Name: detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

Nous remercions le Dr Xin-Ru Wang de l’Université du Minnesota pour ses suggestions et ses conseils perspicaces. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (No.81760374).

1. Matériaux et réactifs
<ol><li>Utilisez des solutions et des milieux sans pyrogène pour la culture cellulaire (voir le Tableau des matériaux).</li>
	<li>Utilisez de l’eau ultrapure pour préparer toutes les solutions.</li>
	<li>Soyez prudent dans le choix du sérum fœtal bovin (FBS) pour la culture cellulaire, en suivant un processus de vérification du lot. REMARQUE: Comme les lots FBS sont sujets à des changements réguliers, il est impossible d’indiquer le catalogue e...

<ol>
	<li>Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+crowding+and+temperature+on+Wolbachia+infection+density+among+life+cycle+stages+of+Aedes+albopictus.">Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus.</a> Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).</li><li>Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+superinfections+and+the+expression+of+cytoplasmic+incompatibility.">Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility.</a> Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).</li><li>Dobson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+distributed+throughout+insect+somatic+and+germ+line+tissues.">Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).</li><li>O'Neill, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+Wolbachia+pipientis+in+an+Aedes+albopictus+cell+line.">In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line.</a> Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).</li><li>Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+Wolbachia+wAlbB+endosymbiont+of+Aedes+albopictus.">Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus.</a> Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).</li><li>Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+and+cytoplasmic+incompatibility+in+mosquitoes.">Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).</li><li>Fallon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+properties+of+an+Aedes+albopictus+mosquito+cell+line+infected+with+Wolbachia+strain+wAlbB.">Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB.</a> In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).</li><li>Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+species+are+infected+with+Wolbachia?-A+statistical+analysis+of+current+data.">How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data.</a> Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).</li><li>Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia:+master+manipulators+of+invertebrate+biology.">Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology.</a> National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).</li><li>Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Wolbachia+infections+in+Southeast+Asian+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae).">Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).</li><li>O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).</li><li>McGraw, E. A., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+insecticides:+new+thinking+on+an+ancient+problem.">Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem.</a> National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).</li><li>Bourtzis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+mosquito-Wolbachia+symbiosis+for+vector+and+disease+control.">Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control.</a> Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).</li><li>Turelli, M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+an+inherited+incompatibility+factor+in+California+Drosophila.">Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila.</a> Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).</li><li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission.">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li><li>Walker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wMel+Wolbachia+strain+blocks+dengue+and+invades+caged+Aedes+aegypti+populations.">The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations.</a> Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).</li><li>Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+virulent+and+inhibit+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+in+Anopheles+gambiae.">Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).</li><li>Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endosymbiotic+bacterium+Wolbachia+induces+resistance+to+dengue+virus+in+Aedes+aegypti.">The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).</li><li>Moreira, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wolbachia+symbiont+in+Aedes+aegypti+limits+infection+with+dengue,+Chikungunya,+and+Plasmodium.">A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium.</a> Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).</li><li>Caragata, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+cholesterol+modulates+pathogen+blocking+by+Wolbachia.">Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).</li><li>Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+uses+a+host+microRNA+to+regulate+transcripts+of+a+methyltransferase,+contributing+to+dengue+virus+inhibition+in+Aedes+aegypti.">Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).</li><li>Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya-Wolbachia+interplay+in+Aedes+albopictus.">Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus.</a> Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).</li><li>Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+induces+density-dependent+inhibition+to+dengue+virus+in+mosquito+cells.">Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).</li><li>Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Culicoides+sonorensis+biting+midge+cell+lines+with+Wolbachia+pipientis.">Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis.</a> Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).</li><li>Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+PCR-based+classification+of+Wolbachia+strains+using+wsp+gene+sequences.">Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.</a> The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).</li><li>Park, M. S., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+PaAtg8+and+roles+of+autophagy+in+adaptation+to+starvation+with+respect+to+the+fat+body+and+midgut+of+the+Americana+cockroach,+Periplaneta+americana.">Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).</li><li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin.">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody.">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li><li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti.">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li><li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence,+Western+blotting,+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever.">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li></ol>

La détection de l’infection intracellulaire à Wolbachia est essentielle pour l’étude des interactions Wolbachia-hôte et la confirmation de la transfection réussie des cellules avec de nouvelles souches. Dans ce protocole, quatre méthodes ont été utilisées pour détecter avec succès l’infection intracellulaire à Wolbachia aux niveaux d’acide nucléique et de protéines. Ces quatre méthodes expérimentales ont corroboré et amélioré la précision de détection de l’infecti...

Le moustique tigre asiatique Aedes albopictus (Skuse) (Diptères: Culicidae), qui est un vecteur clé du virus de la dengue (DENV) en Asie et dans d’autres parties du monde1, est un hôte naturel de deux types de bactéries intracellulaires, Wolbachia (wAlbA et wAlbB), qui sont réparties dans toute la lignée germinale et le tissu somatique 2,3. La lignée cellulaire Aa23 dérivée d’embryons d’A. albopictus se compose d’au moins deux types de cellules morphologiques, qui soutiennent tous deux l’infection4 et peuvent être guéris de l’infection native de Wolbachia à l’aide d’antibiotiques (Aa23-T). Étant donné que Aa23 ne conserve que wAlbB, c’est un modèle utile pour l’étude des interactions hôte-endosymbiote 4,5,6.
Wolbachia est transmis par la mère et infecte environ 65% des espèces d’insectes 8,9 et 28% des espèces de moustiques10. Il infecte une variété de tissus et forme une relation symbiotique intime avec l’hôte, induisant généralement une incompatibilité cytoplasmique (IC)11 et un remplacement de la population en manipulant le système reproducteur hôte12,13. Ces réponses de l’hôte ont été observées dans des populations naturelles de Drosophila simulans14 et chez A. aegypti dans une cage de laboratoire et un essai sur le terrain15. Une manipulation non reproductrice importante provoquée par Wolbachia est la résistance induite de l’hôte à une variété d’agents pathogènes, y compris le DENV, le virus Chikungunya (CHIKV) et le virus du Nil occidental (VNO)16,17, qui peut être médiée par un système immunitaire inné amélioré du symbiote18,19, la compétition entre Wolbachia et les virus pour les ressources essentielles de l’hôte20 et la manipulation des voies de défense virale de l’hôte21 .
Ce protocole a été développé pour étudier ces mécanismes sous-jacents des réponses antivirales de l’hôte induites par Wolbachia. Il utilise quatre méthodes de détection de l’infection intracellulaire à Wolbachia des cellules Aa23. Ces méthodes fournissent une base théorique solide pour les études de l’infection intracellulaire à Wolbachia d’autres espèces hôtes. La première méthode, la PCR - une technique puissante permettant l’amplification enzymatique de régions spécifiques de l’ADN sans utiliser de procédures de clonage conventionnelles - a été utilisée pour détecter l’ADN de Wolbachia et déterminer la présence / absence d’infection à Wolbachia 22. La deuxième méthode mesure la densité de copie de l’ADN de Wolbachia à l’aide de la PCR quantitative (qPCR) pour une détection et une mesure fiables des produits générés au cours de chaque cycle de PCR qui est directement proportionnelle à la quantité de gabarit avant la PCR23. La troisième méthode détecte la présence de protéines intracellulaires de Wolbachia , en utilisant le transfert de Western, l’un des outils les plus puissants pour détecter des protéines spécifiques dans des mélanges complexes en combinant le pouvoir de séparation élevé de l’électrophorèse, la spécificité des anticorps et la sensibilité des réactions enzymatiques chromogènes. La dernière méthode est un test d’immunofluorescence (IFA) qui combine l’immunologie, la biochimie et la microscopie pour détecter la protéine de surface de Wolbachia (wsp) par une réaction antigène-anticorps afin de confirmer l’absorption cellulaire de Wolbachia et de déterminer sa localisation cellulaire.
Cet article décrit les quatre méthodes énumérées ci-dessus pour vérifier l’existence de Wolbachia dans les cellules, qui peuvent être utilisées pour détecter si le Wolbachia exogène a été transfecté avec succès et si le Wolbachia dans la cellule a été éliminé. Après avoir déterminé si Wolbachia est présent dans les cellules ou non, une variété d’analyses différentes peuvent être effectuées, y compris la génomique, la protéomique ou la métabolomique. Ce protocole démontre la détection de Wolbachia à travers les cellules Aa23 mais peut également être utilisé dans d’autres cellules.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SteREO Discovery V8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Pipetman</td>
			<td>F167380</td>
			<td>P10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cerium doped yttrium aluminum garnet</td>
			<td>MSE Supplies</td>
			<td></td>
			<td>Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip holder</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Cargille Laboratories</td>
			<td>16482</td>
			<td>Type A low viscosity 150 cSt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR light source&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LED1085L</td>
			<td>LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outer ring&#160;</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump lasers&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LD785-SE400</td>
			<td>785 nm, 400 mW, &#216;9 mm, E Pin Code, Laser Diode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raspberry Pi</td>
			<td>Raspberry Pi Fundation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td>SM1 retaining ring for &#216;1&#34; lens tubes and mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedless quartz crystal</td>
			<td>University Wafers, Inc.</td>
			<td>U01-W2-L-190514</td>
			<td>25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shim</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray beam stop</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines

En tant qu’endosymbiote domestique de la mère, Wolbachia infecte de grandes proportions de populations d’insectes. Des études ont récemment rapporté la régulation réussie de la transmission du virus à ARN à l’aide de moustiques transfectés par Wolbachia. Les stratégies clés pour contrôler les virus comprennent la manipulation de la reproduction de l’hôte par incompatibilité cytoplasmique et l’inhibition des transcriptions virales par l’amorçage immunitaire et la concurrence pour les ressources dérivées de l’hôte. Cependant, les mécanismes sous-jacents des réponses des moustiques transfectés par Wolbachia à l’infection virale sont mal compris. Cet article présente un protocole pour l’identification in vitro de l’infection à Wolbachia aux niveaux d’acide nucléique et de protéines dans les cellules Aa23 d’Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) afin d’améliorer la compréhension des interactions entre Wolbachia et ses insectes vecteurs. Grâce à l’utilisation combinée de la réaction en chaîne par polymérase (PCR), de la PCR quantitative, du transfert western et des méthodes d’analyse immunologique, un protocole morphologique standard a été décrit pour la détection des cellules infectées par Wolbachia qui est plus précis que l’utilisation d’une seule méthode. Cette approche peut également être appliquée à la détection de l’infection à Wolbachia dans d’autres taxons d’insectes.

Avant la détection de Wolbachia , les cellules Aa23 et Aa23-T ont été observées au microscope optique pour déterminer les différences morphologiques entre les deux lignées cellulaires. Les cellules Aa23 et Aa23-T ont au moins deux morphologies cellulaires, mais aucune différence morphologique évidente entre les deux types de cellules (Figure 1). Ici, les cellules Aa23 ont été utilisées comme système modèle pour détecter l’infection à Wolbachia<...

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Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Quatre méthodes ont été utilisées pour détecter les Wolbachia intracellulaires, qui se complétaient et amélioraient la précision de la détection de l’infection à Wolbachia de aa23 dérivé d’Aedes albopictus et de l’Aa23-T guéris de l’infection native de Wolbachia à l’aide d’antibiotiques.

Détection de la souche wAlbB de Wolbachia dans les lignées cellulaires d’Aedes albopictus

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Ce protocole permet de vérifier l’existence de Wolbachia dans les cellules, ce qui est la base de la compréhension de l’interaction entre Wolbachia et son hôte. Dans ce protocole, quatre méthodes ont été utilisées pour détecter avec succès l’infection intracellulaire à Wolbachia, ce qui a corroboré et amélioré la précision de la détection de l’infection à Wolbachia des cellules. La démonstration de la procédure sera assurée par Qiuqiu Xiao, un étudiant de troisième cycle du Key Laboratory of Modern Pathogen Biology and Characteristics.Commencez par observer les cellules Aa23 et Aa23-T non colorées à un grossissement de 100x à l’aide de la microscopie optique. Cultivez les cellules pendant cinq à sept jours pour atteindre 70 à 80% de confluence par flacon. À l’aide d’une pipette, transférer 1 mL du milieu de culture dans un tube de microcentrifugation.Centrifuger à 100 RCF pendant cinq minutes pour récolter les cellules. Retirez le surnageant et conservez la pastille de cellule résultante à moins 20 degrés Celsius. Cultivez les cellules pendant cinq à sept jours pour atteindre une confluence de 90 à 100 % par flacon.Remettre en suspension les granulés dans 0,40 mL de PBS et transférer 50 microlitres de cette solution dans un tube de microcentrifugeuse. Ajouter cinq microlitres de 20 mg/mL de protéinase K et incuber à 55 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, incubez les tubes à 99 degrés Celsius pendant 15 minutes pour obtenir l’ADN brut et le stocker à moins 20 degrés Celsius.Pour effectuer la PCR, préparez un mélange réactionnel total de 20 microlitres et définissez les conditions de PCR comme décrit dans le manuscrit textuel. Détectez l’ADN sur un gel d’agarose à 1% à l’aide d’un imageur de gel. Effectuez une amplification PCR quantitative à l’aide de TB Green dans un système de PCR en temps réel et enregistrez les résultats de chaque réaction.Analysez l’ADN dans un volume de réaction total de 20 microlitres et définissez les conditions quantitatives de PCR décrites dans le manuscrit textuel. Calculez le nombre de copies de gènes WSP et RPS6 dans les cellules selon la courbe standard établie. Calculez ensuite la densité relative de Wolbachia par le nombre de copies de wsp/RPS6.Analysez les données à l’aide d’un test t d’échantillons indépendants. Ajouter 200 microlitres de tampon de lyse à la pastille cellulaire et incuber sur de la glace pendant 30 minutes. Centrifuger les lysats à 12 000 RCF pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et aspirer le surnageant.Analyser la concentration de wsp du surnageant à l’aide d’un kit de dosage de protéine bCA, en suivant les instructions du fabricant. Chargez des quantités égales de protéines sur un gel SDS-PAGE à 15%. Transférer la protéine dans les membranes de nitrocellulose et bloquer les membranes avec du lait écrémé à 5% pendant deux heures à température ambiante.Ensuite, lavez les membranes trois fois avec TBST. Incuber les membranes pendant la nuit à 4 degrés Celsius avec 100 microlitres d’anticorps polyclonaux anti-wsp préparés en diluant l’anticorps primaire avec du lait écrémé à 5%. Lavez l’anticorps primaire trois fois avec TBST.Ajouter 100 microlitres d’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort aux membranes et l’incuber sur un agitateur pendant une heure à température ambiante. Lavez les membranes trois fois avec TBST et mélangez 20 microlitres de solution A et 20 microlitres de solution B dans le kit de détection de chimiluminescence dans un rapport de un à un. Plongez simultanément toute la membrane dans la solution de luminescence et observez les signaux à l’aide d’un système d’imagerie multifonctionnel.Sur une boîte de Petri confocale laser, incuber les cellules Aa23 et Aa23-T pendant trois à quatre jours à 28 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone atmosphérique. Lorsque la cellule atteint 60 à 70% de confluence, lavez les cellules trois fois avec PBS. Fixez les cellules dans un mL de paraformaldéhyde à 4% pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.Lavez les cellules fixes à l’aide de PBST pendant cinq minutes et lavez les cellules deux fois avec PBS. Incuber la boîte de Petri dans un mL d’albumine sérique bovine à 3% pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ajouter 100 microlitres d’anticorps polyclonaux anti-wsp de souris et de sérum de souris aux lames et l’incuber pendant la nuit dans une boîte humide à quatre degrés Celsius.Retirez la boîte de Petri de la boîte humide et remettez-la à température ambiante. Lavez-les trois fois avec pbS et retirez le PBS. Protégez les procédures suivantes de la lumière.Incuber la boîte de Petri avec 100 microlitres d’un anticorps anti-souris de chèvre conjugué Alexa Fluor 488 à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Incuber l’échantillon de boîte de Petri avec 50 microlitres de DAPI dilués dans du PBS à 10 microgrammes/mL à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis les laver trois fois avec du PBS. Observez l’immunocoloration au microscope confocal.Avant de détecter Wolbachia, les cellules Aa23 et Aa23-T ont été observées au microscope optique pour déterminer les différences morphologiques entre les deux lignées cellulaires. Les cellules Aa23 et AA23-T avaient au moins deux morphologies cellulaires, mais aucune différence morphologique apparente n’a été observée entre les deux types de cellules. En utilisant les amorces diagnostiques 81F/691R, une amplification positive du gène Wolbachia wsp a été détectée dans les cellules Aa23 mais pas dans les cellules Aa23-T.L’analyse de la densité de Wolbachia dans les lignées cellulaires a montré un rapport wsp/rps6 de 2,4 dans les cellules Aa23 mais pas de Wolbachia dans les cellules Aa23-T. L’analyse par transfert Western d’extraits de protéines a montré un fort signal wsp pour Aa23, mais aucun signal n’a été détecté pour Aa23-T. Le test d’immunofluorescence indirecte a détecté la protéine wsp dans les cellules Aa23, tandis que seul l’ADN coloré DAPI a été détecté dans les cellules Aa23-T.S’assurer que les flacons de culture sont incubés à 28 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone atmosphérique pendant cinq à sept jours. Cette procédure peut être suivie par la microscopie électronique où il faut accorder une attention particulière à la préparation et au sectionnement des échantillons. Les quatre méthodes expérimentales utilisées dans cette étude ont confirmé la précision de la détection de l’infection à Wolbachia dans les cellules, qui est également applicable à d’autres types de cellules et de tissus.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Dérivation des thymique lymphome à cellules T à partir des lignes Atm - / -</sup Et<emP53> - / -</sup Souris

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Recherche

Immunologie et infection

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