wolbachia in cellen te verifiëren, wat de basis is voor het begrijpen van de interactie tussen Wolbachia en zijn gastheer. In dit protocol werden vier methoden gebruikt om intracellulaire Wolbachia-infectie met succes te detecteren, wat de detectienauwkeurigheid van Wolbachia-infectie van cellen bevestigde en verbeterde. De procedure wordt gedemonstreerd door Qiuqiu Xiao, een postdoctoraal van het Key Laboratory of Modern Pathogen Biology and Characteristics.Begin met het observeren van niet-gekleurde Aa23- en Aa23-T-cellen bij 100x vergroting met behulp van lichtmicroscopie. Kweek de cellen gedurende vijf tot zeven dagen om 70 tot 80% samenvloeiing per kolf te bereiken. Breng met behulp van een pipet 1 ml van het kweekmedium over naar een microcentrifugebuis.Centrifugeer op 100 RCF gedurende vijf minuten om de cellen te oogsten. Verwijder het supernatant en bewaar de resulterende celpellet bij min 20 graden Celsius. Kweek de cellen gedurende vijf tot zeven dagen om 90 tot 100% samenvloeiing per kolf te bereiken.Resuspendeer de pellets in 0,40 ml PBS en breng 50 microliter van deze oplossing over naar een microcentrifugebuis. Voeg vijf microliter 20 mg/ml proteïnase K toe en incubeer gedurende een uur bij 55 graden Celsius. Incubeer vervolgens de buizen bij 99 graden Celsius gedurende 15 minuten om het ruwe DNA te verkrijgen en bewaar het bij min 20 graden Celsius.Om PCR uit te voeren, bereidt u een totaal reactiemengsel van 20 microliter voor en stelt u de PCR-voorwaarden in zoals beschreven in het tekstmanuscript. Detecteer het DNA op een 1% agarose gel met behulp van een gel imager. Voer kwantitatieve PCR-versterking uit met TB Green in een real-time PCR-systeem en noteer de resultaten van elke reactie.Analyseer het DNA in een totaal reactievolume van 20 microliter en stel de kwantitatieve PCR-condities in zoals beschreven in het tekstmanuscript. Bereken de WSP- en RPS6-genkopienummers in de cellen volgens de vastgestelde standaardcurve. Bereken vervolgens de relatieve dichtheid van Wolbachia door het kopieernummer van wsp/RPS6.Analyseer de gegevens met behulp van een onafhankelijke t-test. Voeg 200 microliter lysisbuffer toe aan de celpellet en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Centrifugeer de lysaten op 12.000 RCF gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en adem het supernatant aan.Analyseer de wsp-concentratie van het supernatant met behulp van een BCA-eiwittestkit, volgens de instructies van de fabrikant. Laad gelijke hoeveelheden eiwit op een 15% SDS-PAGE gel. Breng het eiwit over naar nitrocellulosemembranen en blokkeer de membranen met 5% magere melk gedurende twee uur bij kamertemperatuur.Was vervolgens de membranen drie keer met TBST. Incubeer de membranen 's nachts bij 4 graden Celsius met 100 microliter anti-wsp polyklonaal antilichaam bereid door het primaire antilichaam te verdunnen met 5% magere melk. Was het primaire antilichaam drie keer met TBST.Voeg 100 microliter mierikswortelperoxidase-geconjugeerd secundair antilichaam toe aan de membranen en incubeer het op een shaker gedurende een uur bij kamertemperatuur. Was de membranen driemaal met TBST en meng 20 microliter oplossing A en 20 microliter oplossing B in de chemiluminescentiedetectiekit in een verhouding van één op één. Dompel het hele membraan tegelijkertijd onder in de luminescentieoplossing en observeer de signalen met behulp van een multifunctioneel beeldvormingssysteem.Op een Laser confocale petrischaal, incubeer Aa23 en Aa23-T cellen gedurende drie tot vier dagen bij 28 graden Celsius onder 5% atmosferische koolstofdioxide. Wanneer de cel 60 tot 70% samenvloeiing bereikt, wast u de cellen drie keer met PBS. Bevestig de cellen in één ml van 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.Was de vaste cellen met PBST gedurende vijf minuten en was de cellen twee keer opnieuw met PBS. Incubeer de petrischaal in één ml 3% runderserumalbumine gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Voeg 100 microliter anti-wsp polyklonaal antilichaam en muizenserum toe aan de dia's en incubeer het een nacht in een natte doos bij vier graden Celsius.Haal de petrischaal uit de natte doos en breng ze terug op kamertemperatuur. Was ze drie keer met PBS en verwijder de PBS. Bescherm de volgende procedures tegen licht.Incubeer de petrischaal met 100 microliter van een Alexa Fluor 488-geconjugeerd geitenantimuisantilichaam bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Incubeer het monster petrischaaltje met 50 microliter DAPI verdund in PBS tot 10 microgram / ml bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten en was ze vervolgens drie keer met PBS. Observeer de immunostaining onder een confocale microscoop.Voordat Wolbachia werd gedetecteerd, werden Aa23- en Aa23-T-cellen waargenomen onder een lichtmicroscoop om morfologische verschillen tussen de twee cellijnen te bepalen. De Aa23- en AA23-T-cellen hadden ten minste twee celmorfologieën, maar er werden geen duidelijke morfologische verschillen waargenomen tussen de twee celtypen. Met behulp van de diagnostische primers 81F/691R werd positieve amplificatie van het Wolbachia wsp-gen gedetecteerd in Aa23-cellen, maar niet in Aa23-T-cellen.De analyse van wolbachia-dichtheid in de cellijnen toonde een wsp/rps6-verhouding van 2,4 in Aa23-cellen, maar geen Wolbachia in Aa23-T-cellen. Western blot-analyse van eiwitextracten toonde een sterk wsp-signaal voor Aa23, maar er werd geen signaal gedetecteerd voor Aa23-T. De indirecte immunofluorescentietest detecteerde het wsp-eiwit in Aa23-cellen, terwijl alleen DAPI-gekleurd DNA werd gedetecteerd in Aa23-T-cellen.Zorg ervoor dat de kweekkolven gedurende vijf tot zeven dagen worden geïncubeerd bij 28 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide in de atmosfeer. Deze procedure kan worden gevolgd door elektronenmicroscopie waarbij men bijzondere aandacht moet besteden aan monstervoorbereiding en -sectie. De vier experimentele methoden die in deze studie werden gebruikt, bevestigden de detectienauwkeurigheid van Wolbachia-infectie in cellen, die ook van toepassing is op andere soorten cellen en weefsels.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Afleiding van thymus lymfoom T-cel-Lines uit Atm - / -</sup En P53 - / -</sup Muizen

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Oprichting van Epstein-Barr Virus Growth-getransformeerde lymfoblastoïde cellijnen

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Detecteren Glycogeen in perifeer bloed mononucleaire cellen met Periodic Acid Schiff kleuring

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Preventie van hittestress schadelijke effecten bij ratten door<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Strain

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Detecteren Cortex Fragmenten Tijdens Bacteriële Spore Kiemkracht

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A Simple Red Blood Cell Lysis Methode voor de oprichting van B lymfoblastoïde cellijnen

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Een efficiënte en eenvoudige methode om de NK- en T cellijnen van patiënten met chronische actieve Epstein - Barr virusinfectie

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methoden voor het opsporen van cytotoxische Amyloids volgende infectie van pulmonaire endotheliale cellen door Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met behulp van het Zika-virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Voortplanting van de Microsporidische Parasiet Edhazardia aedis in Aedes aegypti Muggen

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...