Name: detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

Agradecemos ao Dr. Xin-Ru Wang, da Universidade de Minnesota, por sugestões e orientações perspicazes. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (nº 81760374).

1. Materiais e reagentes
<ol><li>Use soluções e mídias sem pirógenos para cultura celular (veja a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Use água ultrauso para preparar todas as soluções.</li>
	<li>Tenha cuidado ao selecionar o soro bovino fetal (FBS) para a cultura celular, seguindo um processo de verificação de lotes. NOTA: Como os lotes da FBS estão sujeitos a alterações regulares, é impossível declarar os números relevantes do catálogo e dos lotes neste protocolo.</li>
...

<ol>
	<li>Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+crowding+and+temperature+on+Wolbachia+infection+density+among+life+cycle+stages+of+Aedes+albopictus.">Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus.</a> Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).</li><li>Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+superinfections+and+the+expression+of+cytoplasmic+incompatibility.">Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility.</a> Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).</li><li>Dobson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+distributed+throughout+insect+somatic+and+germ+line+tissues.">Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).</li><li>O'Neill, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+Wolbachia+pipientis+in+an+Aedes+albopictus+cell+line.">In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line.</a> Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).</li><li>Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+Wolbachia+wAlbB+endosymbiont+of+Aedes+albopictus.">Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus.</a> Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).</li><li>Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+and+cytoplasmic+incompatibility+in+mosquitoes.">Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).</li><li>Fallon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+properties+of+an+Aedes+albopictus+mosquito+cell+line+infected+with+Wolbachia+strain+wAlbB.">Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB.</a> In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).</li><li>Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+species+are+infected+with+Wolbachia?-A+statistical+analysis+of+current+data.">How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data.</a> Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).</li><li>Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia:+master+manipulators+of+invertebrate+biology.">Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology.</a> National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).</li><li>Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Wolbachia+infections+in+Southeast+Asian+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae).">Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).</li><li>O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).</li><li>McGraw, E. A., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+insecticides:+new+thinking+on+an+ancient+problem.">Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem.</a> National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).</li><li>Bourtzis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+mosquito-Wolbachia+symbiosis+for+vector+and+disease+control.">Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control.</a> Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).</li><li>Turelli, M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+an+inherited+incompatibility+factor+in+California+Drosophila.">Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila.</a> Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).</li><li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission.">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li><li>Walker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wMel+Wolbachia+strain+blocks+dengue+and+invades+caged+Aedes+aegypti+populations.">The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations.</a> Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).</li><li>Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+virulent+and+inhibit+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+in+Anopheles+gambiae.">Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).</li><li>Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endosymbiotic+bacterium+Wolbachia+induces+resistance+to+dengue+virus+in+Aedes+aegypti.">The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).</li><li>Moreira, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wolbachia+symbiont+in+Aedes+aegypti+limits+infection+with+dengue,+Chikungunya,+and+Plasmodium.">A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium.</a> Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).</li><li>Caragata, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+cholesterol+modulates+pathogen+blocking+by+Wolbachia.">Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).</li><li>Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+uses+a+host+microRNA+to+regulate+transcripts+of+a+methyltransferase,+contributing+to+dengue+virus+inhibition+in+Aedes+aegypti.">Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).</li><li>Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya-Wolbachia+interplay+in+Aedes+albopictus.">Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus.</a> Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).</li><li>Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+induces+density-dependent+inhibition+to+dengue+virus+in+mosquito+cells.">Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).</li><li>Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Culicoides+sonorensis+biting+midge+cell+lines+with+Wolbachia+pipientis.">Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis.</a> Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).</li><li>Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+PCR-based+classification+of+Wolbachia+strains+using+wsp+gene+sequences.">Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.</a> The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).</li><li>Park, M. S., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+PaAtg8+and+roles+of+autophagy+in+adaptation+to+starvation+with+respect+to+the+fat+body+and+midgut+of+the+Americana+cockroach,+Periplaneta+americana.">Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).</li><li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin.">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody.">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li><li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti.">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li><li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence,+Western+blotting,+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever.">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li></ol>

A detecção da infecção por Wolbachia intracelular é essencial para o estudo das interações wolbachia-hospedeira e a confirmação da transfecção bem sucedida de células com novas cepas. Neste protocolo, quatro métodos foram utilizados para detectar com sucesso a infecção por Wolbachia intracelular nos níveis nucleicos de ácido e proteína. Estes quatro métodos experimentais corroboraram e melhoraram a precisão de detecção da infecção por Wolbachia das células. </p...

O mosquito tigre asiático Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), que é um vetor chave do vírus da dengue (DENV) na Ásia e em outras partes do mundo1, é um hospedeiro natural de dois tipos de bactérias intracelulares, Wolbachia (wAlbA e wAlbB), que estão distribuídas por toda a linha germe e tecido somático 2,3. A linha celular Aa23 derivada de embriões A. albopictus consiste em pelo menos dois tipos de células morfológicas, ambos suportam a infecção4 e podem ser curados da infecção nativa da Wolbachia usando antibióticos (Aa23-T). Dado que o Aa23 mantém apenas wAlbB, é um modelo útil para o estudo das interações hospedeira-endossímbionte 4,5,6.
Wolbachia é transmitida maternamente e infecta cerca de 65% das espécies de insetos 8,9 e 28% das espécies demosquitos 10. Infecta uma variedade de tecidos e forma uma relação simbiótica íntima com o hospedeiro, geralmente induzindo incompatibilidade citoplasmática (IC)11 e substituição populacional manipulando o sistema reprodutivohospedeiro 12,13. Essas respostas hospedeiras têm sido observadas em populações naturais de simuladores de Drosophila14 e em A. aegypti em uma gaiola de laboratório e ensaio de campo15. Uma importante manipulação não reproducente provocada pela Wolbachia é induzida resistência hospedeira a uma variedade de patógenos, incluindo DENV, vírus Chikungunya (CHIKV) e vírus do Nilo Ocidental (WNV)16,17, que podem ser mediados por um sistema imunológico inato melhorado do simbionte18,19, competição entre Wolbachia e vírus para recursos essenciais de hospedagem20, e manipulação de vias de defesa viralhospedeira 21 .
Este protocolo foi desenvolvido para estudar esses mecanismos subjacentes das respostas antivirais induzidas pela Wolbachia. Utiliza quatro métodos de detecção da infecção por Wolbachia intracelular de células Aa23. Esses métodos fornecem uma forte base teórica para estudos de infecção por Wolbachia intracelular de outras espécies hospedeiras. O primeiro método, PCR-uma técnica poderosa que permite a amplificação enzimática de regiões específicas do DNA sem utilizar procedimentos convencionais de clonagem - foi usado para detectar DNA wolbachia e determinar a presença/ausência da infecção wolbachia 22. O segundo método mede a densidade de cópia de DNA de Wolbachia usando PCR quantitativo (qPCR) para detecção e medição confiável de produtos gerados durante cada ciclo pcr que é diretamente proporcional à quantidade de modelo antes do PCR23. O terceiro método detecta a presença de proteínas wolbachia intracelulares, utilizando uma das ferramentas mais poderosas para detectar proteínas específicas em misturas complexas, combinando o alto poder de separação da eletroforese, a especificidade dos anticorpos e a sensibilidade das reações enzimáticas cromogênicas. O método final é um ensaio de imunofluorescência (IFA) que combina imunologia, bioquímica e microscopia para detectar a proteína da superfície de Wolbachia (wsp) através de uma reação de anticorpos de antígeno para confirmar a absorção celular de Wolbachia e determinar sua localização celular.
Este artigo descreve os quatro métodos listados acima para verificar a existência de Wolbachia nas células, que podem ser usados para detectar se a exógena Wolbachia foi transfeinada com sucesso e a Wolbachia na célula foi limpa. Depois de determinar se wolbachia está presente nas células ou não, uma variedade de diferentes análises podem ser realizadas, incluindo genômica, proteômica ou metabolômica. Este protocolo demonstra a detecção de Wolbachia através de células Aa23, mas também pode ser usado em outras células.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SteREO Discovery V8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Pipetman</td>
			<td>F167380</td>
			<td>P10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cerium doped yttrium aluminum garnet</td>
			<td>MSE Supplies</td>
			<td></td>
			<td>Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip holder</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Cargille Laboratories</td>
			<td>16482</td>
			<td>Type A low viscosity 150 cSt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR light source&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LED1085L</td>
			<td>LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outer ring&#160;</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump lasers&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LD785-SE400</td>
			<td>785 nm, 400 mW, &#216;9 mm, E Pin Code, Laser Diode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raspberry Pi</td>
			<td>Raspberry Pi Fundation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td>SM1 retaining ring for &#216;1&#34; lens tubes and mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedless quartz crystal</td>
			<td>University Wafers, Inc.</td>
			<td>U01-W2-L-190514</td>
			<td>25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shim</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray beam stop</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines

Como um endossímbionte abrigado maternamente, Wolbachia infecta grandes proporções de populações de insetos. Estudos relataram recentemente a regulamentação bem sucedida da transmissão do vírus RNA usando mosquitos transfectados por Wolbachia. As principais estratégias para controlar vírus incluem a manipulação da reprodução do hospedeiro por incompatibilidade citoplasmática e a inibição de transcrições virais por meio de priming imunológico e competição por recursos derivados do hospedeiro. No entanto, os mecanismos subjacentes das respostas dos mosquitos transfectados wolbachia à infecção viral são mal compreendidos. Este artigo apresenta um protocolo para a identificação in vitro da infecção por Wolbachia nos níveis nucleicos de ácido e proteína em células Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 para melhorar a compreensão das interações entre Wolbachia e seus vetores de insetos. Através do uso combinado de reação em cadeia de polimerase (PCR), PCR quantitativo, mancha ocidental e métodos analíticos imunológicos, um protocolo morfológico padrão foi descrito para a detecção de células infectadas por Wolbachia que é mais precisa do que o uso de um único método. Essa abordagem também pode ser aplicada à detecção da infecção por Wolbachia em outras taxas de insetos.

Antes da córdia ser detectada, as células Aa23 e Aa23-T foram observadas sob um microscópio leve para determinar quaisquer diferenças morfológicas entre as duas linhas celulares. As células Aa23 e Aa23-T têm pelo menos duas morfologias celulares, mas nenhuma diferença morfológica óbvia entre os dois tipos de células (Figura 1). Aqui, as células Aa23 foram usadas como um sistema modelo para detectar a infecção por Wolbachia usando quatro métod...

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Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Quatro métodos foram usados para detectar wolbachia intracelular, que se complementou e melhorou a precisão de detecção da infecção wolbachia da Aa23 e Aa23-T derivadas de Aa23 e Aa23-T curadas da infecção nativa wolbachia usando antibióticos.

Detectando wolbachia strain wAlbb em linhas celulares Aedes albopictus

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Este protocolo ajuda a verificar a existência de Wolbachia nas células, que é a base da compreensão da interação entre Wolbachia e seu hospedeiro. Neste protocolo, quatro métodos foram utilizados para detectar com sucesso a infecção por Wolbachia intracelular, o que corroborou e melhorou a precisão de detecção da infecção por Wolbachia das células. Demonstrando o procedimento estará Qiuqiu Xiao, pós-graduado do Laboratório Chave de Biologia e Características de Patógenos Modernos.Comece observando células Aa23 e Aa23-T não manchadas a 100x de ampliação usando microscopia leve. Cultura as células por cinco a sete dias para atingir 70 a 80% de confluência por frasco. Usando uma pipeta, transfira 1 mL do meio de cultura para um tubo de microcentrífuga.Centrífuga a 100 RCF por cinco minutos para colher as células. Remova o sobrenante e armazene a pelota celular resultante a menos 20 graus Celsius. Cultura as células por cinco a sete dias para atingir 90 a 100% de confluência por frasco.Resuspenja as pelotas em 0,40 mL de PBS e transfira 50 microliters desta solução para um tubo de microcentrífuga. Adicione cinco microliters de 20 mg/mL proteinase K e incubar a 55 graus Celsius por uma hora. Em seguida, incubar os tubos a 99 graus Celsius por 15 minutos para obter o DNA bruto e armazená-lo a menos 20 graus Celsius.Para realizar o PCR, prepare uma mistura de reação total de 20 microliters e defina as condições de PCR conforme descrito no manuscrito do texto. Detecte o DNA em um gel de 1%agarose usando um imager de gel. Realize a amplificação quantitativa do PCR usando TB Green em um sistema PCR em tempo real e regise os resultados de cada reação.Analise o DNA em um volume total de reação de 20 microliters e defina as condições quantitativas de PCR conforme descrito no manuscrito do texto. Calcule os números de cópia genética WSP e RPS6 nas células de acordo com a curva padrão estabelecida. Em seguida, calcule a densidade relativa de Wolbachia pelo número de cópia do wsp/RPS6.Analise os dados usando um teste de amostras independentes. Adicione 200 microliters de tampão de lise à pelota celular e incubar no gelo por 30 minutos. Centrifugar os lysates a 12.000 RCF por 10 minutos a quatro graus Celsius e aspirar o supernante.Analise a concentração de wsp do supernante utilizando um kit de ensaio de proteína BCA, seguindo as instruções do fabricante. Carregar quantidades iguais de proteína em um gel de 15% SDS-PAGE. Transfira a proteína para membranas nitrocelulose e bloqueie as membranas com leite 5% desnatado por duas horas à temperatura ambiente.Em seguida, lave as membranas três vezes com TBST. Incubar as membranas durante a noite a 4 graus Celsius com 100 microlitres de anticorpo policlonal anti-wsp preparado pela diluição do anticorpo primário com leite 5% desnatado. Lave o anticorpo primário três vezes com TBST.Adicione 100 microliters de anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rabanete às membranas e incuba-o em um agitador por uma hora à temperatura ambiente. Lave as membranas três vezes com TBST e misture 20 microliters de solução A e 20 microliters de solução B no kit de detecção de quemiluminescência em uma proporção de um para um. Mergulhe toda a membrana na solução de luminescência simultaneamente e observe os sinais usando um sistema de imagem multifuncional.Em uma placa de Petri confocal laser, incubar células Aa23 e Aa23-T por três a quatro dias a 28 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono atmosférico. Quando a célula atingir 60 a 70% de confluência, lave as células três vezes com PBS. Fixar as células em um mL de 4% de paraformaldeído por 20 minutos a quatro graus Celsius.Lave as células fixas usando PBST por cinco minutos e reclave as células duas vezes com PBS. Incubar a placa de Petri em um mL de 3% de albumina de soro bovino por uma hora a 37 graus Celsius. Adicione 100 microliters de anticorpo policlonal anti-wsp do rato e soro do rato aos slides e incuba-o durante a noite em uma caixa molhada a quatro graus Celsius.Retire a placa de Petri da caixa molhada e devolva-as à temperatura ambiente. Lave-os três vezes com PBS e remova o PBS. Proteja os seguintes procedimentos da luz.Incubar a placa de Petri com 100 microliters de um anticorpo anti-rato de cabra Alexa Fluor 488 conjugado a 37 graus Celsius por 30 minutos. Incubar a placa de Petri com 50 microliters de DAPI diluídos em PBS a 10 microgramas/mL a 37 graus Celsius por cinco minutos e depois lavá-los três vezes com PBS. Observe a imunostaining sob um microscópio confocal.Antes de detectar as células Wolbachia, Aa23 e Aa23-T foram observadas sob um microscópio leve para determinar diferenças morfológicas entre as duas linhas celulares. As células Aa23 e AA23-T tinham pelo menos duas morfologias celulares, mas não foram observadas diferenças morfológicas aparentes entre os dois tipos de células. Utilizando os primers diagnósticos 81F/691R, a amplificação positiva do gene Wolbachia wsp foi detectada em células Aa23, mas não em células Aa23-T.A análise da densidade de Wolbachia nas linhas celulares mostrou uma razão wsp/rps6 de 2,4 em células Aa23, mas nenhuma Wolbachia em células Aa23-T. A análise ocidental de extratos de proteína mostrou um forte sinal wsp para Aa23, mas nenhum sinal foi detectado para Aa23-T. O ensaio indireto de imunofluorescência detectou a proteína wsp em células Aa23, enquanto apenas o DNA manchado de DAPI foi detectado em células Aa23-T.Certifique-se de que os frascos de cultura sejam incubados a 28 graus Celsius sob dióxido de carbono atmosférico de 5% por cinco a sete dias. Este procedimento pode ser seguido por microscopia eletrônica onde é preciso prestar especial atenção à preparação e seção da amostra. Os quatro métodos experimentais utilizados neste estudo confirmaram a precisão de detecção da infecção por Wolbachia nas células, o que também é aplicável a outros tipos de células e tecidos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivação de Tímico linfoma de células T Linhas de Atm - / -</sup E<emP53> - / -</sup Ratos

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Imunologia e Infecção

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Estabelecimento de Epstein-Barr Virus Crescimento transformada linhagens de células linfoblastóides

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Detecção de glicogênio no sangue periférico células mononucleares com Periodic Acid Schiff Coloração

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Prevenção de estresse térmico efeitos adversos em ratos pela<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Strain

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Detecção de Cortex Fragmentos Durante bacteriana germinação de esporos

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

Um glóbulo vermelho simples método de lise para o estabelecimento de linhas celulares linfoblastóides B

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Um método simples e eficiente para estabelecer linhas de células T de pacientes com infecção crônica ativa vírus Epstein - Barr e NK

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Métodos para detecção de citotóxicos amiloides seguir infecção de pulmonar células endoteliais por Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Análises de competência vetorial sobre mosquitos Aedes aegypti que usam zika vírus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Propagação do Parasita Microsporidiano Edhazardia aedis em Mosquitos Aedes aegypti

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...