Name: detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

Vi tackar Dr. Xin-Ru Wang från University of Minnesota för insiktsfulla förslag och vägledning. Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Natural Science Foundation of China (No.81760374).

1. Material och reagenser
<ol><li>Använd pyrogenfria lösningar och media för cellodling (se materialförteckningen).</li>
	<li>Använd ultrarent vatten för att förbereda alla lösningar.</li>
	<li>Var försiktig när du väljer fetalt bovint serum (FBS) för cellodling, efter en lot-check-process. OBS: Eftersom FBS-partier kan ändras regelbundet är det omöjligt att ange relevant katalog och partinummer i detta protokoll.</li>
	<li>Välj Aa23-cellstammar härledda från A...

<ol>
	<li>Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+crowding+and+temperature+on+Wolbachia+infection+density+among+life+cycle+stages+of+Aedes+albopictus.">Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus.</a> Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).</li><li>Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+superinfections+and+the+expression+of+cytoplasmic+incompatibility.">Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility.</a> Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).</li><li>Dobson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+distributed+throughout+insect+somatic+and+germ+line+tissues.">Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).</li><li>O'Neill, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+Wolbachia+pipientis+in+an+Aedes+albopictus+cell+line.">In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line.</a> Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).</li><li>Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+Wolbachia+wAlbB+endosymbiont+of+Aedes+albopictus.">Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus.</a> Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).</li><li>Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+and+cytoplasmic+incompatibility+in+mosquitoes.">Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).</li><li>Fallon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+properties+of+an+Aedes+albopictus+mosquito+cell+line+infected+with+Wolbachia+strain+wAlbB.">Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB.</a> In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).</li><li>Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+species+are+infected+with+Wolbachia?-A+statistical+analysis+of+current+data.">How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data.</a> Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).</li><li>Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia:+master+manipulators+of+invertebrate+biology.">Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology.</a> National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).</li><li>Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Wolbachia+infections+in+Southeast+Asian+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae).">Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).</li><li>O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).</li><li>McGraw, E. A., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+insecticides:+new+thinking+on+an+ancient+problem.">Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem.</a> National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).</li><li>Bourtzis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+mosquito-Wolbachia+symbiosis+for+vector+and+disease+control.">Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control.</a> Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).</li><li>Turelli, M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+an+inherited+incompatibility+factor+in+California+Drosophila.">Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila.</a> Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).</li><li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission.">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li><li>Walker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wMel+Wolbachia+strain+blocks+dengue+and+invades+caged+Aedes+aegypti+populations.">The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations.</a> Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).</li><li>Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+virulent+and+inhibit+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+in+Anopheles+gambiae.">Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).</li><li>Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endosymbiotic+bacterium+Wolbachia+induces+resistance+to+dengue+virus+in+Aedes+aegypti.">The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).</li><li>Moreira, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wolbachia+symbiont+in+Aedes+aegypti+limits+infection+with+dengue,+Chikungunya,+and+Plasmodium.">A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium.</a> Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).</li><li>Caragata, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+cholesterol+modulates+pathogen+blocking+by+Wolbachia.">Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).</li><li>Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+uses+a+host+microRNA+to+regulate+transcripts+of+a+methyltransferase,+contributing+to+dengue+virus+inhibition+in+Aedes+aegypti.">Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).</li><li>Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya-Wolbachia+interplay+in+Aedes+albopictus.">Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus.</a> Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).</li><li>Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+induces+density-dependent+inhibition+to+dengue+virus+in+mosquito+cells.">Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).</li><li>Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Culicoides+sonorensis+biting+midge+cell+lines+with+Wolbachia+pipientis.">Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis.</a> Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).</li><li>Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+PCR-based+classification+of+Wolbachia+strains+using+wsp+gene+sequences.">Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.</a> The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).</li><li>Park, M. S., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+PaAtg8+and+roles+of+autophagy+in+adaptation+to+starvation+with+respect+to+the+fat+body+and+midgut+of+the+Americana+cockroach,+Periplaneta+americana.">Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).</li><li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin.">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody.">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li><li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti.">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li><li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence,+Western+blotting,+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever.">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li></ol>

Detektion av intracellulär Wolbachia-infektion är avgörande för studier av Wolbachia-värdinteraktioner och bekräftelse av framgångsrik transfektion av celler med nya stammar. I detta protokoll användes fyra metoder för att framgångsrikt detektera intracellulär Wolbachia-infektion vid nukleinsyra- och proteinnivåerna. Dessa fyra experimentella metoder bekräftade och förbättrade detektionsnoggrannheten för Wolbachia-infektion av celler. 
PCR an...

Den asiatiska tigermyggan Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), som är en nyckelvektor för denguevirus (DENV) i Asien och andra delar av världen1, är en naturlig värd för två typer av de intracellulära bakterierna, Wolbachia (wAlbA och wAlbB), som fördelas över bakterielinjen och somatisk vävnad 2,3. Aa23-cellinjen som härrör från A. albopictus-embryon består av minst två morfologiska celltyper, som båda stöder infektion4 och kan botas av infödd Wolbachia-infektion med antibiotika (Aa23-T). Med tanke på att Aa23 endast behåller wAlbB är det en användbar modell för studier av värd-endosymbiontinteraktioner 4,5,6.
Wolbachia överförs maternellt och infekterar uppskattningsvis 65% avinsektsarterna 8,9 och 28% avmyggarterna 10. Det infekterar en mängd olika vävnader och bildar ett intimt symbiotiskt förhållande med värden, vilket vanligtvis inducerar cytoplasmatisk inkompatibilitet (CI)11 och befolkningsersättning genom att manipulera värdens reproduktionssystem12,13. Dessa värdsvar har observerats i naturliga populationer av Drosophila simulans14 och i A. aegypti i en laboratoriebur och fältförsök15. En viktig icke-produktiv manipulation som framkallas av Wolbachia induceras värdresistens mot en mängd olika patogener, inklusive DENV, Chikungunya-virus (CHIKV) och West Nile-virus (WNV)16,17, som kan förmedlas av ett förbättrat medfött immunsystem av symbionten18,19, konkurrens mellan Wolbachia och virus för viktiga värdresurser20 och manipulation av värdvirala försvarsvägar21 .
Detta protokoll har utvecklats för att studera dessa underliggande mekanismer för Wolbachia-inducerade värd antivirala svar. Den använder fyra metoder för detektion av intracellulär Wolbachia-infektion av Aa23-celler. Dessa metoder ger en stark teoretisk grund för studier av intracellulär Wolbachiainfektion hos andra värdarter. Den första metoden, PCR - en kraftfull teknik som möjliggör enzymatisk förstärkning av specifika dna-regioner utan att använda konventionella kloningsförfaranden - användes för att detektera Wolbachia-DNA och bestämma närvaron / frånvaron av Wolbachia-infektion 22. Den andra metoden mäter Wolbachia DNA-kopieringstäthet med hjälp av kvantitativ PCR (qPCR) för tillförlitlig detektion och mätning av produkter som genereras under varje PCR-cykel som står i direkt proportion till mängden mall före PCR23. Den tredje metoden detekterar närvaron av intracellulära Wolbachia-proteiner , med användning av western blot-ett av de mest kraftfulla verktygen för att detektera specifika proteiner i komplexa blandningar genom att kombinera elektrofores höga separationskraft, antikropparnas specificitet och känsligheten hos kromogena enzymatiska reaktioner. Den slutliga metoden är en immunofluorescensanalys (IFA) som kombinerar immunologi, biokemi och mikroskopi för att detektera Wolbachia-ytproteinet (wsp) genom en antigen-antikroppsreaktion för att bekräfta det cellulära upptaget av Wolbachia och bestämma dess cellulära lokalisering.
Detta dokument beskriver de fyra metoderna som anges ovan för att verifiera förekomsten av Wolbachia i cellerna, som kan användas för att upptäcka om den exogena Wolbachia framgångsrikt transfekterades och Wolbachia i cellen rensades. Efter att ha bestämt om Wolbachia finns i cellerna eller inte kan en mängd olika analyser utföras, inklusive genomik, proteomik eller metabolomik. Detta protokoll visar detektion av Wolbachia genom Aa23-celler men kan också användas i andra celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SteREO Discovery V8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Pipetman</td>
			<td>F167380</td>
			<td>P10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cerium doped yttrium aluminum garnet</td>
			<td>MSE Supplies</td>
			<td></td>
			<td>Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip holder</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Cargille Laboratories</td>
			<td>16482</td>
			<td>Type A low viscosity 150 cSt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR light source&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LED1085L</td>
			<td>LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outer ring&#160;</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump lasers&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LD785-SE400</td>
			<td>785 nm, 400 mW, &#216;9 mm, E Pin Code, Laser Diode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raspberry Pi</td>
			<td>Raspberry Pi Fundation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td>SM1 retaining ring for &#216;1&#34; lens tubes and mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedless quartz crystal</td>
			<td>University Wafers, Inc.</td>
			<td>U01-W2-L-190514</td>
			<td>25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shim</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray beam stop</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines

Som en moderligt hyst endosymbiont infekterar Wolbachia stora andelar av insektspopulationer. Studier har nyligen rapporterat den framgångsrika regleringen av RNA-virusöverföring med Wolbachia-transinfekterade myggor. Viktiga strategier för att kontrollera virus inkluderar manipulation av värdreproduktion via cytoplasmatisk inkompatibilitet och hämning av virala transkript via immunpriming och konkurrens om värd-härledda resurser. De underliggande mekanismerna för Svaren från Wolbachia-transfekterade myggor på virusinfektion är dock dåligt förstådda. Denna uppsats presenterar ett protokoll för in vitro-identifiering av Wolbachia-infektion vid nukleinsyra- och proteinnivåerna i Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-celler för att förbättra förståelsen av interaktionerna mellan Wolbachia och dess insektsvektorer. Genom kombinerad användning av polymeraskedjereaktion (PCR), kvantitativa PCR-, western blot- och immunologiska analysmetoder har ett standardmorfologiskt protokoll beskrivits för detektion av Wolbachia-infekterade celler som är mer exakt än användningen av en enda metod. Detta tillvägagångssätt kan också tillämpas på detektion av Wolbachia-infektion i andra insektstaxa.

Innan Wolbachia upptäcktes observerades Aa23- och Aa23-T-celler under ett ljusmikroskop för att bestämma eventuella morfologiska skillnader mellan de två cellinjerna. Aa23- och Aa23-T-celler har minst två cellmorfologier men ingen uppenbar morfologisk skillnad mellan de två celltyperna (figur 1). Här användes Aa23-celler som ett modellsystem för att detektera Wolbachia-infektion med fyra metoder. Positiv förstärkning av Wolbachiawsp-genen</em...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Fyra metoder användes för att detektera intracellulär Wolbachia, som kompletterade varandra och förbättrade detektionsnoggrannheten för Wolbachia-infektion av Aedes albopictus-härledd Aa23 och Aa23-T botad av infödd Wolbachia-infektion med antibiotika.

Detektera Wolbachia Strain wAlbB i Aedes albopictus cellinjer

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Detta protokoll hjälper till att verifiera förekomsten av Wolbachia i celler, vilket är grunden för att förstå interaktionen mellan Wolbachia och dess värd. I detta protokoll användes fyra metoder för att framgångsrikt detektera intracellulär Wolbachia-infektion, vilket bekräftade och förbättrade detektionsnoggrannheten för Wolbachia-infektion av celler. Att demonstrera proceduren kommer att vara Qiuqiu Xiao, en doktorand från Key Laboratory of Modern Pathogen Biology and Characteristics.Börja med att observera oskadade Aa23- och Aa23-T-celler vid 100x förstoring med hjälp av ljusmikroskopi. Odla cellerna i fem till sju dagar för att nå 70 till 80% sammanflöde per kolv. Överför 1 ml av odlingsmediet med en pipett till ett mikrocentrifugrör.Centrifugera vid 100 RCF i fem minuter för att skörda cellerna. Ta bort supernatanten och förvara den resulterande cellpelleten vid minus 20 grader Celsius. Odla cellerna i fem till sju dagar för att nå 90 till 100% sammanflöde per kolv.Resuspendera pellets i 0,40 ml PBS och överför 50 mikroliter av denna lösning till ett mikrocentrifugrör. Tillsätt fem mikroliter på 20 mg/ml proteinas K och inkubera vid 55 grader Celsius i en timme. Inkubera sedan rören vid 99 grader Celsius i 15 minuter för att erhålla det råa DNA och lagra det vid minus 20 grader Celsius.För att utföra PCR, förbered en total reaktionsblandning av 20 mikroliter och ställ in PCR-villkoren enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Detektera DNA på en 1% agarosgel med hjälp av en gelbildare. Utför kvantitativ PCR-förstärkning med TB Green i ett PCR-system i realtid och registrera resultaten av varje reaktion.Analysera DNA i en total reaktionsvolym på 20 mikroliter och ställ in de kvantitativa PCR-förhållandena som beskrivs i textmanuskriptet. Beräkna WSP- och RPS6-genkopienumren i cellerna enligt den fastställda standardkurvan. Beräkna sedan Wolbachias relativa densitet med kopienumret för wsp/RPS6.Analysera data med hjälp av ett oberoende t-test. Tillsätt 200 mikroliter lysbuffert till cellpelleten och inkubera på is i 30 minuter. Centrifugera lysaterna vid 12 000 RCF i 10 minuter vid fyra grader Celsius och aspirera supernatanten.Analysera wsp-koncentrationen hos supernatanten med hjälp av ett BCA-proteinanalyssats, enligt tillverkarens instruktioner. Ladda lika stora mängder protein på en 15% SDS-PAGE gel. Överför proteinet till nitrocellulosamembran och blockera membranen med 5% skummjölk i två timmar vid rumstemperatur.Tvätta sedan membranen tre gånger med TBST. Inkubera membranen över natten vid 4 grader Celsius med 100 mikroliter anti-wsp polyklonal antikropp framställd genom att späda ut den primära antikroppen med 5% skummjölk. Tvätta den primära antikroppen tre gånger med TBST.Tillsätt 100 mikroliter pepparrotsperoxidaskonjugerad sekundär antikropp till membranen och inkubera den på en shaker i en timme vid rumstemperatur. Tvätta membranen tre gånger med TBST och blanda 20 mikroliter lösning A och 20 mikroliter lösning B i kemiluminescensdetekteringssatsen i förhållandet ett till ett. Sänk ner hela membranet i luminiscenslösningen samtidigt och observera signalerna med hjälp av ett multifunktionellt bildsystem.På en laserkonfokal petriskål inkuberar du Aa23- och Aa23-T-celler i tre till fyra dagar vid 28 grader Celsius under 5% atmosfärisk koldioxid. När cellen når 60 till 70% sammanflöde, tvätta cellerna tre gånger med PBS. Fixera cellerna i en ml 4% paraformaldehyd i 20 minuter vid fyra grader Celsius.Tvätta de fasta cellerna med PBST i fem minuter och tvätta cellerna två gånger med PBS. Inkubera petriskålen i en ml 3% bovint serumalbumin i en timme vid 37 grader Celsius. Tillsätt 100 mikroliter av mus anti-wsp polyklonal antikropp och musserum till bilderna och inkubera det över natten i en våt låda vid fyra grader Celsius.Ta bort petriskålen från den våta lådan och sätt tillbaka dem till rumstemperatur. Tvätta dem tre gånger med PBS och ta bort PBS. Skydda följande procedurer från ljus.Inkubera petriskålen med 100 mikroliter av en Alexa Fluor 488-konjugerad get-antimusantikropp vid 37 grader Celsius i 30 minuter. Inkubera petriskålen med 50 mikroliter DAPI utspädd i PBS till 10 mikrogram/ml vid 37 grader Celsius i fem minuter och tvätta dem sedan tre gånger med PBS. Observera immunfärgningen under ett konfokalmikroskop.Innan Wolbachia detekterades observerades Aa23- och Aa23-T-celler under ett ljusmikroskop för att bestämma morfologiska skillnader mellan de två cellinjerna. Aa23- och AA23-T-cellerna hade minst två cellmorfologier men inga uppenbara morfologiska skillnader observerades mellan de två celltyperna. Med hjälp av de diagnostiska primersna 81F/691R detekterades positiv förstärkning av Wolbachia wsp-genen i Aa23-celler men inte i Aa23-T-celler.Analysen av Wolbachia-densiteten i cellinjerna visade ett wsp/rps6-förhållande på 2,4 i Aa23-celler men ingen Wolbachia i Aa23-T-celler. Western blot-analys av proteinextrakt visade en stark wsp-signal för Aa23 men ingen signal detekterades för Aa23-T. Den indirekta immunofluorescensanalysen detekterade wsp-proteinet i Aa23-celler, medan endast DAPI-färgat DNA detekterades i Aa23-T-celler.Se till att odlingskolvarna inkuberas vid 28 grader Celsius under 5% atmosfärisk koldioxid i fem till sju dagar. Denna procedur kan följas av elektronmikroskopi där man måste ägna särskild uppmärksamhet åt provberedning och sektionering. De fyra experimentella metoderna som användes i denna studie bekräftade detektionsnoggrannheten för Wolbachia-infektion i celler, vilket också är tillämpligt på andra typer av celler och vävnader.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Härledning av thymic Lymfom T-cellinjer från Atm - / -</sup Och P53 - / -</sup Möss

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Upprättande av Epstein-Barr virus Tillväxt-transformerade lymfoblastoida cell-linjer

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Upptäcka Glykogen i perifera mononukleära blodceller med Periodic Acid Schiff Färgning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Förebyggande av värmestress Biverkningar hos råttor efter<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Stam

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Upptäcka Cortex Fragment Under Bacterial sporgroning

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

En enkel röda blodkroppar Lysis metod för upprättande av B lymfoblastoidcellinjer

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

En effektiv och enkel metod för att fastställa NK och T cellinjer från patienter med kronisk aktiv Epstein - Barr virusinfektion

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Metoder för att upptäcka cytotoxiska amyloid följande infektion av pulmonell Endothelial celler av Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vektorkompetensanalyser på Aedes aegypti myggor med Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Förökning av Microsporidian Parasite Edhazardia aedis i Aedes aegypti Myggor

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...