Name: detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

우리는 통찰력있는 제안과지도에 대한 미네소타 대학의 Xin-Ru Wang 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No.81760374)의 보조금으로 지원되었습니다.

1. 재료 및 시약
<ol><li>세포 배양을 위해 발열원이없는 용액과 배지를 사용하십시오 ( 재료 표 참조).</li>
	<li>초순수를 사용하여 모든 용액을 준비하십시오.</li>
	<li>세포 배양을 위해 태아 소 혈청 (FBS)을 선택할 때 조심하십시오, 로트 확인 과정을 따르십시오. 참고: FBS 로트는 정기적으로 변경될 수 있으므로 이 프로토콜에서 관련 카탈로그 및 로트 번호를 명시하는 것...

<ol>
	<li>Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+crowding+and+temperature+on+Wolbachia+infection+density+among+life+cycle+stages+of+Aedes+albopictus.">Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus.</a> Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).</li><li>Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+superinfections+and+the+expression+of+cytoplasmic+incompatibility.">Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility.</a> Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).</li><li>Dobson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+distributed+throughout+insect+somatic+and+germ+line+tissues.">Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).</li><li>O'Neill, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+Wolbachia+pipientis+in+an+Aedes+albopictus+cell+line.">In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line.</a> Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).</li><li>Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+Wolbachia+wAlbB+endosymbiont+of+Aedes+albopictus.">Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus.</a> Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).</li><li>Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+and+cytoplasmic+incompatibility+in+mosquitoes.">Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).</li><li>Fallon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+properties+of+an+Aedes+albopictus+mosquito+cell+line+infected+with+Wolbachia+strain+wAlbB.">Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB.</a> In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).</li><li>Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+species+are+infected+with+Wolbachia?-A+statistical+analysis+of+current+data.">How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data.</a> Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).</li><li>Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia:+master+manipulators+of+invertebrate+biology.">Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology.</a> National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).</li><li>Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Wolbachia+infections+in+Southeast+Asian+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae).">Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).</li><li>O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).</li><li>McGraw, E. A., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+insecticides:+new+thinking+on+an+ancient+problem.">Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem.</a> National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).</li><li>Bourtzis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+mosquito-Wolbachia+symbiosis+for+vector+and+disease+control.">Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control.</a> Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).</li><li>Turelli, M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+an+inherited+incompatibility+factor+in+California+Drosophila.">Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila.</a> Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).</li><li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission.">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li><li>Walker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wMel+Wolbachia+strain+blocks+dengue+and+invades+caged+Aedes+aegypti+populations.">The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations.</a> Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).</li><li>Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+virulent+and+inhibit+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+in+Anopheles+gambiae.">Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).</li><li>Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endosymbiotic+bacterium+Wolbachia+induces+resistance+to+dengue+virus+in+Aedes+aegypti.">The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).</li><li>Moreira, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wolbachia+symbiont+in+Aedes+aegypti+limits+infection+with+dengue,+Chikungunya,+and+Plasmodium.">A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium.</a> Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).</li><li>Caragata, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+cholesterol+modulates+pathogen+blocking+by+Wolbachia.">Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).</li><li>Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+uses+a+host+microRNA+to+regulate+transcripts+of+a+methyltransferase,+contributing+to+dengue+virus+inhibition+in+Aedes+aegypti.">Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).</li><li>Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya-Wolbachia+interplay+in+Aedes+albopictus.">Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus.</a> Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).</li><li>Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+induces+density-dependent+inhibition+to+dengue+virus+in+mosquito+cells.">Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).</li><li>Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Culicoides+sonorensis+biting+midge+cell+lines+with+Wolbachia+pipientis.">Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis.</a> Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).</li><li>Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+PCR-based+classification+of+Wolbachia+strains+using+wsp+gene+sequences.">Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.</a> The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).</li><li>Park, M. S., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+PaAtg8+and+roles+of+autophagy+in+adaptation+to+starvation+with+respect+to+the+fat+body+and+midgut+of+the+Americana+cockroach,+Periplaneta+americana.">Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).</li><li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin.">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody.">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li><li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti.">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li><li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence,+Western+blotting,+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever.">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li></ol>

세포 내 울바키아 감염의 검출은 울바키아-숙주 상호작용의 연구와 새로운 균주를 가진 세포의 성공적인 형질감염의 확인에 필수적이다. 이 프로토콜에서는 핵산 및 단백질 수준에서 세포 내 울바키아 감염을 성공적으로 검출하기 위해 네 가지 방법이 사용되었습니다. 이 네 가지 실험 방법은 세포의 울바키아 감염의 검출 정확도를 확증하고 개선시켰다.
<p class="jove...

아시아 호랑이 모기 Aedes albopictus (Skuse) (Diptera : Culicidae)는 아시아 및 세계1의 다른 지역에서 뎅기열 바이러스 (DENV)의 핵심 벡터이며, 생식선과 체세포 조직 2,3에 걸쳐 분포하는 두 가지 유형의 세포 내 박테리아 인 Wolbachia (wAlbA 및 wAlbB)의 자연 숙주입니다. A. 알보픽투스 배아로부터 유래된 Aa23 세포주는 적어도 두 가지 형태학적 세포 유형으로 구성되며, 둘 다 감염4를 지지하고 항생제(Aa23-T)를 사용하여 천연 울바키아 감염을 치료할 수 있다. Aa23이 단지 wAlbB만을 보유한다는 것을 감안할 때, 숙주-endosymbiont 상호작용 4,5,6의 연구에 유용한 모델이다.
울바키아는 모성으로 전염되며 곤충 종 8,9의 약 65 %와 모기 종10의 28 %를 감염시킵니다. 그것은 다양한 조직을 감염시키고 숙주와 친밀한 공생 관계를 형성하며, 일반적으로 숙주 생식 시스템(12,13)을 조작함으로써 세포질 비적합성(CI)11 및 집단 대체를 유도한다. 이러한 숙주 반응은 초파리 시뮬란(14)의 자연 개체군에서, 그리고 실험실 케이지 및 현장 시험(15)에서 A. aegypti에서 관찰되었다. 울바키아에 의해 도출된 중요한 비생식 조작은 DENV, 치쿤구냐 바이러스(CHIKV) 및 웨스트나일 바이러스(WNV)16,17을 포함하는 다양한 병원체에 대한 숙주 내성을 유도하는데, 이는 공생18,19의 개선된 선천적 면역계, 필수 숙주 자원에 대한 울바키아와 바이러스 사이의 경쟁(20), 및 숙주 바이러스 방어 경로의 조작(21)에 의해 매개될 수 있다. .
이 프로토콜은 울바키아-유도된 숙주 항바이러스 반응의 이러한 근본적인 메카니즘을 연구하기 위해 개발되었다. 그것은 Aa23 세포의 세포 내 울바키아 감염의 검출의 네 가지 방법을 사용합니다. 이러한 방법은 다른 숙주 종의 세포 내 울바키아 감염에 대한 연구를위한 강력한 이론적 기반을 제공합니다. 첫 번째 방법은, PCR-종래의 클로닝 절차를 이용하지 않고 DNA의 특정 영역의 효소적 증폭을 허용하는 강력한 기술-울바키아 DNA를 검출하고 울바키아 감염(22)의 존재/부재를 결정하기 위해 사용되었다. 두 번째 방법은 PCR23 이전의 주형의 양에 직접적으로 비례하는 각 PCR 주기 동안 생성된 산물의 신뢰할 수 있는 검출 및 측정을 위해 정량적 PCR(qPCR)을 사용하여 울바키아 DNA 카피 밀도를 측정한다. 세 번째 방법은 전기 영동의 높은 분리력, 항체의 특이성 및 발색 효소 반응의 민감도를 결합하여 복잡한 혼합물에서 특정 단백질을 검출하는 가장 강력한 도구 중 하나 인 웨스턴 블롯을 사용하여 세포 내 Wolbachia 단백질의 존재를 감지합니다. 최종 방법은 면역학, 생화학 및 현미경을 결합하여 항원 - 항체 반응을 통해 울바키아 표면 단백질 (wsp)을 검출하여 울바키아의 세포 흡수를 확인하고 세포 국소화를 결정하는 면역 형광 분석 (IFA)입니다.
이 논문은 세포에 Wolbachia의 존재를 확인하기 위해 위에 열거 된 네 가지 방법을 설명합니다.이 방법은 외인성 Wolbachia가 성공적으로 형질감염되었고 세포의 Wolbachia가 제거되었는지 여부를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. Wolbachia가 세포에 존재하는지 여부를 결정한 후, 유전체학, 프로테오믹스 또는 대사체학을 포함한 다양한 분석을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 Aa23 세포를 통한 울바키아의 검출을 보여 주지만 다른 세포에서도 사용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SteREO Discovery V8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Pipetman</td>
			<td>F167380</td>
			<td>P10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cerium doped yttrium aluminum garnet</td>
			<td>MSE Supplies</td>
			<td></td>
			<td>Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip holder</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Cargille Laboratories</td>
			<td>16482</td>
			<td>Type A low viscosity 150 cSt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR light source&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LED1085L</td>
			<td>LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outer ring&#160;</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump lasers&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LD785-SE400</td>
			<td>785 nm, 400 mW, &#216;9 mm, E Pin Code, Laser Diode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raspberry Pi</td>
			<td>Raspberry Pi Fundation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td>SM1 retaining ring for &#216;1&#34; lens tubes and mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedless quartz crystal</td>
			<td>University Wafers, Inc.</td>
			<td>U01-W2-L-190514</td>
			<td>25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shim</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray beam stop</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines

모성으로 품어진 내생 생물로서 Wolbachia는 곤충 개체군의 많은 부분을 감염시킵니다. 최근 연구에 따르면 울바키아 형질감염된 모기를 이용한 RNA 바이러스 전염의 성공적인 조절이 보고되었다. 바이러스를 조절하기 위한 주요 전략은 세포질 비양립성을 통한 숙주 재생의 조작과 숙주 유래 자원에 대한 면역 프라이밍 및 경쟁을 통한 바이러스 전사체의 억제를 포함한다. 그러나 바이러스 감염에 대한 Wolbachia-transfected 모기의 반응의 근본적인 메커니즘은 잘 이해되지 않았습니다. 이 논문은 울바키아와 그의 곤충 벡터 사이의 상호작용에 대한 이해를 향상시키기 위해 Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 세포에서 핵산 및 단백질 수준에서 울바키아 감염의 시험관내 확인을 위한 프로토콜을 제시 한다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 정량적 PCR, 웨스턴 블롯 및 면역학적 분석 방법의 조합된 사용을 통해, 단일 방법의 사용보다 더 정확한 울바치아 감염 세포의 검출을 위한 표준 형태학적 프로토콜이 기술되었다. 이 접근법은 또한 다른 곤충 탁사에서 울바키아 감염의 검출에 적용될 수 있다.

울바키아가 검출되기 전에, Aa23 및 Aa23-T 세포를 광학 현미경으로 관찰하여 두 세포주 사이의 형태학적 차이를 확인하였다. Aa23 및 Aa23-T 세포는 적어도 두 개의 세포 형태를 갖지만 두 세포 유형 사이에 명백한 형태학적 차이는 없다(도 1). 여기서, Aa23 세포는 네 가지 방법을 사용하여 울바키아 감염을 검출하기 위한 모델 시스템으로 사용되었다. 진?...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

네 가지 방법이 세포 내 Wolbachia를 검출하기 위해 사용되었는데, 이는 서로를 보완하고 항생제를 사용하여 네이티브 울바키아 감염의 Aa23 및 Aa23-T가 완치된 Aedes albopictus 유래 Aa23 및 Aa23-T의 Wolbachia 감염의 검출 정확도를 향상시켰다.

Aedes albopictus 세포주에서 Wolbachia 균주 wAlbB 검출

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

이 프로토콜은 세포에 Wolbachia의 존재를 확인하는 데 도움이되며, 이는 Wolbachia와 그 숙주 간의 상호 작용을 이해하는 기초입니다. 이 프로토콜에서는 세포 내 울바키아 감염을 성공적으로 탐지하기 위해 네 가지 방법이 사용되었으며, 이는 세포의 울바키아 감염의 검출 정확도를 확증하고 개선했습니다. 절차를 시연하는 것은 Qiuqiu Xiao, 현대 병원체 생물학 및 특성의 핵심 실험실에서 대학원이 될 것입니다.염색되지 않은 Aa23 및 Aa23-T 세포를 광 현미경을 사용하여 100x 배율로 관찰함으로써 시작하십시오. 세포를 플라스크 당 70 내지 80% 합류율에 도달하도록 5 내지 7일 동안 배양한다. 피펫을 사용하여, 배양액 1 mL를 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다.세포를 수확하기 위해 5분 동안 100 RCF에서 원심분리한다. 상청액을 제거하고 생성된 세포 펠릿을 영하 20도에서 저장한다. 세포를 플라스크 당 90 내지 100% 합류율에 도달하기 위해 5 내지 7일 동안 배양한다.펠렛을 0.40 mL의 PBS에 재현탁시키고, 이 용액 50 마이크로리터를 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 20 mg/mL 프로테이나제 K 5 마이크로리터를 첨가하고 섭씨 55도에서 한 시간 동안 배양한다. 그런 다음 튜브를 섭씨 99도에서 15분 동안 배양하여 조질 DNA를 얻고 영하 20도에 보관한다.PCR을 수행하기 위해, 20 마이크로리터의 총 반응 혼합물을 제조하고, 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 PCR 조건을 설정한다. 겔 이미저를 사용하여 1% 아가로스 겔에서 DNA를 검출한다. 실시간 PCR 시스템에서 TB Green을 사용하여 정량적 PCR 증폭을 수행하고 각 반응의 결과를 기록한다.20 마이크로리터의 총 반응 부피에서 DNA를 분석하고, 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 정량적 PCR 조건을 설정한다. 확립된 표준 곡선에 따라 세포에서 WSP 및 RPS6 유전자 카피 수를 계산한다. 그런 다음 wsp/RPS6의 복사본 수로 Wolbachia 상대 밀도를 계산합니다.독립적인 샘플 t-검정을 사용하여 데이터를 분석합니다. 세포 펠릿에 200 마이크로리터의 용해 완충액을 첨가하고 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다. 용해물을 섭씨 4도에서 12, 000 RCF에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 흡인한다.제조업체의 지침에 따라 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 상청액의 wsp 농도를 분석하십시오. 15%SDS-PAGE 젤에 동일한 양의 단백질을 로딩합니다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고 실온에서 두 시간 동안 5% 탈지유로 막을 막는다.그런 다음 TBST로 멤브레인을 세 번 씻으십시오. 멤브레인을 섭씨 4도에서 1차 항체를 5% 탈지유로 희석하여 제조한 100마이크로리터의 항-wsp 폴리클로날 항체로 밤새 인큐베이션한다. 일차 항체를 TBST로 세 번 세척한다.100 마이크로리터의 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 이차 항체를 멤브레인에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 진탕기에서 배양한다. 멤브레인을 TBST로 세 번 세척하고 화학 발광 검출 키트에 20 마이크로리터의 용액 A와 20 마이크로리터의 용액 B를 일대일의 비율로 혼합한다. 전체 멤브레인을 발광 용액에 동시에 담그고 다기능 이미징 시스템을 사용하여 신호를 관찰하십시오.레이저 공초점 페트리 접시에서 Aa23 및 Aa23-T 세포를 섭씨 28도에서 5% 대기 이산화탄소 하에서 사흘에서 나흘 동안 배양한다. 세포가 60 내지 70%합류에 도달하면, PBS로 세포를 세 번 세척한다. 세포를 섭씨 4도에서 20분 동안 4%파라포름알데히드 한 mL에 고정시킨다.고정된 세포를 PBST를 이용하여 다섯 분 동안 세척하고 PBS로 세포를 두 번 재세척한다. 페트리 접시를 섭씨 37도에서 한 시간 동안 3%소 혈청 알부민 한 mL에 배양한다. 100 마이크로리터의 마우스 항-wsp 폴리클로날 항체 및 마우스 혈청을 슬라이드에 첨가하고, 이를 섭씨 네 도의 습윤 박스에서 밤새 인큐베이션한다.젖은 상자에서 페트리 접시를 꺼내 실온으로 되돌립니다. PBS로 세 번 세척하고 PBS를 제거하였다. 다음 절차를 빛으로부터 보호하십시오.페트리 접시를 100 마이크로리터의 알렉사 플루오르 488-접합된 염소 항-마우스 항체와 함께 섭씨 37도에서 30분 동안 인큐베이션한다. 샘플 페트리 접시를 PBS에 희석된 DAPI 50 마이크로리터와 함께 섭씨 37도에서 10 마이크로그램/mL로 5분 동안 인큐베이션한 다음, PBS로 3회 세척한다. 공초점 현미경으로 면역 염색을 관찰하십시오.울바키아를 검출하기 전에, Aa23 및 Aa23-T 세포를 두 세포주 사이의 형태학적 차이를 결정하기 위해 광학 현미경으로 관찰하였다. Aa23 및 AA23-T 세포는 적어도 두 개의 세포 형태를 가졌으나 두 세포 유형 간에 명백한 형태학적 차이는 관찰되지 않았다. 진단 프라이머 81F/691R을 사용하여, 울바키아 wsp 유전자의 양성 증폭은 Aa23 세포에서 검출되었지만 Aa23-T 세포에서는 검출되지 않았다.세포주에서 울바키아 밀도를 분석한 결과, Aa23 세포에서는 wsp/rps6 비율이 2.4였지만 Aa23-T 세포에서는 울바키아가 나타나지 않았다. 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석은 Aa23에 대해 강한 wsp 신호를 나타내었지만 Aa23-T에 대한 신호는 검출되지 않았다. 간접 면역 형광 분석은 Aa23 세포에서 wsp 단백질을 검출한 반면, DAPI 염색된 DNA만이 Aa23-T 세포에서 검출되었다.배양 플라스크가 5 내지 7일 동안 5% 대기 이산화탄소 하에서 섭씨 28도에서 배양되도록 보장한다. 이 절차는 샘플 준비 및 단면화에 특별한주의를 기울여야하는 전자 현미경 검사로 이어질 수 있습니다. 이 연구에 사용 된 네 가지 실험 방법은 세포에서 Wolbachia 감염의 검출 정확도를 확인했으며, 이는 다른 유형의 세포 및 조직에도 적용 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

에서 Thymic 림프종 T - 세포 라인의 유도 ATM - / -</sup과 p53의 - / -</sup 마우스

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

연구

면역학 및 감염병학

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

엡스타인 - 바 바이러스 성장 변화 Lymphoblastoid 전지 라인 구축

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

요오드 산 쉬프 염색 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐을 감지

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

히트의 예방에 의한 흰쥐의 반작용을 스트레스<em&gt; 고초균</em&gt; 스트레인

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

세균 포자 발아 동안 코어 텍스 조각 검출

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

B 임파 세포 라인의 설립에 대한 간단한 적혈구 용해 방법

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

NK과 만성 활성 엡 스타인-바 바이러스 감염을 가진 환자에서 T 셀 라인을 설정 하는 효율적이 고 간단한 방법

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

방법 감지 세포 독성 Amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

지카 바이러스를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 벡터 역량 분석

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Aedes aegypti 모기에서 현미경 포리디안 기생충 에드hazardia aedis의 전파

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...