Name: detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

Мы благодарим д-ра Синь-Ру Вана из Университета Миннесоты за проницательные предложения и рекомендации. Эта работа была поддержана грантом Национального фонда естественных наук Китая (No 81760374).

1. Материалы и реагенты
<ol><li>Используйте безпирогеновые растворы и среды для клеточной культуры (см. Таблицу материалов).</li>
	<li>Используйте сверхчистую воду для приготовления всех растворов.</li>
	<li>Будьте осторожны при выборе фетальной бычьей сыворотки (FBS) для клеточн?...

<ol>
	<li>Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+crowding+and+temperature+on+Wolbachia+infection+density+among+life+cycle+stages+of+Aedes+albopictus.">Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus.</a> Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).</li><li>Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+superinfections+and+the+expression+of+cytoplasmic+incompatibility.">Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility.</a> Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).</li><li>Dobson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+distributed+throughout+insect+somatic+and+germ+line+tissues.">Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).</li><li>O'Neill, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+Wolbachia+pipientis+in+an+Aedes+albopictus+cell+line.">In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line.</a> Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).</li><li>Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+Wolbachia+wAlbB+endosymbiont+of+Aedes+albopictus.">Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus.</a> Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).</li><li>Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+and+cytoplasmic+incompatibility+in+mosquitoes.">Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).</li><li>Fallon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+properties+of+an+Aedes+albopictus+mosquito+cell+line+infected+with+Wolbachia+strain+wAlbB.">Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB.</a> In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).</li><li>Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+species+are+infected+with+Wolbachia?-A+statistical+analysis+of+current+data.">How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data.</a> Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).</li><li>Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia:+master+manipulators+of+invertebrate+biology.">Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology.</a> National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).</li><li>Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Wolbachia+infections+in+Southeast+Asian+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae).">Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).</li><li>O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).</li><li>McGraw, E. A., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+insecticides:+new+thinking+on+an+ancient+problem.">Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem.</a> National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).</li><li>Bourtzis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+mosquito-Wolbachia+symbiosis+for+vector+and+disease+control.">Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control.</a> Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).</li><li>Turelli, M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+an+inherited+incompatibility+factor+in+California+Drosophila.">Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila.</a> Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).</li><li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission.">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li><li>Walker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wMel+Wolbachia+strain+blocks+dengue+and+invades+caged+Aedes+aegypti+populations.">The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations.</a> Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).</li><li>Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+virulent+and+inhibit+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+in+Anopheles+gambiae.">Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).</li><li>Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endosymbiotic+bacterium+Wolbachia+induces+resistance+to+dengue+virus+in+Aedes+aegypti.">The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).</li><li>Moreira, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wolbachia+symbiont+in+Aedes+aegypti+limits+infection+with+dengue,+Chikungunya,+and+Plasmodium.">A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium.</a> Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).</li><li>Caragata, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+cholesterol+modulates+pathogen+blocking+by+Wolbachia.">Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).</li><li>Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+uses+a+host+microRNA+to+regulate+transcripts+of+a+methyltransferase,+contributing+to+dengue+virus+inhibition+in+Aedes+aegypti.">Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).</li><li>Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya-Wolbachia+interplay+in+Aedes+albopictus.">Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus.</a> Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).</li><li>Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+induces+density-dependent+inhibition+to+dengue+virus+in+mosquito+cells.">Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).</li><li>Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Culicoides+sonorensis+biting+midge+cell+lines+with+Wolbachia+pipientis.">Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis.</a> Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).</li><li>Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+PCR-based+classification+of+Wolbachia+strains+using+wsp+gene+sequences.">Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.</a> The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).</li><li>Park, M. S., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+PaAtg8+and+roles+of+autophagy+in+adaptation+to+starvation+with+respect+to+the+fat+body+and+midgut+of+the+Americana+cockroach,+Periplaneta+americana.">Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).</li><li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin.">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody.">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li><li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti.">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li><li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence,+Western+blotting,+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever.">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li></ol>

Обнаружение внутриклеточной инфекции Wolbachia имеет важное значение для изучения взаимодействий Wolbachia-host и подтверждения успешной трансфекции клеток с новыми штаммами. В этом протоколе были использованы четыре метода для успешного выявления внутриклеточной инфекции Wolbachia</em...

Азиатский тигровый комар Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), который является ключевым переносчиком вируса денге (DENV) в Азии и других частях мира1, является естественным хозяином двух типов внутриклеточных бактерий, Wolbachia (wAlbA и wAlbB), которые распределены по всей зародышевой линии и соматической ткани 2,3. Клеточная линия Aa23, полученная из эмбрионов A. albopictus, состоит, по меньшей мере, из двух морфологических типов клеток, оба из которых поддерживают инфекцию4 и могут быть излечены от нативной инфекции Wolbachia с использованием антибиотиков (Aa23-T). Учитывая, что Aa23 сохраняет только wAlbB, это полезная модель для изучения взаимодействий хозяин-эндосимбионт 4,5,6.
Wolbachia передается через мать и заражает, по оценкам, 65% видов насекомых 8,9 и 28% видов комаров10. Он инфицирует различные ткани и формирует интимные симбиотические отношения с хозяином, обычно вызывая цитоплазматическую несовместимость (CI)11 и популяционную замену путем манипулирования репродуктивной системой хозяина12,13. Эти ответы хозяина наблюдались в естественных популяциях Drosophila simulans14 и у A. aegypti в лабораторной клетке и полевых испытаниях15. Важной нерепродуктивной манипуляцией, вызванной Вольбахией, является индуцированная устойчивость хозяина к различным патогенам, включая DENV, вирус чикунгуньи (CHIKV) и вирус Западного Нила (ВЗН)16,17, которые могут быть опосредованы улучшенной врожденной иммунной системой симбионта18,19, конкуренцией между Wolbachia и вирусами за основные ресурсы хозяина20 и манипулированием путями вирусной защиты хозяина21 .
Этот протокол был разработан для изучения этих основных механизмов противовирусных реакций хозяина, вызванных Вольбахией. В нем используются четыре метода выявления внутриклеточной вольбахской инфекции клеток Aa23. Эти методы обеспечивают прочную теоретическую основу для исследований внутриклеточной инфекции Wolbachia других видов хозяев. Первый метод, ПЦР - мощный метод, позволяющий ферментативную амплификацию определенных областей ДНК без использования обычных процедур клонирования - был использован для обнаружения ДНК Wolbachia и определения наличия /отсутствия инфекции Wolbachia 22. Второй метод измеряет плотность копий ДНК Wolbachia с использованием количественной ПЦР (qPCR) для надежного обнаружения и измерения продуктов, генерируемых во время каждого цикла ПЦР, что прямо пропорционально количеству шаблона до ПЦР23. Третий метод обнаруживает наличие внутриклеточных белков Wolbachia , используя западный блот — один из самых мощных инструментов для обнаружения специфических белков в сложных смесях путем сочетания высокой силы разделения электрофореза, специфичности антител и чувствительности хромогенных ферментативных реакций. Окончательным методом является иммунофлуоресцентный анализ (IFA), который сочетает иммунологию, биохимию и микроскопию для обнаружения поверхностного белка Wolbachia (wsp) через реакцию антиген-антитело для подтверждения клеточного поглощения Wolbachia и определения его клеточной локализации.
В этой статье описываются четыре метода, перечисленные выше для проверки существования Wolbachia в клетках, которые могут быть использованы для определения того, была ли экзогенная Wolbachia успешно трансфектирована и Wolbachia в клетке была очищена. После определения того, присутствует ли Вольбахия в клетках или нет, может быть выполнено множество различных анализов, включая геномику, протеомику или метаболомику. Этот протокол демонстрирует обнаружение Wolbachia через клетки Aa23, но также может быть использован в других клетках.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SteREO Discovery V8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Pipetman</td>
			<td>F167380</td>
			<td>P10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cerium doped yttrium aluminum garnet</td>
			<td>MSE Supplies</td>
			<td></td>
			<td>Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip holder</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Cargille Laboratories</td>
			<td>16482</td>
			<td>Type A low viscosity 150 cSt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR light source&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LED1085L</td>
			<td>LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outer ring&#160;</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump lasers&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LD785-SE400</td>
			<td>785 nm, 400 mW, &#216;9 mm, E Pin Code, Laser Diode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raspberry Pi</td>
			<td>Raspberry Pi Fundation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td>SM1 retaining ring for &#216;1&#34; lens tubes and mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedless quartz crystal</td>
			<td>University Wafers, Inc.</td>
			<td>U01-W2-L-190514</td>
			<td>25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shim</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray beam stop</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines

Как материнский эндосимбионт, Wolbachia заражает большую часть популяций насекомых. Недавно в исследованиях сообщалось об успешной регуляции передачи РНК-вируса с использованием комаров, транс инфицированных Wolbachia. Ключевые стратегии борьбы с вирусами включают манипулирование размножением хозяина через цитоплазматическую несовместимость и ингибирование вирусных транскриптов посредством иммунного прайминга и конкуренции за ресурсы, полученные от хозяина. Однако основные механизмы реакций комаров, транс инфицированных Вольбахией, на вирусную инфекцию плохо изучены. В этой статье представлен протокол идентификации in vitro инфекции Wolbachia на уровнях нуклеиновых кислот и белка в клетках Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 для улучшения понимания взаимодействий между Wolbachia и ее насекомыми-переносчиками. Благодаря комбинированному использованию полимеразной цепной реакции (ПЦР), количественной ПЦР, западного блоттинга и иммунологических аналитических методов был описан стандартный морфологический протокол для обнаружения клеток, инфицированных Вольбахией, который является более точным, чем использование одного метода. Этот подход также может быть применен к обнаружению инфекции Wolbachia у других таксонов насекомых.

До того, как Wolbachia была обнаружена, клетки Aa23 и Aa23-T наблюдались под световым микроскопом, чтобы определить любые морфологические различия между двумя клеточными линиями. Aa23 и Aa23-Т-клетки имеют, по крайней мере, две морфологии клеток, но нет очевидной морфологической разницы между дв...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Для выявления внутриклеточной вольбахии использовались четыре метода, которые дополняли друг друга и повышали точность обнаружения инфекции Wolbachia Aedes albopictus Aa23 и Aa23-T, вылеченной от нативной инфекции Wolbachia с использованием антибиотиков.

Обнаружение штамма Wolbachia wAlbB в клеточных линиях Aedes albopictus

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Этот протокол помогает проверить существование Wolbachia в клетках, что является основой понимания взаимодействия между Wolbachia и ее хозяином. В этом протоколе были использованы четыре метода для успешного выявления внутриклеточной инфекции Wolbachia, что подтвердило и улучшило точность обнаружения инфекции Wolbachia в клетках. Продемонстрировать процедуру будет Цюцю Сяо, аспирант из Ключевой лаборатории современной биологии и характеристик патогенов.Начните с наблюдения незапятнанных клеток Aa23 и Aa23-T при 100-кратном увеличении с помощью световой микроскопии. Культивируйте клетки в течение пяти-семи дней, чтобы достичь 70-80% слияния на колбу. С помощью пипетки переложить 1 мл питательной среды в микроцентрифужную трубку.Центрифуга при 100 RCF в течение пяти минут для сбора клеток. Удалите супернатант и храните полученную ячейку гранулы при минус 20 градусах Цельсия. Культивируйте клетки в течение пяти-семи дней, чтобы достичь 90-100% слияния на колбу.Повторно суспендируют гранулы в 0,40 мл PBS и переложат 50 микролитров этого раствора в микроцентрифужную трубку. Добавьте пять микролитров 20 мг/мл протеиназы К и инкубируйте при 55 градусах Цельсия в течение одного часа. Затем инкубируют трубки при 99 градусах Цельсия в течение 15 минут, чтобы получить сырую ДНК и хранить ее при минус 20 градусах Цельсия.Для выполнения ПЦР готовят общую реакционную смесь из 20 микролитров и устанавливают условия ПЦР, как описано в тексте рукописи. Обнаружение ДНК на 1% агарозном геле с помощью гелевого тепловизора. Выполняйте количественную амплификацию ПЦР с использованием TB Green в системе ПЦР в режиме реального времени и записывайте результаты каждой реакции.Проанализировать ДНК в общем объеме реакции 20 микролитров и установить количественные условия ПЦР, как описано в тексте рукописи. Рассчитайте количество копий генов WSP и RPS6 в клетках в соответствии с установленной стандартной кривой. Затем рассчитайте относительную плотность Wolbachia по числу копий wsp/RPS6.Анализируйте данные с помощью независимых образцов t-теста. Добавьте 200 микролитров лизисного буфера в гранулу клетки и инкубируйте на льду в течение 30 минут. Центрифугируйте лизаты при 12 000 RCF в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и аспирируйте супернатант.Проанализируйте концентрацию супернатанта с помощью набора для анализа белка BCA, следуя инструкциям производителя. Загрузите равное количество белка на 15% гель SDS-PAGE. Переложите белок на нитроцеллюлозные мембраны и блокируйте мембраны 5% обезжиренным молоком в течение двух часов при комнатной температуре.Затем трижды промыть мембраны ТБСТ. Инкубируйте мембраны в течение ночи при 4 градусах Цельсия со 100 микролитрами анти-wsp поликлонального антитела, полученного путем разбавления первичного антитела 5% обезжиренным молоком. Промыть первичное антитело три раза с помощью TBST.Добавьте к мембранам 100 микролитров пероксидазно-конъюгированного вторичного антитела хрена и инкубируйте его на шейкере в течение одного часа при комнатной температуре. Трижды промыть мембраны TBST и смешать 20 микролитров раствора А и 20 микролитров раствора В в комплекте для детектирования хемилюминесценции в соотношении один к одному. Погрузите всю мембрану в люминесцентный раствор одновременно и наблюдайте за сигналами с помощью многофункциональной системы визуализации.На лазерной конфокальной чашке Петри инкубируют ячейки Aa23 и Aa23-T в течение трех-четырех дней при температуре 28 градусов Цельсия под 5% атмосферного углекислого газа. Когда клетка достигнет 60-70% слияния, промыть клетки три раза PBS. Зафиксируйте клетки в одном мл 4%-го параформальдегида в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.Промывайте неподвижные ячейки с помощью PBST в течение пяти минут и дважды промывайте ячейки PBS. Инкубируйте чашку Петри в одном мл 3% бычьего сывороточного альбумина в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. Добавьте 100 микролитров мышиного анти-wsp поликлонального антитела и мышиной сыворотки к слайдам и высиживайте его на ночь во влажной коробке при четырех градусах Цельсия.Выньте чашку Петри из влажного ящика и верните ее к комнатной температуре. Вымойте их три раза с PBS и удалите PBS. Защитите следующие процедуры от света.Инкубируйте чашку Петри со 100 микролитрами конъюгированного козьего антимышьего антитела Alexa Fluor 488 при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут. Инкубируйте образец чашки Петри с 50 микролитрами DAPI, разведенными в PBS до 10 мкг/мл при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут, а затем трижды промывайте их PBS. Наблюдайте за иммуноокрашиванием под конфокальным микроскопом.До обнаружения Wolbachia клетки Aa23 и Aa23-T наблюдались под световым микроскопом для определения морфологических различий между двумя клеточными линиями. Клетки Aa23 и AA23-T имели, по крайней мере, две морфологии клеток, но между двумя типами клеток не наблюдалось никаких явных морфологических различий. С помощью диагностических праймеров 81F/691R положительная амплификация гена Wolbachia wsp была обнаружена в клетках Aa23, но не в Aa23-Т-клетках.Анализ плотности Wolbachia в клеточных линиях показал соотношение wsp/rps6 2,4 в клетках Aa23, но отсутствие Wolbachia в клетках Aa23-T. Вестерн-блоттинговый анализ белковых экстрактов показал сильный сигнал wsp для Aa23, но сигнал не был обнаружен для Aa23-T. Непрямой иммунофлуоресцентный анализ обнаружил белок wsp в клетках Aa23, в то время как только ОКРАШЕННАЯ DAPI ДНК была обнаружена в Aa23-T-клетках.Убедитесь, что колбы для культивирования инкубированы при температуре 28 градусов цельсия ниже 5% атмосферного углекислого газа в течение пяти-семи дней. За этой процедурой может последовать электронная микроскопия, где необходимо уделить особое внимание пробоподготовке и секционированию. Четыре экспериментальных метода, использованных в этом исследовании, подтвердили точность обнаружения инфекции Wolbachia в клетках, что также применимо к другим типам клеток и тканей.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Вывод тимуса лимфомы Т-клеточных линий из Atm - / -</sup И Р53 - / -</sup Мыши

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Создание вирусом Эпштейна-Барра роста трансформированных лимфобластоидных клеточных линий

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Обнаружение гликогена в мононуклеарных клеток периферической крови с йодной кислотой Шиффа окрашивания

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Предотвращение теплового стресса побочные эффекты у крыс<em&gt; Сенная палочка</em&gt; Штамм

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Обнаружение Cortex Фрагменты Во время бактериальный прорастание спор

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

Простой эритроцит Лизис Метод создании B лимфобластоидная клеточных линий

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Эффективной и простой метод для установления линии Т-клеток у больных с хроническим активный вирус Эпштейна - Барр инфекции и НК

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Методы для обнаружения цитотоксических Амилоиды следующие инфекции из легочного эндотелиальных клеток, синегнойной палочки

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Анализ компетентности переносчиков комаров Aedes aegypti с использованием вируса Зика

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Распространение микроспоридского паразита Edhazardia aedis у комаров Aedes aegypti

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...