Name: detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

Ringraziamo il Dr. Xin-Ru Wang dell'Università del Minnesota per suggerimenti e indicazioni approfondite. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (No.81760374).

1. Materiali e reagenti
<ol><li>Utilizzare soluzioni e mezzi privi di pirogeni per la coltura cellulare (vedere la Tabella dei materiali).</li>
	<li>Utilizzare acqua ultrapura per preparare tutte le soluzioni.</li>
	<li>Fare attenzione nella selezione del siero bovino fetale (FBS) per la coltura cellulare, seguendo un processo di controllo dei lotti. NOTA: poiché i lotti FBS sono soggetti a modifiche regolari, è impossibile indicare il catalogo e i numeri di lotto pertinenti in qu...

<ol>
	<li>Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+crowding+and+temperature+on+Wolbachia+infection+density+among+life+cycle+stages+of+Aedes+albopictus.">Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus.</a> Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).</li><li>Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+superinfections+and+the+expression+of+cytoplasmic+incompatibility.">Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility.</a> Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).</li><li>Dobson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+distributed+throughout+insect+somatic+and+germ+line+tissues.">Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).</li><li>O'Neill, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+Wolbachia+pipientis+in+an+Aedes+albopictus+cell+line.">In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line.</a> Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).</li><li>Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+Wolbachia+wAlbB+endosymbiont+of+Aedes+albopictus.">Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus.</a> Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).</li><li>Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+and+cytoplasmic+incompatibility+in+mosquitoes.">Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).</li><li>Fallon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+properties+of+an+Aedes+albopictus+mosquito+cell+line+infected+with+Wolbachia+strain+wAlbB.">Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB.</a> In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).</li><li>Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+species+are+infected+with+Wolbachia?-A+statistical+analysis+of+current+data.">How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data.</a> Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).</li><li>Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia:+master+manipulators+of+invertebrate+biology.">Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology.</a> National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).</li><li>Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Wolbachia+infections+in+Southeast+Asian+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae).">Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).</li><li>O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).</li><li>McGraw, E. A., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+insecticides:+new+thinking+on+an+ancient+problem.">Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem.</a> National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).</li><li>Bourtzis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+mosquito-Wolbachia+symbiosis+for+vector+and+disease+control.">Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control.</a> Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).</li><li>Turelli, M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+an+inherited+incompatibility+factor+in+California+Drosophila.">Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila.</a> Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).</li><li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission.">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li><li>Walker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wMel+Wolbachia+strain+blocks+dengue+and+invades+caged+Aedes+aegypti+populations.">The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations.</a> Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).</li><li>Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+virulent+and+inhibit+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+in+Anopheles+gambiae.">Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).</li><li>Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endosymbiotic+bacterium+Wolbachia+induces+resistance+to+dengue+virus+in+Aedes+aegypti.">The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).</li><li>Moreira, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wolbachia+symbiont+in+Aedes+aegypti+limits+infection+with+dengue,+Chikungunya,+and+Plasmodium.">A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium.</a> Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).</li><li>Caragata, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+cholesterol+modulates+pathogen+blocking+by+Wolbachia.">Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).</li><li>Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+uses+a+host+microRNA+to+regulate+transcripts+of+a+methyltransferase,+contributing+to+dengue+virus+inhibition+in+Aedes+aegypti.">Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).</li><li>Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya-Wolbachia+interplay+in+Aedes+albopictus.">Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus.</a> Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).</li><li>Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+induces+density-dependent+inhibition+to+dengue+virus+in+mosquito+cells.">Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).</li><li>Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Culicoides+sonorensis+biting+midge+cell+lines+with+Wolbachia+pipientis.">Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis.</a> Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).</li><li>Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+PCR-based+classification+of+Wolbachia+strains+using+wsp+gene+sequences.">Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.</a> The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).</li><li>Park, M. S., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+PaAtg8+and+roles+of+autophagy+in+adaptation+to+starvation+with+respect+to+the+fat+body+and+midgut+of+the+Americana+cockroach,+Periplaneta+americana.">Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).</li><li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin.">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody.">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li><li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti.">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li><li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence,+Western+blotting,+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever.">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li></ol>

Il rilevamento dell'infezione intracellulare da Wolbachia è essenziale per lo studio delle interazioni Wolbachia-ospite e la conferma del successo della trasfezione di cellule con nuovi ceppi. In questo protocollo, sono stati utilizzati quattro metodi per rilevare con successo l'infezione intracellulare da Wolbachia a livello di acido nucleico e proteine. Questi quattro metodi sperimentali hanno corroborato e migliorato l'accuratezza del rilevamento dell'infezione delle cellule da Wolbachi...

La zanzara tigre asiatica Aedes albopictus (Skuse) (Ditteri: Culicidae), che è un vettore chiave del virus della dengue (DENV) in Asia e in altre parti del mondo1, è un ospite naturale di due tipi di batteri intracellulari, Wolbachia (wAlbA e wAlbB), che sono distribuiti in tutta la linea germinale e nel tessuto somatico 2,3. La linea cellulare Aa23 derivata da embrioni di A. albopictus è costituita da almeno due tipi di cellule morfologiche, entrambe supportano l'infezione4 e possono essere curate dall'infezione nativa di Wolbachia utilizzando antibiotici (Aa23-T). Dato che Aa23 conserva solo wAlbB, è un modello utile per lo studio delle interazioni ospite-endosimbionte 4,5,6.
Wolbachia è trasmesso per via materna e infetta circa il 65% delle specie di insetti 8,9 e il 28% delle specie di zanzare10. Infetta una varietà di tessuti e forma un'intima relazione simbiotica con l'ospite, di solito inducendo incompatibilità citoplasmatica (CI)11 e sostituzione della popolazione manipolando il sistema riproduttivo dell'ospite12,13. Queste risposte dell'ospite sono state osservate in popolazioni naturali di Drosophila simulans14 e in A. aegypti in una gabbia di laboratorio e in una prova sul campo15. Un'importante manipolazione non riproduttiva suscitata da Wolbachia è la resistenza indotta dell'ospite a una varietà di agenti patogeni, tra cui DENV, virus Chikungunya (CHIKV) e virus del Nilo occidentale (WNV)16,17, che può essere mediata da un sistema immunitario innato migliorato del simbionte18,19, competizione tra Wolbachia e virus per le risorse essenziali dell'ospite20 e manipolazione delle vie di difesa virale dell'ospite21 .
Questo protocollo è stato sviluppato per studiare questi meccanismi alla base delle risposte antivirali dell'ospite indotte da Wolbachia. Utilizza quattro metodi di rilevamento dell'infezione intracellulare da Wolbachia delle cellule Aa23. Questi metodi forniscono una solida base teorica per gli studi sull'infezione intracellulare da Wolbachia di altre specie ospiti. Il primo metodo, la PCR, una potente tecnica che consente l'amplificazione enzimatica di specifiche regioni del DNA senza utilizzare procedure di clonazione convenzionali, è stato utilizzato per rilevare il DNA di Wolbachia e determinare la presenza / assenza di infezione da Wolbachia 22. Il secondo metodo misura la densità di copia del DNA di Wolbachia utilizzando la PCR quantitativa (qPCR) per il rilevamento e la misurazione affidabili dei prodotti generati durante ogni ciclo PCR che è direttamente proporzionale alla quantità di modello prima della PCR23. Il terzo metodo rileva la presenza di proteine Wolbachia intracellulari , utilizzando western blot, uno degli strumenti più potenti per rilevare proteine specifiche in miscele complesse combinando l'elevato potere di separazione dell'elettroforesi, la specificità degli anticorpi e la sensibilità delle reazioni enzimatiche cromogeniche. Il metodo finale è un test di immunofluorescenza (IFA) che combina immunologia, biochimica e microscopia per rilevare la proteina di superficie wolbachia (wsp) attraverso una reazione antigene-anticorpo per confermare l'assorbimento cellulare di Wolbachia e determinarne la localizzazione cellulare.
Questo documento descrive i quattro metodi sopra elencati per verificare l'esistenza di Wolbachia nelle cellule, che possono essere utilizzati per rilevare se la Wolbachia esogena è stata trasfetta con successo e la Wolbachia nella cellula è stata eliminata. Dopo aver determinato se Wolbachia è presente nelle cellule o meno, è possibile eseguire una varietà di analisi diverse, tra cui genomica, proteomica o metabolomica. Questo protocollo dimostra il rilevamento di Wolbachia attraverso le cellule Aa23, ma può essere utilizzato anche in altre cellule.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SteREO Discovery V8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Pipetman</td>
			<td>F167380</td>
			<td>P10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cerium doped yttrium aluminum garnet</td>
			<td>MSE Supplies</td>
			<td></td>
			<td>Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip holder</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Cargille Laboratories</td>
			<td>16482</td>
			<td>Type A low viscosity 150 cSt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR light source&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LED1085L</td>
			<td>LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outer ring&#160;</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump lasers&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LD785-SE400</td>
			<td>785 nm, 400 mW, &#216;9 mm, E Pin Code, Laser Diode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raspberry Pi</td>
			<td>Raspberry Pi Fundation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td>SM1 retaining ring for &#216;1&#34; lens tubes and mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedless quartz crystal</td>
			<td>University Wafers, Inc.</td>
			<td>U01-W2-L-190514</td>
			<td>25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shim</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray beam stop</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines

Come endosimbionte materno, Wolbachia infetta grandi proporzioni di popolazioni di insetti. Gli studi hanno recentemente riportato il successo della regolazione della trasmissione del virus a RNA utilizzando zanzare trasfettate da Wolbachia. Le strategie chiave per controllare i virus includono la manipolazione della riproduzione dell'ospite attraverso l'incompatibilità citoplasmatica e l'inibizione dei trascritti virali attraverso l'innesco immunitario e la competizione per le risorse derivate dall'ospite. Tuttavia, i meccanismi alla base delle risposte delle zanzare trasfettate da Wolbachia all'infezione virale sono poco compresi. Questo documento presenta un protocollo per l'identificazione in vitro dell'infezione da Wolbachia a livello di acido nucleico e proteine nelle cellule Aa23 di Aedes albopictus (Ditteri: Culicidae) per migliorare la comprensione delle interazioni tra Wolbachia e i suoi insetti vettori. Attraverso l'uso combinato di reazione a catena della polimerasi (PCR), PCR quantitativa, western blot e metodi analitici immunologici, è stato descritto un protocollo morfologico standard per il rilevamento di cellule infette da Wolbachia che è più accurato dell'uso di un singolo metodo. Questo approccio può anche essere applicato alla rilevazione dell'infezione da Wolbachia in altri taxa di insetti.

Prima che Wolbachia fosse rilevata , le cellule Aa23 e Aa23-T sono state osservate al microscopio ottico per determinare eventuali differenze morfologiche tra le due linee cellulari. Le cellule Aa23 e Aa23-T hanno almeno due morfologie cellulari ma nessuna evidente differenza morfologica tra i due tipi di cellule (Figura 1). Qui, le cellule Aa23 sono state utilizzate come sistema modello per rilevare l'infezione da Wolbachia utilizzando quattro metodi. L'am...

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Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Sono stati utilizzati quattro metodi per rilevare Wolbachia intracellulare, che si sono completati a vicenda e hanno migliorato l'accuratezza del rilevamento dell'infezione da Wolbachia di Aa23 derivato da Aedes albopictus e Aa23-T curato dall'infezione nativa di Wolbachia utilizzando antibiotici.

Rilevamento del ceppo Wolbachia wAlbB nelle linee cellulari Aedes albopictus

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Questo protocollo aiuta a verificare l'esistenza di Wolbachia nelle cellule, che è la base per comprendere l'interazione tra Wolbachia e il suo ospite. In questo protocollo, sono stati utilizzati quattro metodi per rilevare con successo l'infezione intracellulare da Wolbachia, che ha corroborato e migliorato l'accuratezza del rilevamento dell'infezione delle cellule di Wolbachia. A dimostrare la procedura sarà Qiuqiu Xiao, un post-laurea del Key Laboratory of Modern Pathogen Biology and Characteristics.Inizia osservando le cellule Aa23 e Aa23-T non macchiate con ingrandimento 100x usando la microscopia ottica. Coltivare le cellule per cinque-sette giorni per raggiungere il 70-80% di confluenza per pallone. Utilizzando una pipetta, trasferire 1 mL del terreno di coltura in un tubo di microcentrifuga.Centrifugare a 100 RCF per cinque minuti per raccogliere le cellule. Rimuovere il surnatante e conservare il pellet cellulare risultante a meno 20 gradi Celsius. Coltivare le cellule per cinque-sette giorni per raggiungere il 90-100% di confluenza per pallone.Sospendere il pellet in 0,40 ml di PBS e trasferire 50 microlitri di questa soluzione in un tubo microcentrifuga. Aggiungere cinque microlitri di 20 mg/mL di proteinasi K e incubare a 55 gradi Celsius per un'ora. Quindi incubare i tubi a 99 gradi Celsius per 15 minuti per ottenere il DNA grezzo e conservarlo a meno 20 gradi Celsius.Per eseguire la PCR, preparare una miscela di reazione totale di 20 microlitri e impostare le condizioni pcr come descritto nel manoscritto di testo. Rileva il DNA su un gel di agarosio all'1% usando un imager in gel. Eseguire l'amplificazione QUANTITATIVA PCR utilizzando TB Green in un sistema PCR in tempo reale e registrare i risultati di ogni reazione.Analizzare il DNA in un volume di reazione totale di 20 microlitri e impostare le condizioni quantitative di PCR come descritto nel manoscritto di testo. Calcola i numeri di copia del gene WSP e RPS6 nelle cellule secondo la curva standard stabilita. Quindi calcolare la densità relativa di Wolbachia in base al numero di copie di wsp/RPS6.Analizzare i dati utilizzando un t-test di campioni indipendenti. Aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi al pellet cellulare e incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Centrifugare i lisati a 12.000 RCF per 10 minuti a quattro gradi Celsius e aspirare il surnatante.Analizzare la concentrazione di wsp del surnatante utilizzando un kit di analisi delle proteine BCA, seguendo le istruzioni del produttore. Carica quantità uguali di proteine su un gel SDS-PAGE al 15%. Trasferire la proteina alle membrane nitrocellulosiche e bloccare le membrane con latte scremato al 5% per due ore a temperatura ambiente.Quindi lavare le membrane tre volte con TBST. Incubare le membrane durante la notte a 4 gradi Celsius con 100 microlitri di anticorpo policlonale anti-wsp preparati diluendo l'anticorpo primario con il 5% di latte scremato. Lavare l'anticorpo primario tre volte con TBST.Aggiungere 100 microlitri di anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano alle membrane e incubarlo su uno shaker per un'ora a temperatura ambiente. Lavare le membrane tre volte con TBST e mescolare 20 microlitri di soluzione A e 20 microlitri di soluzione B nel kit di rilevamento della chemiluminescenza con un rapporto di uno a uno. Immergere contemporaneamente l'intera membrana nella soluzione di luminescenza e osservare i segnali utilizzando un sistema di imaging multifunzionale.Su una capsula di Petri confocale laser, incubare le cellule Aa23 e Aa23-T per tre o quattro giorni a 28 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica atmosferica. Quando la cellula raggiunge il 60-70% di confluenza, lavare le cellule tre volte con PBS. Fissare le cellule in un mL di paraformaldeide al 4% per 20 minuti a quattro gradi Celsius.Lavare le celle fisse usando PBST per cinque minuti e lavare nuovamente le cellule due volte con PBS. Incubare la capsula di Petri in un mL di albumina sierica bovina al 3% per un'ora a 37 gradi Celsius. Aggiungere 100 microlitri di anticorpi policlonali anti-wsp di topo e siero di topo ai vetrini e incubarlo durante la notte in una scatola bagnata a quattro gradi Celsius.Rimuovere la capsula di Petri dalla scatola bagnata e riportarla a temperatura ambiente. Lavarli tre volte con PBS e rimuovere il PBS. Proteggere le seguenti procedure dalla luce.Incubare la capsula di Petri con 100 microlitri di un anticorpo anti-topo di capra coniugato Alexa Fluor 488 a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Incubare la capsula di Petri campione con 50 microlitri di DAPI diluiti in PBS a 10 microgrammi/ml a 37 gradi Celsius per cinque minuti e poi lavarli tre volte con PBS. Osservare l'immunocolorazione al microscopio confocale.Prima di rilevare Wolbachia, le cellule Aa23 e Aa23-T sono state osservate al microscopio ottico per determinare le differenze morfologiche tra le due linee cellulari. Le cellule Aa23 e AA23-T avevano almeno due morfologie cellulari, ma non sono state osservate apparenti differenze morfologiche tra i due tipi di cellule. Utilizzando i primer diagnostici 81F/691R, l'amplificazione positiva del gene Wolbachia wsp è stata rilevata nelle cellule Aa23 ma non nelle cellule Aa23-T.L'analisi della densità di Wolbachia nelle linee cellulari ha mostrato un rapporto wsp/rps6 di 2,4 nelle cellule Aa23 ma nessun Wolbachia nelle cellule Aa23-T. L'analisi Western blot degli estratti proteici ha mostrato un forte segnale wsp per Aa23, ma nessun segnale è stato rilevato per Aa23-T. Il test di immunofluorescenza indiretta ha rilevato la proteina wsp nelle cellule Aa23, mentre solo il DNA colorato con DAPI è stato rilevato nelle cellule Aa23-T.Assicurarsi che i palloni di coltura siano incubati a 28 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica atmosferica per cinque-sette giorni. Questa procedura può essere seguita dalla microscopia elettronica in cui è necessario prestare particolare attenzione alla preparazione del campione e al sezionamento. I quattro metodi sperimentali utilizzati in questo studio hanno confermato l'accuratezza del rilevamento dell'infezione da Wolbachia nelle cellule, che è applicabile anche ad altri tipi di cellule e tessuti.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

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Derivazione di timica linfoma a cellule T Linee da Atm - / -</sup E P53 - / -</sup Mouse

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Ricerca

Immunologia e infezioni

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