Name: detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

ミネソタ大学のXin-Ru Wang博士の洞察に満ちた提案と指導に感謝します。この研究は、中国国家自然科学財団(No.81760374)からの助成金によって支援されました。

1. 材料と試薬
<ol><li>細胞培養には発熱物質を含まない溶液および培地を使用してください( 材料表を参照)。</li>
	<li>超純水を使用してすべての溶液を調製します。</li>
	<li>細胞培養用のウシ胎児血清(FBS)を選択する際には、ロットチェックプロセスに従って注意してください。 注: FBS ロットは定期的に変更されるため、このプロトコルで関連するカタログとロット...

<ol>
	<li>Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+crowding+and+temperature+on+Wolbachia+infection+density+among+life+cycle+stages+of+Aedes+albopictus.">Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus.</a> Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).</li><li>Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+superinfections+and+the+expression+of+cytoplasmic+incompatibility.">Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility.</a> Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).</li><li>Dobson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+distributed+throughout+insect+somatic+and+germ+line+tissues.">Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).</li><li>O'Neill, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+Wolbachia+pipientis+in+an+Aedes+albopictus+cell+line.">In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line.</a> Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).</li><li>Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+Wolbachia+wAlbB+endosymbiont+of+Aedes+albopictus.">Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus.</a> Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).</li><li>Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+and+cytoplasmic+incompatibility+in+mosquitoes.">Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).</li><li>Fallon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+properties+of+an+Aedes+albopictus+mosquito+cell+line+infected+with+Wolbachia+strain+wAlbB.">Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB.</a> In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).</li><li>Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+species+are+infected+with+Wolbachia?-A+statistical+analysis+of+current+data.">How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data.</a> Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).</li><li>Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia:+master+manipulators+of+invertebrate+biology.">Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology.</a> National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).</li><li>Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Wolbachia+infections+in+Southeast+Asian+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae).">Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).</li><li>O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).</li><li>McGraw, E. A., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+insecticides:+new+thinking+on+an+ancient+problem.">Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem.</a> National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).</li><li>Bourtzis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+mosquito-Wolbachia+symbiosis+for+vector+and+disease+control.">Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control.</a> Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).</li><li>Turelli, M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+an+inherited+incompatibility+factor+in+California+Drosophila.">Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila.</a> Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).</li><li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission.">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li><li>Walker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wMel+Wolbachia+strain+blocks+dengue+and+invades+caged+Aedes+aegypti+populations.">The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations.</a> Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).</li><li>Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+virulent+and+inhibit+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+in+Anopheles+gambiae.">Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).</li><li>Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endosymbiotic+bacterium+Wolbachia+induces+resistance+to+dengue+virus+in+Aedes+aegypti.">The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).</li><li>Moreira, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wolbachia+symbiont+in+Aedes+aegypti+limits+infection+with+dengue,+Chikungunya,+and+Plasmodium.">A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium.</a> Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).</li><li>Caragata, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+cholesterol+modulates+pathogen+blocking+by+Wolbachia.">Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).</li><li>Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+uses+a+host+microRNA+to+regulate+transcripts+of+a+methyltransferase,+contributing+to+dengue+virus+inhibition+in+Aedes+aegypti.">Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).</li><li>Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya-Wolbachia+interplay+in+Aedes+albopictus.">Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus.</a> Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).</li><li>Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+induces+density-dependent+inhibition+to+dengue+virus+in+mosquito+cells.">Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).</li><li>Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Culicoides+sonorensis+biting+midge+cell+lines+with+Wolbachia+pipientis.">Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis.</a> Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).</li><li>Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+PCR-based+classification+of+Wolbachia+strains+using+wsp+gene+sequences.">Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.</a> The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).</li><li>Park, M. S., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+PaAtg8+and+roles+of+autophagy+in+adaptation+to+starvation+with+respect+to+the+fat+body+and+midgut+of+the+Americana+cockroach,+Periplaneta+americana.">Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).</li><li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin.">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody.">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li><li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti.">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li><li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence,+Western+blotting,+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever.">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li></ol>

細胞内ボルバキア感染の検出は、ボルバキアと宿主の相互作用の研究および新規株による細胞のトランスフェクションの成功の確認に不可欠である。このプロトコールでは、核酸およびタンパク質レベルで細胞内Wolbachia感染を首尾よく検出するために4つの方法が使用された。これら4つの実験方法は、細胞のボルバキア感染の検出精度を裏付け、改善した。
<p cla...

アジアおよび世界の他の地域におけるデング熱ウイルス(DENV)の重要なベクターであるアジアのトラ蚊Aedes albopictus(Skuse)(双翅目:Culicidae)1は、生殖細胞系および体細胞組織全体に分布する2種類の細胞内細菌、Wolbachia(wAlbAおよびwAlbB)の天然宿主である2,3。A. albopictus胚に由来するAa23細胞株は、少なくとも2つの形態学的細胞型からなり、いずれも感染4を支持し、抗生物質(Aa23−T)を用いて天然のボルバキア感染を治癒させることができる。Aa23がwAlbBのみを保持することを考えると、宿主-内共生相互作用4,5,6の研究に有用なモデルである。
Wolbachiaは母体に伝染し、昆虫種の推定65%、8,9、蚊種の28%に感染します10。それは様々な組織に感染し、宿主と密接な共生関係を形成し、通常は宿主生殖器系を操作することによって細胞質不適合(CI)11および集団置換を誘導する12、13。これらの宿主応答は、ショウジョウバエのシミュラン14の自然集団および実験室ケージおよび野外試験15のA. aegyptiにおいて観察されている。Wolbachiaによって惹起される重要な非生殖操作は、DENV、チクングニアウイルス(CHIKV)、および西ナイルウイルス(WNV)16、17を含む様々な病原体に対する宿主耐性を誘導することであり、それは共生生物の改良された自然免疫系18、19、必須宿主資源のためのボルバキアとウイルスとの間の競合20、および宿主ウイルス防御経路21の操作によって媒介され得る.
このプロトコルは、ボルバキア誘導宿主抗ウイルス応答のこれらの根底にあるメカニズムを研究するために開発された。これは、Aa23細胞の細胞内ボルバキア感染の検出の4つの方法を使用する。これらの方法は、他の宿主種の細胞内ボルバキア感染の研究のための強力な理論的基礎を提供する。最初の方法であるPCR(従来のクローニング手順を使用せずにDNAの特定の領域を酵素的に増幅することを可能にする強力な技術)を使用して、ボルバキアDNAを検出し、ボルバキア感染の有無を決定しました22。第2の方法は、定量PCR(qPCR)を使用してボルバキアDNAコピー密度を測定し、PCR23前の鋳型の量に正比例する各PCRサイクル中に生成された産物の信頼性の高い検出および測定を行う。第3の方法は、電気泳動の高い分離力、抗体の特異性、発色酵素反応の感度を組み合わせることにより、複雑な混合物中の特定のタンパク質を検出するための最も強力なツールの1つであるウェスタンブロットを使用して、細胞内Wolbachiaタンパク質の存在を検出します。最後の方法は、免疫学、生化学、顕微鏡を組み合わせた免疫蛍光アッセイ(IFA)で、抗原抗体反応によってボルバキア表面タンパク質(wsp)を検出し、ウォルバキアの細胞取り込みを確認し、その細胞局在を決定します。
この論文では、細胞内のボルバキアの存在を検証するために上記の4つの方法を説明し、外因性のボルバキアが正常にトランスフェクトされ、細胞内のボルバキアがクリアされたかどうかを検出するために使用できます。Wolbachiaが細胞に存在するかどうかを決定した後、ゲノミクス、プロテオミクス、またはメタボロミクスを含む様々な異なる分析を行うことができる。このプロトコルは、Aa23細胞を介したボルバキアの検出を実証するが、他の細胞でも使用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SteREO Discovery V8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Pipetman</td>
			<td>F167380</td>
			<td>P10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cerium doped yttrium aluminum garnet</td>
			<td>MSE Supplies</td>
			<td></td>
			<td>Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip holder</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Cargille Laboratories</td>
			<td>16482</td>
			<td>Type A low viscosity 150 cSt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR light source&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LED1085L</td>
			<td>LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outer ring&#160;</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump lasers&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LD785-SE400</td>
			<td>785 nm, 400 mW, &#216;9 mm, E Pin Code, Laser Diode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raspberry Pi</td>
			<td>Raspberry Pi Fundation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td>SM1 retaining ring for &#216;1&#34; lens tubes and mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedless quartz crystal</td>
			<td>University Wafers, Inc.</td>
			<td>U01-W2-L-190514</td>
			<td>25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shim</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray beam stop</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines

母体に抱かれている内共生生物として、ウォルバキアは昆虫集団の大部分に感染しています。研究は最近、ボルバキアトランスフェクトされた蚊を用いたRNAウイルス感染の成功した調節を報告している。ウイルスを制御するための重要な戦略には、細胞質非適合性を介した宿主再生の操作、免疫プライミングおよび宿主由来資源の競合によるウイルス転写産物の阻害が含まれる。しかし、ウイルス感染に対するボルバキアトランスフェクト蚊の応答の根底にあるメカニズムはほとんど理解されていない。この論文は、Aedes albopictus(双翅目:Culicidae)Aa23細胞における核酸およびタンパク質レベルでのボルバキア感染のin vitro同定のためのプロトコルを提示し、Wolbachiaとその昆虫ベクターとの間の相互作用の理解を深める。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、定量PCR、ウェスタンブロット、および免疫学的分析方法の併用により、単一の方法の使用よりも正確なWolbachia感染細胞の検出のための標準的な形態学的プロトコルが記載されている。このアプローチは、他の昆虫分類群におけるボルバキア感染の検出にも適用され得る。

ボルバキアが検出される前に、Aa23およびAa23-T細胞を光学顕微鏡下で観察し、2つの細胞株間の形態学的差異を決定した。Aa23およびAa23-T細胞は、少なくとも2つの細胞形態を有するが、2つの細胞型の間に明らかな形態学的差異はない(図1)。ここで、Aa23細胞をモデル系として用い、4つの方法を用いてボルバキア感染を検出した。診断用プライマ...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

細胞内ボルバキアの検出には4つの方法を用い、抗生物質を用いた天然型ボルバキア感染症を治したヒトスジシマカ由来Aa23とAa23-Tのボルバキア感染の検出精度を向上させ、互いに補完し合いました。

ヒトスジシマカ細胞株における ボルバキア 株 wAlbBの 検出

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

このプロトコルは、細胞内のボルバキアの存在を検証するのに役立ち、これはボルバキアとその宿主との間の相互作用を理解する基礎である。このプロトコールでは、細胞内ボルバキア感染を首尾よく検出するために4つの方法が使用され、これは細胞のボルバキア感染の検出精度を裏付け、改善した。手順を実演するのは、現代病原体生物学と特性の主要研究室の大学院生であるQiuqiu Xiaoです。まず、染色されていないAa23およびAa23-T細胞を、光学顕微鏡を用いて倍率100倍で観察することから始めます。フラスコあたり70〜80%のコンフルエントに達するまで細胞を5〜7日間培養する。ピペットを用いて、1 mLの培養液を微量遠心チューブに移す。100 RCFで5分間遠心分離し、細胞を回収した。上清を除去し、得られた細胞ペレットを摂氏マイナス20度で保存する。フラスコあたり90〜100%のコンフルエントに達するまで細胞を5〜7日間培養する。ペレットを0.40mLのPBSに再懸濁し、この溶液50マイクロリットルを微量遠心管に移す。5マイクロリットルの20mg/mLプロテイナーゼKを加え、摂氏55度で1時間インキュベートする。その後、チューブを摂氏99度で15分間インキュベートして粗DNAを取得し、摂氏マイナス20度で保存します。PCRを行うには、20マイクロリットルの総反応混合物を調製し、テキスト原稿に記載されているようにPCR条件を設定する。ゲルイメージャーを使用して、1%アガロースゲル上のDNAを検出します。リアルタイムPCRシステムでTB Greenを用いて定量PCR増幅を行い、各反応の結果を記録します。総反応量20マイクロリットルのDNAを分析し、テキスト原稿に記載されているように定量的PCR条件を設定する。確立された標準曲線に従って細胞中のWSPおよびRPS6遺伝子コピー数を計算する。次に、wsp/RPS6のコピー数でボルバキア相対密度を計算します。独立サンプルの t 検定を使用してデータを分析します。細胞ペレットに200マイクロリットルの溶解バッファーを加え、氷上で30分間インキュベートする。溶解液を12, 000 RCFで摂氏4度で10分間遠心分離し、上清を吸引する。製造業者の指示に従って、BCAタンパク質アッセイキットを用いて上清のwsp濃度を分析する。15%SDS-PAGEゲルに等量のタンパク質をロードします。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、室温で2時間、5%の脱脂粉乳で膜をブロックする。その後、TBSTで膜を3回洗浄する。一次抗体を5%スキムミルクで希釈することによって調製した100マイクロリットルの抗wspポリクローナル抗体と共に、摂氏4度で一晩膜をインキュベートする。一次抗体をTBSTで3回洗浄する。100マイクロリットルの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を膜に加え、シェーカー上で室温で1時間インキュベートする。TBSTで膜を3回洗浄し、20マイクロリットルの溶液Aと20マイクロリットルの溶液Bを化学発光検出キットに1対1の比率で混合する。膜全体を発光溶液に同時に浸漬し、多機能イメージングシステムを使用して信号を観察する。レーザー共焦点ペトリ皿で、Aa23およびAa23-T細胞を5%の大気二酸化炭素下で摂氏28度で3〜4日間インキュベートします。細胞が60〜70%のコンフルエントに達したら、PBSで細胞を3回洗浄する。細胞を1mLの4%パラホルムアルデヒドで摂氏4度で20分間固定する。PBSTを使用して固定細胞を5分間洗浄し、PBSで細胞を2回再洗浄する。3%のウシ血清アルブミン1mL中のペトリ皿を摂氏37度で1時間インキュベートする。100マイクロリットルのマウス抗wspポリクローナル抗体とマウス血清をスライドに加え、摂氏4度の湿った箱の中で一晩インキュベートする。濡れた箱からシャーレを取り出し、室温に戻します。PBSで3回洗い流し、PBSを取り除きます。次の手順を光から守ります。ペトリ皿を100マイクロリットルのAlexa Fluor 488結合ヤギ抗マウス抗体とともに摂氏37度で30分間インキュベートします。サンプルペトリ皿をPBSで希釈した50マイクロリットルのDAPIを摂氏37度で10マイクログラム/ mLに5分間インキュベートし、PBSで3回洗浄する。免疫染色を共焦点顕微鏡で観察する。ボルバキアを検出する前に、Aa23およびAa23-T細胞を光学顕微鏡下で観察し、2つの細胞株間の形態学的差異を決定した。Aa23およびAA23-T細胞は少なくとも2つの細胞形態を有していたが、2つの細胞型の間に明らかな形態学的差異は観察されなかった。診断用プライマー81F/691Rを用いて、Wolbachia wsp遺伝子の陽性増幅はAa23細胞で検出されたが、Aa23-T細胞では検出されなかった。細胞株におけるボルバキア密度の分析は、Aa23細胞では2.4のwsp/rps6比を示したが、Aa23-T細胞ではウォルバキアは示さなかった。タンパク質抽出物のウェスタンブロット分析は、Aa23について強いwspシグナルを示したが、Aa23-Tについてはシグナルは検出されなかった。間接免疫蛍光アッセイでは、Aa23細胞でwspタンパク質が検出されましたが、Aa23-T細胞ではDAPI染色DNAのみが検出されました。培養フラスコを摂氏28度で5%の大気二酸化炭素下で5〜7日間インキュベートすることを確認します。この手順は、サンプル調製と切片化に特に注意を払う必要がある電子顕微鏡観察によって続くことができます。本研究で用いた4つの実験方法により、他の種類の細胞や組織にも適用可能な細胞におけるボルバキア感染の検出精度が確認された。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

から胸腺リンパ腫のT細胞株の導出 ATM - / -</supと p53の - / -</supマウス

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Epstein - Barrウイルスの成長形質転換リンパ芽球様細胞株の樹立

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

過ヨウ素酸シッフ染色で末梢血単核細胞中のグリコーゲンの検出

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

熱の予防によりラットに悪影響をストレス<em&gt;枯草菌</em&gt;ひずみ

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

細菌胞子の発芽中に皮質断片を検出

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

Bリンパ芽球様細胞株の樹立のためのシンプルな赤血球溶解法

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

NK と慢性的なアクティブなエプスタイン ‐ バーウイルス感染症から T 細胞株を確立する効率的かつ簡単な方法

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

検出細胞毒性アミロイド次感染症の肺による内皮細胞緑膿菌法

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

アエデスアエジプティ蚊における微小胞体寄生虫・エダリア・アダイスの伝播

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

ヒトスジシマカ細胞株における ボルバキア 株 wAlbBの 検出

ヒトスジシマカ細胞株におけるボルバキア株 wAlbBの検出