Name: detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

אנו מודים לד"ר שין-רו וואנג מאוניברסיטת מינסוטה על הצעות והדרכה תובנות. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (No.81760374).

1. חומרים וריאגנטים
<ol><li>השתמש בתמיסות ובמדיה ללא פירוגן עבור תרבית תאים (ראה טבלת החומרים).</li>
	<li>השתמש במים אולטרה-פורים כדי להכין את כל הפתרונות.</li>
	<li>היזהרו בבחירת סרום בקר עוברי (FBS) לתרבית תאים, לאחר תהליך בדיקה רב. הערה: מכיוון שהרבה FBS כפופים לשינויים קבועים, אי אפש...

<ol>
	<li>Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+crowding+and+temperature+on+Wolbachia+infection+density+among+life+cycle+stages+of+Aedes+albopictus.">Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus.</a> Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).</li><li>Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+superinfections+and+the+expression+of+cytoplasmic+incompatibility.">Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility.</a> Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).</li><li>Dobson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+distributed+throughout+insect+somatic+and+germ+line+tissues.">Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).</li><li>O'Neill, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+Wolbachia+pipientis+in+an+Aedes+albopictus+cell+line.">In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line.</a> Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).</li><li>Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+Wolbachia+wAlbB+endosymbiont+of+Aedes+albopictus.">Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus.</a> Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).</li><li>Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+and+cytoplasmic+incompatibility+in+mosquitoes.">Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).</li><li>Fallon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+properties+of+an+Aedes+albopictus+mosquito+cell+line+infected+with+Wolbachia+strain+wAlbB.">Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB.</a> In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).</li><li>Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+species+are+infected+with+Wolbachia?-A+statistical+analysis+of+current+data.">How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data.</a> Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).</li><li>Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia:+master+manipulators+of+invertebrate+biology.">Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology.</a> National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).</li><li>Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Wolbachia+infections+in+Southeast+Asian+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae).">Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).</li><li>O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).</li><li>McGraw, E. A., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+insecticides:+new+thinking+on+an+ancient+problem.">Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem.</a> National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).</li><li>Bourtzis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+mosquito-Wolbachia+symbiosis+for+vector+and+disease+control.">Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control.</a> Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).</li><li>Turelli, M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+an+inherited+incompatibility+factor+in+California+Drosophila.">Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila.</a> Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).</li><li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission.">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li><li>Walker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wMel+Wolbachia+strain+blocks+dengue+and+invades+caged+Aedes+aegypti+populations.">The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations.</a> Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).</li><li>Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+virulent+and+inhibit+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+in+Anopheles+gambiae.">Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).</li><li>Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endosymbiotic+bacterium+Wolbachia+induces+resistance+to+dengue+virus+in+Aedes+aegypti.">The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).</li><li>Moreira, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wolbachia+symbiont+in+Aedes+aegypti+limits+infection+with+dengue,+Chikungunya,+and+Plasmodium.">A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium.</a> Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).</li><li>Caragata, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+cholesterol+modulates+pathogen+blocking+by+Wolbachia.">Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).</li><li>Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+uses+a+host+microRNA+to+regulate+transcripts+of+a+methyltransferase,+contributing+to+dengue+virus+inhibition+in+Aedes+aegypti.">Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).</li><li>Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya-Wolbachia+interplay+in+Aedes+albopictus.">Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus.</a> Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).</li><li>Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+induces+density-dependent+inhibition+to+dengue+virus+in+mosquito+cells.">Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).</li><li>Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Culicoides+sonorensis+biting+midge+cell+lines+with+Wolbachia+pipientis.">Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis.</a> Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).</li><li>Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+PCR-based+classification+of+Wolbachia+strains+using+wsp+gene+sequences.">Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.</a> The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).</li><li>Park, M. S., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+PaAtg8+and+roles+of+autophagy+in+adaptation+to+starvation+with+respect+to+the+fat+body+and+midgut+of+the+Americana+cockroach,+Periplaneta+americana.">Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).</li><li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin.">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody.">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li><li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti.">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li><li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence,+Western+blotting,+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever.">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li></ol>

זיהוי של זיהום וולבצ'יה תוך-תאי חיוני לחקר אינטראקציות וולבצ'יה-מארח ולאישור של טרנספקציה מוצלחת של תאים עם זנים חדשים. בפרוטוקול זה, ארבע שיטות שימשו כדי לזהות בהצלחה זיהום וולבצ'יה תוך תאי ברמות חומצת הגרעין והחלבון. ארבע שיטות ניסיוניות אלה אימתו ושיפרו את דיוק הזיהוי של ?...

יתוש הטיגריס האסייתי Aedes albopictus (Skuse) (דיפטרה: Culicidae), שהוא וקטור מפתח של נגיף הדנגי (DENV) באסיה ובחלקים אחרים של העולם1, הוא מארח טבעי של שני סוגים של החיידקים התוך תאיים, וולבצ'יה (wAlbA ו-wAlbB), המופצים לאורך קו הנבט והרקמה הסומטית 2,3. קו התאים Aa23 שמקורו בעוברי A. albopictus מורכב משני סוגי תאים מורפולוגיים לפחות, שניהם תומכים בזיהום4 וניתן לרפא אותם מזיהום וולבצ'יה מקומי באמצעות אנטיביוטיקה (Aa23-T). בהתחשב בכך ש- Aa23 שומר רק על wAlbB, זהו מודל שימושי לחקר אינטראקציות פונדקאי-אנדוסימביונט 4,5,6.
וולבצ'יה מועברת באופן אימהי ומדביקה כ-65% ממיני החרקים 8,9 ו-28% ממיני היתושיםבני 10. הוא מדביק מגוון רקמות ויוצר מערכת יחסים סימביוטית אינטימית עם המארח, בדרך כלל גורם לחוסר תאימות ציטופלסמית (CI)11 ולהחלפת אוכלוסייה על ידי מניפולציה של מערכת הרבייה המארחת 12,13. תגובות פונדקאיות אלה נצפו באוכלוסיות טבעיות של דרוזופילה סימולנס14 וב-A. aegypti בכלוב מעבדה ובניסוי שדה15. מניפולציה לא-רבייתית חשובה שנוצרה על ידי וולבצ'יה היא עמידות מארח מושרית למגוון פתוגנים, כולל DENV, נגיף צ'יקונגוניה (CHIKV) ונגיף הנילוס המערבי (WNV)16,17, שעשוי להיות מתווך על ידי מערכת חיסונית מולדת משופרת של הסימביונט18,19, תחרות בין וולבצ'יה לנגיפים על משאבים מארחים חיוניים20, ומניפולציה של מסלולי הגנה נגיפיים מארחים21 .
פרוטוקול זה פותח לחקר המנגנונים הבסיסיים האלה של תגובות אנטי-ויראליות של פונדקאי המושרה על-ידי וולבצ'יה. הוא משתמש בארבע שיטות לגילוי של זיהום וולבצ'יה תוך תאי של תאי Aa23. שיטות אלה מספקות בסיס תיאורטי חזק למחקרים על זיהום וולבצ'יה תוך-תאי של מינים מארחים אחרים. השיטה הראשונה, PCR - טכניקה רבת עוצמה המאפשרת הגברה אנזימטית של אזורים ספציפיים בדנ"א מבלי להשתמש בהליכי שיבוט קונבנציונליים - שימשה לאיתור דנ"א של וולבצ'יה ולקבוע את נוכחותו/היעדרו של זיהום וולבצ'יה 22. השיטה השנייה מודדת את צפיפות העתקת הדנ"א של וולבצ'יה באמצעות PCR כמותי (qPCR) לזיהוי ומדידה אמינים של מוצרים שנוצרו במהלך כל מחזור PCR, אשר פרופורציונלי ישירות לכמות התבנית לפני PCR23. השיטה השלישית מזהה נוכחות של חלבוני וולבצ'יה תוך-תאיים, תוך שימוש בכתם מערבי - אחד הכלים החזקים ביותר לאיתור חלבונים ספציפיים בתערובות מורכבות על ידי שילוב של כוח ההפרדה הגבוה של אלקטרופורזה, הספציפיות של נוגדנים ורגישות של תגובות אנזימטיות כרומוגניות. השיטה הסופית היא בדיקת אימונופלואורסצנציה (IFA) המשלבת אימונולוגיה, ביוכימיה ומיקרוסקופיה כדי לזהות את חלבון פני השטח של וולבצ'יה (wsp) באמצעות תגובת אנטיגן-נוגדן כדי לאשר את הספיגה התאית של וולבצ'יה ולקבוע את לוקליזציה התאית שלה.
מאמר זה מתאר את ארבע השיטות המפורטות לעיל כדי לאמת את קיומה של וולבצ'יה בתאים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות אם וולבצ'יה האקסוגנית עברה בהצלחה טרנספקציה והוולבצ'יה בתא נוקתה. לאחר קביעה אם וולבצ'יה קיימת בתאים או לא, ניתן לבצע מגוון ניתוחים שונים, כולל גנומיקה, פרוטאומיקה או מטבוליקה. פרוטוקול זה מדגים את הזיהוי של וולבצ'יה באמצעות תאי Aa23, אך ניתן להשתמש בו גם בתאים אחרים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SteREO Discovery V8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Pipetman</td>
			<td>F167380</td>
			<td>P10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cerium doped yttrium aluminum garnet</td>
			<td>MSE Supplies</td>
			<td></td>
			<td>Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip holder</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Cargille Laboratories</td>
			<td>16482</td>
			<td>Type A low viscosity 150 cSt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR light source&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LED1085L</td>
			<td>LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outer ring&#160;</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump lasers&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LD785-SE400</td>
			<td>785 nm, 400 mW, &#216;9 mm, E Pin Code, Laser Diode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raspberry Pi</td>
			<td>Raspberry Pi Fundation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td>SM1 retaining ring for &#216;1&#34; lens tubes and mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedless quartz crystal</td>
			<td>University Wafers, Inc.</td>
			<td>U01-W2-L-190514</td>
			<td>25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shim</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray beam stop</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines

כאנדוסימביונטית בעלת נמל אימהי, וולבצ'יה מדביקה שיעורים גדולים של אוכלוסיות חרקים. מחקרים דיווחו לאחרונה על ויסות מוצלח של העברת נגיפי RNA באמצעות יתושים שעברו טרנספקציה של וולבצ'יה. אסטרטגיות מרכזיות לשליטה בווירוסים כוללות מניפולציה של רבייה של מארח באמצעות אי-תאימות ציטופלסמית ועיכוב של תעתיקים נגיפיים באמצעות תעתיקים חיסוניים ותחרות על משאבים שמקורם במארח. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים של התגובות של יתושים שעברו וולבצ'יה לזיהום ויראלי אינם מובנים היטב. מאמר זה מציג פרוטוקול לזיהוי במבחנה של זיהום וולבצ'יה ברמות חומצת הגרעין והחלבון בתאי Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 כדי לשפר את ההבנה של יחסי הגומלין בין וולבצ'יה לבין וקטורים החרקים שלה. באמצעות שימוש משולב בתגובת שרשרת פולימראז (PCR), PCR כמותי, כתם מערבי ושיטות אנליטיות אימונולוגיות, תואר פרוטוקול מורפולוגי סטנדרטי לזיהוי תאים נגועים בוולבצ'יה שהוא מדויק יותר משימוש בשיטה אחת. גישה זו עשויה להיות מיושמת גם על זיהוי של זיהום וולבצ'יה בטקסות חרקים אחרות.

לפני שוולבצ'יה זוהתה, תאי Aa23 ו-Aa23-T נצפו תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע הבדלים מורפולוגיים בין שני קווי התאים. לתאי Aa23 ו-Aa23-T יש לפחות שתי מורפולוגיות של תאים, אך אין הבדל מורפולוגי ברור בין שני סוגי התאים (איור 1). כאן, תאי Aa23 שימשו כמערכת מודל לזיהוי זיהום וולבצ'יה...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

ארבע שיטות שימשו לאיתור וולבצ'יה תוך-תאית, אשר השלימו זו את זו ושיפרו את דיוק הזיהוי של זיהום וולבצ'יה של Aa23 שמקורו ב-Aedes albopictus ו-Aa23-T שנרפאו מזיהום וולבצ'יה מקומי באמצעות אנטיביוטיקה.

זיהוי זן וולבצ'יה wAlbB ב Aedes albopictus קווי תאים

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

פרוטוקול זה מסייע לאמת את קיומה של וולבצ'יה בתאים, המהווה את הבסיס להבנת האינטראקציה בין וולבצ'יה לפונדקאי שלה. בפרוטוקול זה, ארבע שיטות שימשו כדי לזהות בהצלחה זיהום וולבצ'יה תוך תאי, אשר אימת ושיפר את דיוק הזיהוי של זיהום וולבצ'יה של תאים. המדגים את ההליך יהיה Qiuqiu Xiao, בוגר תואר שני מהמעבדה המרכזית לביולוגיה ומאפיינים מודרניים של פתוגנים.התחל על ידי התבוננות בתאי Aa23 ו- Aa23-T שאינם מוכתמים בהגדלה של פי 100 באמצעות מיקרוסקופ אור. תרבית את התאים במשך חמישה עד שבעה ימים כדי להגיע ל-70%-80% מפגש לכל בקבוקון. באמצעות פיפטה, להעביר 1 מ"ל של מדיום התרבית לצינור microcentrifuge.צנטריפוגה ב 100 RCF במשך חמש דקות כדי לקצור את התאים. הסר את הסופרנטנט ואחסן את גלולת התא המתקבלת במינוס 20 מעלות צלזיוס. תרבית את התאים במשך חמישה עד שבעה ימים כדי להגיע ל-90%-100% מפגש לכל בקבוקון.החזירו את הכדורים ב-0.40 מ"ל של PBS והעבירו 50 מיקרוליטרים של פתרון זה לצינור מיקרו-סנטריפוג'. מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של 20 מ"ג/מ"ל פרוטאינז K ודגירה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לאחר מכן דגירו את הצינורות בטמפרטורה של 99 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להשיג את הדנ"א הגולמי ולאחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס.כדי לבצע PCR, הכינו תערובת תגובה כוללת של 20 מיקרוליטרים וקבעו את תנאי ה-PCR כמתואר בכתב היד של הטקסט. זהה את הדנ"א על ג'ל אגרוז 1% באמצעות מדמה ג'ל. בצע הגברה כמותית של PCR באמצעות TB Green במערכת PCR בזמן אמת ורשום את התוצאות של כל תגובה.נתחו את הדנ"א בנפח תגובה כולל של 20 מיקרוליטרים וקבעו את תנאי ה-PCR הכמותיים כמתואר בכתב היד של הטקסט. חשב את מספרי העתקת הגנים WSP ו- RPS6 בתאים על פי עקומת התקן שנקבעה. לאחר מכן חשב את הצפיפות היחסית של וולבצ'יה לפי מספר העותק של wsp/RPS6.נתח את הנתונים באמצעות מבחן t דגימות עצמאי. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מאגר ליזה לכדור התא ודגרו על קרח במשך 30 דקות. צנטריפוגה את הליזאטים ב 12, 000 RCF במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולשאוף את supernatant.נתחו את ריכוז ה-wsp של ה-supernatant באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA, בהתאם להוראות היצרן. טענו כמויות שוות של חלבון על ג'ל SDS-PAGE של 15%. מעבירים את החלבון לקרומי ניטרוצלולוז וחוסמים את הקרומים עם 5% חלב דל שומן למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.לאחר מכן לשטוף את הממברנות שלוש פעמים עם TBST. דגירה של הממברנות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם 100 מיקרוליטרים של נוגדן פוליקלונלי נגד wsp שהוכן על ידי דילול הנוגדן העיקרי עם 5% חלב דל שומן. לשטוף את הנוגדן העיקרי שלוש פעמים עם TBST.הוסיפו 100 מיקרוליטרים של נוגדן משני מצומד של חזרת פרוקסידאז לממברנות והדביקו אותו על שייקר למשך שעה בטמפרטורת החדר. לשטוף את הממברנות שלוש פעמים עם TBST ולערבב 20 microliters של פתרון A ו 20 microliters של פתרון B בערכת זיהוי chemiluminescence ביחס של אחד לאחד. לטבול את כל הממברנה לתוך תמיסת luminescence בו זמנית ולצפות באותות באמצעות מערכת הדמיה רב תכליתית.על צלחת פטרי קונפוקלית בלייזר, הדגירה של תאי Aa23 ו-Aa23-T למשך שלושה עד ארבעה ימים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני אטמוספרי. כאשר התא מגיע למפגש של 60 עד 70%, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS. לתקן את התאים במ"ל אחד של 4% paraformaldehyde במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.שטפו את התאים הקבועים באמצעות PBST במשך חמש דקות ושטפו מחדש את התאים פעמיים באמצעות PBS. הדגירה של צלחת הפטרי במ"ל אחד של אלבומין בסרום 3% בקר למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מוסיפים לשקופיות 100 מיקרוליטרים של נוגדנים פוליקלונליים נגד wsp עכברים וסרום עכברים ומדגרים אותו למשך הלילה בקופסה רטובה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.מוציאים את צלחת הפטרי מהקופסה הרטובה ומחזירים אותה לטמפרטורת החדר. לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS ולהסיר את PBS. הגן על ההליכים הבאים מפני אור.הדגירו את צלחת הפטרי עם 100 מיקרוליטרים של נוגדן נגד עכברים מצומדים של אלקסה פלואור 488 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. דגירו את צלחת הפטרי לדוגמה עם 50 מיקרוליטרים של DAPI מדוללים ב-PBS ל-10 מיקרוגרם/מ"ל ב-37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ואז שטפו אותם שלוש פעמים עם PBS. התבונן בכישרון החיסוני תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.לפני גילוי וולבצ'יה, נצפו תאי Aa23 ו-Aa23-T תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע הבדלים מורפולוגיים בין שני קווי התאים. לתאי Aa23 ו-AA23-T היו לפחות שתי מורפולוגיות של תאים, אך לא נצפו הבדלים מורפולוגיים נראים לעין בין שני סוגי התאים. באמצעות פריימרים אבחנתיים 81F/691R, הגברה חיובית של הגן Wolbachia wsp זוהתה בתאי Aa23 אך לא בתאי Aa23-T.הניתוח של צפיפות וולבצ'יה בקווי התאים הראה יחס wsp/rps6 של 2.4 בתאי Aa23 אך ללא וולבצ'יה בתאי Aa23-T. ניתוח כתמים מערביים של תמציות חלבון הראה אות wsp חזק עבור Aa23, אך לא זוהה אות עבור Aa23-T. בדיקת האימונופלואורסצנציה העקיפה זיהתה את חלבון ה-wsp בתאי Aa23, בעוד שרק דנ"א מוכתם ב-DAPI זוהה בתאי Aa23-T.ודא שבקבוקי התרבית דוגרים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני אטמוספרי למשך חמישה עד שבעה ימים. הליך זה יכול להיות מלווה במיקרוסקופיית אלקטרונים שבה יש לשים לב במיוחד להכנת דגימה ולחתך. ארבע השיטות הניסוייות ששימשו במחקר זה אישרו את דיוק הזיהוי של זיהום וולבצ'יה בתאים, אשר חל גם על סוגים אחרים של תאים ורקמות.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

גזירת הרתי T-cell לימפומה קווים מ כספומט - / -</sup ו P53 - / -</sup עכברים

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

הקמת Epstein-Barr Virus צמיחה הפך שורות תאים Lymphoblastoid

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

מניעת חום מתח תופעות לוואי בחולדות על ידי<em&gt; Subtilis Bacillus</em&gt; זנים

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

זיהוי Cortex שבר במהלך בקטריאלי Spore נביטה

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

תא דם אדום פשוט שיטת תמוגה להקמת שורות תאי B Lymphoblastoid

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

שיטה פשוטה ויעילה להקים NK וקווים תא T של חולים עם דלקת כרונית פעילה וירוס אפשטיין בר

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

התפשטות הטפיל המיקרו-ספורידיאן אדהאזרדיה אדיס ב-Aedes aegypti יתושים

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...