Name: detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

Wir danken Dr. Xin-Ru Wang von der University of Minnesota für aufschlussreiche Anregungen und Anleitungen. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Natural Science Foundation of China (No.81760374) unterstützt.

1. Materialien und Reagenzien
<ol><li>Verwenden Sie pyrogenfreie Lösungen und Medien für die Zellkultur (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Verwenden Sie Reinstwasser, um alle Lösungen vorzubereiten.</li>
	<li>Seien Sie vorsichtig bei der Auswahl von fetalem Rinderserum (FBS) für die Zellkultur nach einem Lot-Check-Prozess. HINWEIS: Da FBS-Chargen regelmäßigen Änderungen unterliegen, ist es unmöglich, den entsprechenden Katalog und die Chargennummern in diesem Protokoll anzug...

<ol>
	<li>Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+crowding+and+temperature+on+Wolbachia+infection+density+among+life+cycle+stages+of+Aedes+albopictus.">Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus.</a> Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).</li><li>Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+superinfections+and+the+expression+of+cytoplasmic+incompatibility.">Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility.</a> Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).</li><li>Dobson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+distributed+throughout+insect+somatic+and+germ+line+tissues.">Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).</li><li>O'Neill, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+Wolbachia+pipientis+in+an+Aedes+albopictus+cell+line.">In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line.</a> Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).</li><li>Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+Wolbachia+wAlbB+endosymbiont+of+Aedes+albopictus.">Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus.</a> Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).</li><li>Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+and+cytoplasmic+incompatibility+in+mosquitoes.">Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).</li><li>Fallon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+properties+of+an+Aedes+albopictus+mosquito+cell+line+infected+with+Wolbachia+strain+wAlbB.">Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB.</a> In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).</li><li>Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+species+are+infected+with+Wolbachia?-A+statistical+analysis+of+current+data.">How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data.</a> Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).</li><li>Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia:+master+manipulators+of+invertebrate+biology.">Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology.</a> National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).</li><li>Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Wolbachia+infections+in+Southeast+Asian+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae).">Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).</li><li>O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).</li><li>McGraw, E. A., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+insecticides:+new+thinking+on+an+ancient+problem.">Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem.</a> National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).</li><li>Bourtzis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+mosquito-Wolbachia+symbiosis+for+vector+and+disease+control.">Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control.</a> Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).</li><li>Turelli, M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+an+inherited+incompatibility+factor+in+California+Drosophila.">Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila.</a> Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).</li><li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission.">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li><li>Walker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wMel+Wolbachia+strain+blocks+dengue+and+invades+caged+Aedes+aegypti+populations.">The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations.</a> Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).</li><li>Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+virulent+and+inhibit+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+in+Anopheles+gambiae.">Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).</li><li>Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endosymbiotic+bacterium+Wolbachia+induces+resistance+to+dengue+virus+in+Aedes+aegypti.">The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).</li><li>Moreira, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wolbachia+symbiont+in+Aedes+aegypti+limits+infection+with+dengue,+Chikungunya,+and+Plasmodium.">A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium.</a> Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).</li><li>Caragata, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+cholesterol+modulates+pathogen+blocking+by+Wolbachia.">Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).</li><li>Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+uses+a+host+microRNA+to+regulate+transcripts+of+a+methyltransferase,+contributing+to+dengue+virus+inhibition+in+Aedes+aegypti.">Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).</li><li>Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya-Wolbachia+interplay+in+Aedes+albopictus.">Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus.</a> Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).</li><li>Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+induces+density-dependent+inhibition+to+dengue+virus+in+mosquito+cells.">Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).</li><li>Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Culicoides+sonorensis+biting+midge+cell+lines+with+Wolbachia+pipientis.">Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis.</a> Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).</li><li>Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+PCR-based+classification+of+Wolbachia+strains+using+wsp+gene+sequences.">Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.</a> The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).</li><li>Park, M. S., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+PaAtg8+and+roles+of+autophagy+in+adaptation+to+starvation+with+respect+to+the+fat+body+and+midgut+of+the+Americana+cockroach,+Periplaneta+americana.">Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).</li><li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin.">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody.">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li><li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti.">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li><li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence,+Western+blotting,+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever.">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li></ol>

Der Nachweis einer intrazellulären Wolbachia-Infektion ist essentiell für die Untersuchung von Wolbachia-Wirt-Interaktionen und die Bestätigung einer erfolgreichen Transfektion von Zellen mit neuartigen Stämmen. In diesem Protokoll wurden vier Methoden verwendet, um eine intrazelluläre Wolbachia-Infektion auf Nukleinsäure- und Proteinebene erfolgreich nachzuweisen. Diese vier experimentellen Methoden bestätigten und verbesserten die Nachweisgenauigkeit der Wolbachia-Infektion vo...

Die Asiatische Tigermücke Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), die in Asien und anderen Teilen der Welt ein Schlüsselvektor des Dengue-Virus (DENV) ist1, ein natürlicher Wirt von zwei Arten der intrazellulären Bakterien, Wolbachia (w AlbA und wAlbB), die über die Keimbahn und das somatische Gewebe verteilt sind 2,3. Die Aa23-Zelllinie, die aus A. albopictus-Embryonen gewonnen wird, besteht aus mindestens zwei morphologischen Zelltypen, die beide die Infektion4 unterstützen und mit Antibiotika (Aa23-T) von einer nativen Wolbachia-Infektion geheilt werden können. Da Aa23 nur wAlbB behält, ist es ein nützliches Modell für die Untersuchung von Wirt-Endosymbionten-Interaktionen 4,5,6.
Wolbachia wird mütterlich übertragen und infiziert schätzungsweise 65% der Insektenarten 8,9 und 28% der Mückenarten10. Es infiziert eine Vielzahl von Geweben und bildet eine intime symbiotische Beziehung mit dem Wirt, die normalerweise zytoplasmatische Inkompatibilität (CI)11 und Populationsersatz durch Manipulation des Wirtsfortpflanzungssystems12,13 induziert. Diese Wirtsreaktionen wurden in natürlichen Populationen von Drosophila simulans14 und in A. aegypti in einem Laborkäfig und Feldversuch15 beobachtet. Eine wichtige nichtreproduktive Manipulation, die durch Wolbachia ausgelöst wird, ist die induzierte Wirtsresistenz gegen eine Vielzahl von Krankheitserregern, einschließlich DENV, Chikungunya-Virus (CHIKV) und West-Nil-Virus (WNV) 16,17, die durch ein verbessertes angeborenes Immunsystem des Symbiontenvermittelt werden können 18,19, die Konkurrenz zwischen Wolbachia und Viren um essentielle Wirtsressourcen 20 und die Manipulation von viralen Abwehrwegen des Wirts 21 .
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um diese zugrunde liegenden Mechanismen der antiviralen Reaktionen des Wolbachia-induzierten Wirts zu untersuchen. Es verwendet vier Methoden zum Nachweis der intrazellulären Wolbachia-Infektion von Aa23-Zellen. Diese Methoden bieten eine starke theoretische Grundlage für Studien zur intrazellulären Wolbachia-Infektion anderer Wirtsarten. Die erste Methode, die PCR - eine leistungsstarke Technik, die die enzymatische Amplifikation bestimmter DNA-Regionen ohne Verwendung herkömmlicher Klonierungsverfahren ermöglicht - wurde verwendet, um Wolbachia-DNA nachzuweisen und das Vorhandensein / Fehlen einer Wolbachia-Infektion zu bestimmen 22. Die zweite Methode misst die Wolbachia-DNA-Kopierdichte mittels quantitativer PCR (qPCR) für den zuverlässigen Nachweis und die Messung von Produkten, die während jedes PCR-Zyklus erzeugt werden, der direkt proportional zur Menge der Vorlage vor PCR23 ist. Die dritte Methode erkennt das Vorhandensein von intrazellulären Wolbachia-Proteinen unter Verwendung von Western Blot - einem der leistungsfähigsten Werkzeuge zum Nachweis spezifischer Proteine in komplexen Gemischen, indem es die hohe Trennleistung der Elektrophorese, die Spezifität von Antikörpern und die Empfindlichkeit chromogener enzymatischer Reaktionen kombiniert. Die letzte Methode ist ein Immunfluoreszenz-Assay (IFA), der Immunologie, Biochemie und Mikroskopie kombiniert, um das Wolbachia-Oberflächenprotein (wsp) durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion nachzuweisen, um die zelluläre Aufnahme von Wolbachia zu bestätigen und seine zelluläre Lokalisation zu bestimmen.
Dieses Papier beschreibt die vier oben aufgeführten Methoden, um die Existenz von Wolbachia in den Zellen zu überprüfen, mit denen nachgewiesen werden kann, ob die exogene Wolbachia erfolgreich transfiziert und die Wolbachia in der Zelle beseitigt wurde. Nachdem festgestellt wurde, ob Wolbachia in den Zellen vorhanden ist oder nicht, können verschiedene Analysen durchgeführt werden, einschließlich Genomik, Proteomik oder Metabolomik. Dieses Protokoll demonstriert den Nachweis von Wolbachia durch Aa23-Zellen, kann aber auch in anderen Zellen verwendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SteREO Discovery V8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Pipetman</td>
			<td>F167380</td>
			<td>P10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cerium doped yttrium aluminum garnet</td>
			<td>MSE Supplies</td>
			<td></td>
			<td>Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip holder</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Cargille Laboratories</td>
			<td>16482</td>
			<td>Type A low viscosity 150 cSt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR light source&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LED1085L</td>
			<td>LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outer ring&#160;</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump lasers&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LD785-SE400</td>
			<td>785 nm, 400 mW, &#216;9 mm, E Pin Code, Laser Diode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raspberry Pi</td>
			<td>Raspberry Pi Fundation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td>SM1 retaining ring for &#216;1&#34; lens tubes and mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedless quartz crystal</td>
			<td>University Wafers, Inc.</td>
			<td>U01-W2-L-190514</td>
			<td>25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shim</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray beam stop</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines

Als mütterlich beherbergter Endosymbiont infiziert Wolbachia große Teile der Insektenpopulationen. Studien haben kürzlich über die erfolgreiche Regulation der RNA-Virusübertragung mit Wolbachia-transfizierten Moskitos berichtet. Zu den wichtigsten Strategien zur Kontrolle von Viren gehören die Manipulation der Wirtsreproduktion durch zytoplasmatische Inkompatibilität und die Hemmung viraler Transkripte durch Immun-Priming und Konkurrenz um vom Wirt abgeleitete Ressourcen. Die zugrunde liegenden Mechanismen der Reaktionen von Wolbachia-transfizierten Moskitos auf eine Virusinfektion sind jedoch kaum verstanden. Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die In-vitro-Identifizierung von Wolbachia-Infektionen auf Nukleinsäure- und Proteinebene in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-Zellen vor, um das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Wolbachia und seinen Insektenvektoren zu verbessern. Durch die kombinierte Verwendung von Polymerase-Kettenreaktion (PCR), quantitativer PCR, Western Blot und immunologischen Analysemethoden wurde ein morphologisches Standardprotokoll für den Nachweis von Wolbachia-infizierten Zellen beschrieben, das genauer ist als die Verwendung einer einzigen Methode. Dieser Ansatz kann auch auf den Nachweis einer Wolbachia-Infektion in anderen Insektentaxa angewendet werden.

Bevor Wolbachia nachgewiesen wurde, wurden Aa23- und Aa23-T-Zellen unter einem Lichtmikroskop beobachtet, um morphologische Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien zu bestimmen. Aa23- und Aa23-T-Zellen haben mindestens zwei Zellmorphologien, aber keinen offensichtlichen morphologischen Unterschied zwischen den beiden Zelltypen (Abbildung 1). Hier wurden Aa23-Zellen als Modellsystem verwendet, um eine Wolbachia-Infektion mit vier Methoden zu erkennen. Ei...

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Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Vier Methoden wurden verwendet, um intrazelluläre Wolbachia nachzuweisen, die sich gegenseitig ergänzten und die Nachweisgenauigkeit der Wolbachia-Infektion von Aedes albopictus-abgeleiteten Aa23 und Aa23-T, die von nativer Wolbachia-Infektion mit Antibiotika geheilt wurden, verbesserten.

Nachweis des Wolbachia-Stammes wAlbB in Aedes albopictus-Zelllinien

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Dieses Protokoll hilft, die Existenz von Wolbachia in Zellen zu überprüfen, was die Grundlage für das Verständnis der Interaktion zwischen Wolbachia und seinem Host ist. In diesem Protokoll wurden vier Methoden verwendet, um eine intrazelluläre Wolbachia-Infektion erfolgreich nachzuweisen, was die Nachweisgenauigkeit der Wolbachia-Infektion von Zellen bestätigte und verbesserte. Qiuqiu Xiao, ein Doktorand des Schlüssellabors für moderne Pathogenbiologie und -merkmale, wird das Verfahren demonstrieren.Beginnen Sie mit der Beobachtung unbefleckter Aa23- und Aa23-T-Zellen bei 100-facher Vergrößerung mittels Lichtmikroskopie. Kultivieren Sie die Zellen für fünf bis sieben Tage, um 70 bis 80% Konfluenz pro Flasche zu erreichen. Übertragen Sie mit einer Pipette 1 ml des Kulturmediums auf ein Mikrozentrifugenröhrchen.Zentrifugieren Sie bei 100 RCF für fünf Minuten, um die Zellen zu ernten. Entfernen Sie den Überstand und lagern Sie das resultierende Zellpellet bei minus 20 Grad Celsius. Kultivieren Sie die Zellen für fünf bis sieben Tage, um 90 bis 100% Konfluenz pro Kolben zu erreichen.Resuspendieren Sie die Pellets in 0,40 ml PBS und übertragen Sie 50 Mikroliter dieser Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie fünf Mikroliter 20 mg / ml Proteinase K hinzu und inkubieren Sie bei 55 Grad Celsius für eine Stunde. Dann inkubieren Sie die Röhrchen bei 99 Grad Celsius für 15 Minuten, um die rohe DNA zu erhalten und sie bei minus 20 Grad Celsius zu lagern.Um eine PCR durchzuführen, bereiten Sie ein Gesamtreaktionsgemisch von 20 Mikrolitern vor und stellen Sie die PCR-Bedingungen wie im Textmanuskript beschrieben ein. Nachweis der DNA auf einem 1%Agarosegel mit einem Gel-Imager. Führen Sie eine quantitative PCR-Amplifikation mit TB Green in einem Echtzeit-PCR-System durch und zeichnen Sie die Ergebnisse jeder Reaktion auf.Analysieren Sie die DNA in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 Mikrolitern und stellen Sie die quantitativen PCR-Bedingungen ein, wie im Textmanuskript beschrieben. Berechnen Sie die WSP- und RPS6-Genkopienzahlen in den Zellen nach der festgelegten Standardkurve. Berechnen Sie dann die relative Wolbachia-Dichte anhand der Kopierzahl von wsp/RPS6.Analysieren Sie die Daten mit einem unabhängigen Stichproben-t-Test. Geben Sie 200 Mikroliter Lysepuffer in das Zellpellet und inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf Eis. Die Lysate bei 12.000 RCF für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand abspritzen.Analysieren Sie die wsp-Konzentration des Überstands mit einem BCA-Protein-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Laden Sie gleiche Mengen Protein auf ein 15%SDS-PAGE Gel. Übertragen Sie das Protein auf Nitrocellulosemembranen und blockieren Sie die Membranen mit 5% Magermilch für zwei Stunden bei Raumtemperatur.Dann waschen Sie die Membranen dreimal mit TBST. Inkubieren Sie die Membranen über Nacht bei 4 Grad Celsius mit 100 Mikrolitern polyklonaler Anti-WSP-Antikörper, die durch Verdünnung des primären Antikörpers mit 5% Magermilch hergestellt werden. Waschen Sie den primären Antikörper dreimal mit TBST.Geben Sie 100 Mikroliter Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörper zu den Membranen und inkubieren Sie ihn auf einem Shaker für eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Membranen dreimal mit TBST und mischen Sie 20 Mikroliter Lösung A und 20 Mikroliter Lösung B im Chemilumineszenz-Detektionskit in einem Verhältnis von eins zu eins. Tauchen Sie die gesamte Membran gleichzeitig in die Lumineszenzlösung ein und beobachten Sie die Signale mit einem multifunktionalen Bildgebungssystem.Inkubieren Sie auf einer konfokalen Laser-Petrischale Aa23- und Aa23-T-Zellen für drei bis vier Tage bei 28 Grad Celsius unter 5% atmosphärischem Kohlendioxid. Wenn die Zelle 60 bis 70% Konfluenz erreicht, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Fixieren Sie die Zellen in einem ml 4% Paraformaldehyd für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.Waschen Sie die festen Zellen fünf Minuten lang mit PBST und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS neu. Brüten Sie die Petrischale in einem ml 3%Rinderserumalbumin für eine Stunde bei 37 Grad Celsius aus. Geben Sie 100 Mikroliter Maus-Anti-WSP-Polyklonal-Antikörper und Mausserum zu den Objektträgern und inkubieren Sie es über Nacht in einer nassen Box bei vier Grad Celsius.Die Petrischale aus der Nasszelle nehmen und wieder auf Raumtemperatur bringen. Waschen Sie sie dreimal mit PBS und entfernen Sie die PBS. Schützen Sie die folgenden Verfahren vor Licht.Brüten Sie die Petrischale mit 100 Mikrolitern eines Alexa Fluor 488-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Antikörpers bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten aus. Inkubieren Sie die Proben-Petrischale mit 50 Mikrolitern DAPI, verdünnt in PBS auf 10 Mikrogramm / ml bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten und waschen Sie sie dann dreimal mit PBS. Beobachten Sie die Immunfärbung unter einem konfokalen Mikroskop.Vor dem Nachweis von Wolbachia wurden Aa23- und Aa23-T-Zellen unter einem Lichtmikroskop beobachtet, um morphologische Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien zu bestimmen. Die Aa23- und AA23-T-Zellen hatten mindestens zwei Zellmorphologien, aber es wurden keine offensichtlichen morphologischen Unterschiede zwischen den beiden Zelltypen beobachtet. Mit den diagnostischen Primern 81F/691R wurde eine positive Amplifikation des Wolbachia wsp-Gens in Aa23-Zellen, aber nicht in Aa23-T-Zellen nachgewiesen.Die Analyse der Wolbachia-Dichte in den Zelllinien zeigte ein wsp/rps6-Verhältnis von 2,4 in Aa23-Zellen, aber keine Wolbachia in Aa23-T-Zellen. Die Western-Blot-Analyse von Proteinextrakten zeigte ein starkes WSP-Signal für Aa23, aber für Aa23-T wurde kein Signal detektiert. Der indirekte Immunfluoreszenz-Assay wies das wsp-Protein in Aa23-Zellen nach, während in Aa23-T-Zellen nur DAPI-gefärbte DNA nachgewiesen wurde.Stellen Sie sicher, dass die Kulturkolben fünf bis sieben Tage lang bei 28 Grad Celsius unter 5% atmosphärischem Kohlendioxid inkubiert werden. Diesem Verfahren kann eine Elektronenmikroskopie folgen, bei der besonders auf die Probenvorbereitung und das Schneiden der Proben geachtet werden muss. Die vier experimentellen Methoden, die in dieser Studie verwendet wurden, bestätigten die Nachweisgenauigkeit der Wolbachia-Infektion in Zellen, die auch auf andere Arten von Zellen und Geweben anwendbar ist.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Ableitung von Thymuslymphom T-Zell-Linien aus Atm - / -</sup Und P53 - / -</sup Mäuse

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Gründung des Epstein-Barr Virus Growth-transformierten lymphoblastoiden Zelllinien

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Prävention von Hitzestress Unerwünschte Wirkungen bei Ratten durch<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Dehnungs

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Erkennen Cortex Fragmente während der bakteriellen Sporenauskeimung

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A Simple Red Blood Cell Lysis Verfahren zur Etablierung von B Lymphoblastoidzelllinien

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Eine effiziente und einfache Methode, NK und T-Zell-Linien von Patienten mit chronischen aktiven Epstein - Barr-Virus-Infektion zu etablieren

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vektorkompetenzanalysen an Aedes aegypti Mücken mit Zika-Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Ausbreitung des mikrosporiden Parasiten Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...