Name: detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

Vi takker Dr. Xin-Ru Wang fra University of Minnesota for innsiktsfulle forslag og veiledning. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Natural Science Foundation of China (nr. 81760374).

1. Materialer og reagenser
<ol><li>Bruk pyrogenfrie løsninger og medier for cellekultur (se Materialfortegnet).</li>
	<li>Bruk ultrarent vann for å forberede alle løsninger.</li>
	<li>Vær forsiktig med å velge foster bovint serum (FBS) for cellekultur, etter en mye sjekkprosess. MERK: Siden FBS-tomter kan endres regelmessig, er det umulig å oppgi relevante katalog- og partinumre i denne protokollen.</li>
	<li>Velg Aa23 cellestammer avledet fra A. albopictus egg, tilsv...

<ol>
	<li>Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+crowding+and+temperature+on+Wolbachia+infection+density+among+life+cycle+stages+of+Aedes+albopictus.">Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus.</a> Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).</li><li>Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+superinfections+and+the+expression+of+cytoplasmic+incompatibility.">Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility.</a> Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).</li><li>Dobson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+distributed+throughout+insect+somatic+and+germ+line+tissues.">Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).</li><li>O'Neill, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+Wolbachia+pipientis+in+an+Aedes+albopictus+cell+line.">In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line.</a> Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).</li><li>Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+Wolbachia+wAlbB+endosymbiont+of+Aedes+albopictus.">Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus.</a> Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).</li><li>Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+and+cytoplasmic+incompatibility+in+mosquitoes.">Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).</li><li>Fallon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+properties+of+an+Aedes+albopictus+mosquito+cell+line+infected+with+Wolbachia+strain+wAlbB.">Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB.</a> In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).</li><li>Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+species+are+infected+with+Wolbachia?-A+statistical+analysis+of+current+data.">How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data.</a> Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).</li><li>Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia:+master+manipulators+of+invertebrate+biology.">Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology.</a> National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).</li><li>Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Wolbachia+infections+in+Southeast+Asian+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae).">Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).</li><li>O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).</li><li>McGraw, E. A., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+insecticides:+new+thinking+on+an+ancient+problem.">Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem.</a> National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).</li><li>Bourtzis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+mosquito-Wolbachia+symbiosis+for+vector+and+disease+control.">Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control.</a> Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).</li><li>Turelli, M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+an+inherited+incompatibility+factor+in+California+Drosophila.">Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila.</a> Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).</li><li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission.">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li><li>Walker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wMel+Wolbachia+strain+blocks+dengue+and+invades+caged+Aedes+aegypti+populations.">The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations.</a> Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).</li><li>Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+virulent+and+inhibit+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+in+Anopheles+gambiae.">Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).</li><li>Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endosymbiotic+bacterium+Wolbachia+induces+resistance+to+dengue+virus+in+Aedes+aegypti.">The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).</li><li>Moreira, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wolbachia+symbiont+in+Aedes+aegypti+limits+infection+with+dengue,+Chikungunya,+and+Plasmodium.">A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium.</a> Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).</li><li>Caragata, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+cholesterol+modulates+pathogen+blocking+by+Wolbachia.">Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).</li><li>Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+uses+a+host+microRNA+to+regulate+transcripts+of+a+methyltransferase,+contributing+to+dengue+virus+inhibition+in+Aedes+aegypti.">Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).</li><li>Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya-Wolbachia+interplay+in+Aedes+albopictus.">Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus.</a> Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).</li><li>Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+induces+density-dependent+inhibition+to+dengue+virus+in+mosquito+cells.">Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).</li><li>Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Culicoides+sonorensis+biting+midge+cell+lines+with+Wolbachia+pipientis.">Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis.</a> Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).</li><li>Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+PCR-based+classification+of+Wolbachia+strains+using+wsp+gene+sequences.">Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.</a> The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).</li><li>Park, M. S., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+PaAtg8+and+roles+of+autophagy+in+adaptation+to+starvation+with+respect+to+the+fat+body+and+midgut+of+the+Americana+cockroach,+Periplaneta+americana.">Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).</li><li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin.">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody.">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li><li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti.">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li><li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence,+Western+blotting,+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever.">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li></ol>

Påvisning av intracellulær Wolbachia-infeksjon er avgjørende for studiet av Wolbachia-vert interaksjoner og bekreftelse av vellykket transfeksjon av celler med nye stammer. I denne protokollen ble fire metoder brukt til å oppdage intracellulær Wolbachia-infeksjon på nukleinsyre- og proteinnivået. Disse fire eksperimentelle metodene bekreftet og forbedret deteksjonsnøyaktigheten til Wolbachia-infeksjon av celler. 
PCR ble brukt til å oppdage tilstede...

Den asiatiske tiger mygg Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), som er en nøkkelvektor av denguevirus (DENV) i Asia og andre deler av verden1, er en naturlig vert for to typer av de intracellulære bakteriene, Wolbachia (wAlbA og wAlbB), som distribueres over hele bakterielinjen og somatisk vev 2,3. Aa23 cellelinjen avledet fra A. albopictus embryoer består av minst to morfologiske celletyper, som begge støtter infeksjon4 og kan kureres av innfødt Wolbachia-infeksjon ved hjelp av antibiotika (Aa23-T). Gitt at Aa23 bare beholder wAlbB, er det en nyttig modell for studiet av verts-endosymbiont interaksjoner 4,5,6.
Wolbachia overføres mors og smitter anslagsvis 65% av insektarter 8,9 og 28% av myggarter10. Det infiserer en rekke vev og danner et intimt symbiotisk forhold til verten, som vanligvis induserer cytoplasmisk inkompatibilitet (CI)11 og populasjonserstatning ved å manipulere vertsreproduksjonssystemet12,13. Disse vertsresponsene har blitt observert i naturlige populasjoner av Drosophila simulans14 og i A. aegypti i et laboratoriebur og feltprøve15. En viktig ikke-produktiv manipulasjon fremkalt av Wolbachia er indusert vertsmotstand mot en rekke patogener, inkludert DENV, Chikungunya virus (CHIKV) og West Nile virus (WNV)16,17, som kan formidles av et forbedret medfødt immunsystem av symbiont18,19, konkurranse mellom Wolbachia og virus for essensielle vertsressurser20, og manipulering av vert virale forsvarsbaner21 .
Denne protokollen er utviklet for å studere disse underliggende mekanismene for Wolbachia-induserte verts antivirale responser. Den bruker fire metoder for påvisning av intracellulær Wolbachia infeksjon av Aa23 celler. Disse metodene gir et sterkt teoretisk grunnlag for studier av intracellulær Wolbachia-infeksjon av andre vertsarter. Den første metoden, PCR-en kraftig teknikk som tillater enzymatisk forsterkning av spesifikke områder av DNA uten å bruke konvensjonelle kloning prosedyrer-ble brukt til å oppdage Wolbachia DNA og bestemme tilstedeværelse / fravær av Wolbachia infeksjon22. Den andre metoden måler Wolbachia DNA-kopitetthet ved hjelp av kvantitativ PCR (qPCR) for pålitelig deteksjon og måling av produkter generert under hver PCR-syklus som er direkte proporsjonal med malmengden før PCR23. Den tredje metoden oppdager tilstedeværelsen av intracellulære Wolbachia-proteiner , ved hjelp av vestlig blot-en av de kraftigste verktøyene for å oppdage spesifikke proteiner i komplekse blandinger ved å kombinere den høye separasjonskraften til elektroforese, spesifisiteten av antistoffer og følsomheten til kromogene enzymatiske reaksjoner. Den endelige metoden er en immunfluorescence analyse (IFA) som kombinerer immunologi, biokjemi og mikroskopi for å oppdage Wolbachia overflateprotein (wsp) gjennom en antigen-antistoffreaksjon for å bekrefte det cellulære opptaket av Wolbachia og bestemme dens cellulære lokalisering.
Dette dokumentet beskriver de fire metodene som er oppført ovenfor for å verifisere eksistensen av Wolbachia i cellene, som kan brukes til å oppdage om den eksogene Wolbachia ble vellykket transfektert og Wolbachia i cellen ble ryddet. Etter å ha bestemt om Wolbachia er til stede i cellene eller ikke, kan en rekke forskjellige analyser utføres, inkludert genomikk, proteomikk eller metabolomikk. Denne protokollen demonstrerer påvisning av Wolbachia gjennom Aa23-celler, men kan også brukes i andre celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SteREO Discovery V8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Pipetman</td>
			<td>F167380</td>
			<td>P10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cerium doped yttrium aluminum garnet</td>
			<td>MSE Supplies</td>
			<td></td>
			<td>Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip holder</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Cargille Laboratories</td>
			<td>16482</td>
			<td>Type A low viscosity 150 cSt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR light source&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LED1085L</td>
			<td>LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outer ring&#160;</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump lasers&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LD785-SE400</td>
			<td>785 nm, 400 mW, &#216;9 mm, E Pin Code, Laser Diode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raspberry Pi</td>
			<td>Raspberry Pi Fundation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td>SM1 retaining ring for &#216;1&#34; lens tubes and mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedless quartz crystal</td>
			<td>University Wafers, Inc.</td>
			<td>U01-W2-L-190514</td>
			<td>25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shim</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray beam stop</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines

Som en maternalt innkaiende endosymbiont infiserer Wolbachia store mengder insektpopulasjoner. Studier har nylig rapportert vellykket regulering av RNA virusoverføring ved hjelp av Wolbachia-transfekterte mygg. Viktige strategier for å kontrollere virus inkluderer manipulering av vertsreproduksjon via cytoplasmisk inkompatibilitet og hemming av virale transkripsjoner via immunpriming og konkurranse om vertsavledede ressurser. Imidlertid er de underliggende mekanismene for svarene til Wolbachia-transfekterte mygg til virusinfeksjon dårlig forstått. Dette dokumentet presenterer en protokoll for in vitro-identifisering av Wolbachia-infeksjon på nukleinsyre- og proteinnivåene i Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-celler for å forbedre forståelsen av interaksjonene mellom Wolbachia og dens insektvektorer. Gjennom kombinert bruk av polymerasekjedereaksjon (PCR), kvantitativ PCR, vestlig blot og immunologiske analytiske metoder er det beskrevet en standard morfologiske protokoll for påvisning av Wolbachia-infiserte celler som er mer nøyaktige enn bruk av en enkelt metode. Denne tilnærmingen kan også brukes på påvisning av Wolbachia-infeksjon i andre insekt taxa.

Før Wolbachia ble oppdaget, ble Aa23- og Aa23-T-celler observert under et lysmikroskop for å bestemme eventuelle morfologiske forskjeller mellom de to cellelinjene. Aa23- og Aa23-T-celler har minst to cellemorfologier, men ingen åpenbar morfologisk forskjell mellom de to celletypene (figur 1). Her ble Aa23-celler brukt som et modellsystem for å oppdage Wolbachia-infeksjon ved hjelp av fire metoder. Positiv forsterkning av Wolbachiawsp-genet ved...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Fire metoder ble brukt til å oppdage intracellulær Wolbachia, som komplementerte hverandre og forbedret deteksjonsnøyaktigheten av Wolbachia-infeksjon av Aedes albopictus-avledede Aa23 og Aa23-T kurert for innfødt Wolbachia-infeksjon ved hjelp av antibiotika.

Oppdage Wolbachia Strain wAlbB i Aedes albopictus Cell Lines

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Denne protokollen bidrar til å verifisere eksistensen av Wolbachia i celler, som er grunnlaget for å forstå samspillet mellom Wolbachia og verten. I denne protokollen ble fire metoder brukt til å oppdage intracellulær Wolbachia-infeksjon, som bekreftet og forbedret deteksjonsnøyaktigheten til Wolbachia-infeksjon av celler. Å demonstrere prosedyren vil være Qiuqiu Xiao, et postgraduate fra nøkkellaboratoriet for moderne patogenbiologi og egenskaper.Begynn med å observere unstained Aa23 og Aa23-T celler ved 100x forstørrelse ved hjelp av lysmikroskopi. Kultur cellene i fem til syv dager for å nå 70 til 80% samløp per kolbe. Bruk en pipette, overfør 1 ml av kulturmediet til et mikrosenterrør.Sentrifuge ved 100 RCF i fem minutter for å høste cellene. Fjern supernatanten og lagre den resulterende cellepelleten ved minus 20 grader Celsius. Kultur cellene i fem til syv dager for å nå 90 til 100% samløp per kolbe.Resuspend pellets i 0,40 ml PBS og overfør 50 mikroliter av denne løsningen til et mikrocentrifugerør. Tilsett fem mikroliter med 20 mg/ml proteinase K og inkuber ved 55 grader Celsius i en time. Inkuber deretter rørene ved 99 grader Celsius i 15 minutter for å få det rå DNA-et og lagre det på minus 20 grader Celsius.For å utføre PCR, lag en total reaksjonsblanding på 20 mikroliter og sett PCR-forholdene som beskrevet i tekstmanuskriptet. Oppdag DNA på en 1% agarose gel ved hjelp av en gel imager. Utfør kvantitativ PCR-forsterkning ved hjelp av TB Green i et PCR-system i sanntid og registrer resultatene av hver reaksjon.Analyser DNA-et i et totalt reaksjonsvolum på 20 mikroliter og angi de kvantitative PCR-forholdene som beskrevet i tekstmanuskriptet. Beregn WSP- og RPS6-genkopieringsnumrene i cellene i henhold til den etablerte standardkurven. Beregn deretter Wolbachia relativ tetthet etter kopinummeret til wsp / RPS6.Analyser dataene ved hjelp av en uavhengig t-test. Tilsett 200 mikroliter lysisbuffer til cellepellet og inkuber på is i 30 minutter. Sentrifuger lystene ved 12.000 RCF i 10 minutter ved fire grader Celsius og aspirer supernatanten.Analyser wsp-konsentrasjonen av supernatanten ved hjelp av et BCA proteinanalysesett, i henhold til produsentens instruksjoner. Last like mengder protein på en 15%SDS-PAGE gel. Overfør proteinet til nitrocellulosemembraner og blokker membranene med 5% skummet melk i to timer ved romtemperatur.Vask deretter membranene tre ganger med TBST. Inkuber membranene over natten ved 4 grader Celsius med 100 mikroliter anti-wsp polyklonalt antistoff tilberedt ved å fortynne det primære antistoffet med 5% skummet melk. Vask det primære antistoffet tre ganger med TBST.Tilsett 100 mikroliter pepperrotperoksidasekonjugert sekundært antistoff til membranene og inkuber det på en shaker i en time ved romtemperatur. Vask membranene tre ganger med TBST og bland 20 mikroliter av løsning A og 20 mikroliter oppløsning B i chemiluminescence detection kit med et forhold mellom en og en. Senk hele membranen ned i luminescensløsningen samtidig og følg signalene ved hjelp av et multifunksjonelt bildebehandlingssystem.På en Laser confocal Petri parabolen, inkubere Aa23 og Aa23-T celler i tre til fire dager ved 28 grader Celsius under 5% atmosfærisk karbondioksid. Når cellen når 60 til 70% samløp, vask cellene tre ganger med PBS. Fest cellene i en ml 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved fire grader Celsius.Vask de faste cellene ved hjelp av PBST i fem minutter og skyll cellene to ganger med PBS. Inkuber Petri-retten i en ml 3%bovint serumalbum i en time ved 37 grader Celsius. Tilsett 100 mikroliter mus anti-wsp polyklonalt antistoff og museserum til lysbildene og inkuber det over natten i en våt boks ved fire grader Celsius.Fjern Petri-parabolen fra den våte boksen og returner dem til romtemperatur. Vask dem tre ganger med PBS og fjern PBS. Beskytt følgende prosedyrer mot lys.Inkuber Petri-retten med 100 mikrolitere av et Alexa Fluor 488-konjugert geit antistoff mot mus ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Inkuber prøven Petri parabolen med 50 mikroliter DAPI fortynnet i PBS til 10 mikrogram / ml ved 37 grader Celsius i fem minutter og vask dem deretter tre ganger med PBS. Vær oppmerksom på immuniseringen under et konfokalt mikroskop.Før Wolbachia ble det observert Aa23- og Aa23-T-celler under et lysmikroskop for å bestemme morfologiske forskjeller mellom de to cellelinjene. Aa23- og AA23-T-cellene hadde minst to cellemorfologier, men det ble ikke observert tilsynelatende morfologiske forskjeller mellom de to celletypene. Ved hjelp av de diagnostiske primerne 81F/691R ble det påvist positiv forsterkning av Wolbachia wsp-genet i Aa23-celler, men ikke i Aa23-T-celler.Analysen av Wolbachia tetthet i cellelinjene viste et wsp / rps6-forhold på 2,4 i Aa23-celler, men ingen Wolbachia i Aa23-T-celler. Vestlig flekkanalyse av proteinekstrakter viste et sterkt wsp-signal for Aa23, men det ble ikke påvist noe signal for Aa23-T. Den indirekte immunfluorescensanalysen oppdaget wsp-proteinet i Aa23-celler, mens bare DAPI-farget DNA ble påvist i Aa23-T-celler.Sørg for at kulturflaskene inkuberes ved 28 grader Celsius under 5% atmosfærisk karbondioksid i fem til syv dager. Denne prosedyren kan etterfølges av elektronmikroskopi der man må være spesielt oppmerksom på prøvepreparering og seksjonering. De fire eksperimentelle metodene som brukes i denne studien bekreftet deteksjonsnøyaktigheten av Wolbachia-infeksjon i celler, som også gjelder for andre typer celler og vev.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Etablering av Epstein-Barr Virus Vekst-forvandlet lymfoblastoid Cell Lines

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Oppdager Glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodisk Acid Schiff Farging

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Forebygging av varmestress bivirkninger hos rotter etter<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Strain

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Oppdager Cortex Fragmenter Under Bakteriell Spore Spiring

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

En enkel røde blodceller Lysis Metode for opprettelse av B lymfoblastoide cellelinjer

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

En effektiv og enkel metode for å etablere NK og T cellelinjer fra pasienter med kronisk aktiv Epstein - Barr virusinfeksjon

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Metoder for å oppdage cytotoksisk Amyloids følgende infeksjon av lunge endotelceller av Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Kompetanse Analyser på Aedes aegypti Mygg ved hjelp av Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Forplantning av mikrosporidisk parasitt Edhazardia aedis i Aedes aegypti Mygg

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...