Name: high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water
Uploaded: 2022-04-28T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water at JoVE.com

يعرب المؤلفون عن امتنانهم لميكايلا زامبوني من مركز يوليش لعلوم النيوترون في هاينز ماير لايبنيتز سنتروم ، جارشينج ، ألمانيا ، لجزء من تجارب تشتت النيوترونات التي أجريت على أداة SPHERES. وقد استفاد هذا العمل من أنشطة اتحاد مختبرات Deuteration (DLAB) الذي يموله الاتحاد الأوروبي بموجب العقدين HPRI-2001-50065 و RII3-CT-2003-505925 ، ومن النشاط الممول من مجلس أبحاث العلوم الهندسية والفيزيائية في المملكة المتحدة (EPSRC) داخل معهد Laue Langevin EMBL DLAB بموجب المنح GR / R99393/01 و EP / C015452 / 1. الدعم المقدم من المفوضية الأوروبية في إطار البرنامج الإطاري السابع من خلال الإجراء الرئيسي: تعزيز منطقة البحوث الأوروبية ، يتم الاعتراف بالبنى التحتية البحثية [العقد 226507 (NMI3)]. يشكر كيفن بونوت وكريستيان بيك الوزارة الفيدرالية للتعليم والبحث (BMBF ، رقم المنحة 05K19VTB) على تمويل زمالات ما بعد الدكتوراه.

1. إعداد المخزن المؤقت deuterated للبروتينات في الحالة السائلة
<ol><li>حل جميع مكونات المخزن المؤقت في D2O النقي.</li>
	<li>إذا تمت معايرة قطب الأس الهيدروجيني في H2O ، فاضبط pD وفقا للصيغة pD = pH + 0.4 باستخدام NaOD أو DCl34. ملاحظة: قد يؤثر استخدام D 2O بدلا من H2O على قا...

التحليل الطيفي النيوتروني هو الطريقة الوحيدة التي تسمح بفحص ديناميكيات ps-ns ذات المتوسط الجماعي لعينات البروتين بغض النظر عن حجم البروتين أو تعقيد المحلول عند استخدام deuteration6. على وجه التحديد ، من خلال التحقيق في الانتشار الذاتي لمجموعات البروتين في المحلول ، يمكن تحديد الحجم...

النيوترون هو جسيم ضخم بدون شحنة تم استخدامه بنجاح على مر السنين لفحص العينات في مختلف المجالات من الفيزياء الأساسية إلى علم الأحياء1. بالنسبة للتطبيقات البيولوجية ، يتم استخدام تشتت النيوترونات بزاوية صغيرة ، وتشتت النيوترونات غير المرن ، وعلم البلورات النيوتروني وقياس الانعكاس على نطاق واسع2،3،4. يوفر تشتت النيوترونات غير المرن قياسا متوسطا للديناميكيات دون الحاجة إلى وضع علامات محددة في حد ذاتها ، وجودة إشارة لا تعتمد على الحجم أو البروتين5. يمكن إجراء القياس باستخدام بيئة معقدة للغاية للبروتين قيد الدراسة الذي يحاكي الوسط داخل الخلايا ، مثل المحللة البكتيرية المنزوعة أو حتى في الجسم الحي3،6،7. يمكن استخدام إعدادات تجريبية مختلفة لدراسة الديناميات ، وهي i) وقت الرحلة الذي يمنح الوصول إلى ديناميكيات ps-ps الفرعية ، ii) الوصول إلى التشتت العكسي إلى ديناميكيات ps-ns ، و iii) الوصول إلى الصدى المغزلي إلى الديناميكيات من ns إلى مئات ns. يستخدم التشتت العكسي للنيوترونات قانون براغ 2d sinθ = nλ ، حيث d هي المسافة بين المستويات في البلورة ، و θ زاوية التشتت ، و n ترتيب التشتت ، و λ الطول الموجي. يسمح استخدام البلورات للتشتت العكسي نحو أجهزة الكشف بتحقيق دقة عالية في الطاقة ، عادة ~ 0.8 μeV. لقياس تبادل الطاقة ، يتم استخدام إما محرك دوبلر يحمل بلورة في التشتت العكسي لتحديد وضبط الطول الموجي النيوتروني الوارد8،9،10 (الشكل 1) ، أو يمكن استخدام إعداد وقت الرحلة على حساب انخفاض في دقة الطاقة11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63664/63664fig01.jpg"> الشكل 1: رسم مطياف التشتت العكسي للنيوترونات بمحرك دوبلر. يصطدم الشعاع الوارد بمروحية تحويل فضاء الطور (PST)42 ، مما يزيد من التدفق في موضع العينة. ثم يتم تشتيتها مرة أخرى نحو العينة بواسطة محرك دوبلر ، الذي يختار الطاقة E1 (السهم السماوي). ثم يتم تشتيت النيوترونات بواسطة العينة (مع طاقات مختلفة ممثلة بلون الأسهم) والمحللين ، المصنوع من بلورات Si 111 ، سوف ينتشر فقط النيوترونات ذات الطاقة المحددة E0 (الأسهم ذات اللون الأحمر هنا). ومن ثم ، يتم الحصول على نقل الزخم q من الموضع المكتشف للنيوترون على صفيف الكاشف ، ويتم الحصول على نقل الطاقة من الفرق E1- E0. يتم استخدام وقت الرحلة المتوقع لنبضة النيوترون التي تنتجها PST لتجاهل الإشارة من النيوترونات المنتشرة مباشرة نحو أنابيب الكاشف. اختصار: PST = تحويل مساحة الطور. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63664/63664fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
بالنسبة للتحليل الطيفي للتشتت العكسي ، تأتي المساهمة الرئيسية في الإشارة من العينات الغنية ببروتون الهيدروجين ، مثل البروتينات ، من التشتت غير المترابط ، حيث تظهر شدة التشتت Sinc (q ، ω) بواسطة Eq (1) 12
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)
حيث σinc هو المقطع العرضي غير المترابط للعنصر المعتبر ، k 'هو معيار المتجه الموجي المتناثر ، k هو معيار المتجه الموجي الوارد ، q (= k - k') نقل الزخم ، r j (t) متجه موضع الذرة j في الوقت t ، و ω التردد المقابل لنقل الطاقة بين النيوترون الوارد والنظام. تشير الأقواس الزاوية إلى متوسط المجموعة. ومن ثم ، فإن التشتت غير المترابط يسبر الارتباط الذاتي للجسيم الواحد متوسط المجموعة لمواقع الذرة مع الوقت ويعطي متوسط الديناميكيات الذاتية على جميع الذرات في النظام وأصول زمنية مختلفة (متوسط المجموعة). دالة التشتت هي تحويل فورييه في زمن دالة التشتت الوسيطة I (q، t) ، والتي يمكن اعتبارها تحويل فورييه في الفضاء لدالة ارتباط فان هوف الموضحة بواسطة Eq (2):
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
حيث ρ (r، t) هي كثافة احتمال إيجاد ذرة في الموضع r والوقت t 13.
بالنسبة لعملية الانتشار الويكي ، تنتج دالة الانتشار الذاتي (انظر Eq (3)) بعد تحويل فورييه المزدوج في دالة تشتت تتكون من لورنتزيان بعرض الخط المعطى بواسطة γ = Dq2.
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq10.jpg" style="margin: auto;"> (3)
تم تطوير نماذج أكثر تطورا ووجدت مفيدة مثل نموذج انتشار القفز بواسطة Singwi و Sjölander لديناميات البروتين الداخليةps-ns 14 أو نموذج الدوران بواسطة Sears لمياه الترطيب15،16،17.
على أداة التشتت العكسي للنيوترونات (NBS) IN16B 8,9 في ILL، غرونوبل، فرنسا (الشكل التكميلي S1)، يتكون الإعداد الذي يشيع استخدامه مع البروتينات من بلورات Si 111 للمحللات مع محرك دوبلر لضبط الطول الموجي الوارد (الشكل التكميلي S2A)، مما يتيح الوصول إلى نطاق نقل الزخم ~ 0.2 Å-1 < q < ~ 2 Å-1 ونطاق نقل الطاقة -30 μeV < <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> < 30 μeV المقابلة لجداول زمنية تتراوح من بضعة ps إلى عدد قليل من ns ومسافات قليلة Å. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر IN16B إمكانية إجراء عمليات مسح مرنة وغير مرنة للنافذة الثابتة (E / IFWS) 10 ، والتي تشمل الحصول على البيانات عند نقل الطاقة الثابتة. نظرا لأن التدفق محدود عند العمل مع النيوترونات ، فإن E / IFWS يسمح بتعظيم التدفق لنقل طاقة واحد ، وبالتالي تقليل وقت الاكتساب اللازم للحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء مرضية. والخيار الأحدث هو النمط11 لمطياف التشتت العكسي ووقت الطيران (BATS) ، والذي يسمح بقياس مجموعة واسعة من عمليات نقل الطاقة ، (على سبيل المثال ، -150 μeV < <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> < 150 μeV) ، مع تدفق أعلى من محرك دوبلر ، ولكن على حساب دقة طاقة أقل (الشكل التكميلي S2B).
من الخصائص المهمة لتشتت النيوترونات أن المقطع العرضي غير المترابط σinc له قيمة أعلى 40 مرة للهيدروجين من الديوتيريوم ولا يكاد يذكر بالنسبة للعناصر الأخرى التي توجد عادة في العينات البيولوجية. لذلك ، يمكن دراسة ديناميكيات البروتينات في بيئة سائلة باستخدام مخزن مؤقت مقسم ، وتسمح حالة المسحوق بدراسة إما الديناميات الداخلية للبروتين مع مسحوق البروتين المهدرج المبلل ب D 2 O ، أودراسة ماء الترطيب لمسحوق البروتين perdeuterated المائي باستخدام H2O. في الحالة السائلة ، يسمح التشتت العكسي للنيوترونات عادة بالوصول في وقت واحد إلى الانتشار الذاتي لمركز الكتلة للبروتينات (الانتشار من نوع Fickian) وديناميكياتها الداخلية. هذه الأخيرة هي حركات العمود الفقري والسلسلة الجانبية التي يصفها عادة ما يسمى نموذج انتشار القفز أو غيره 3,18. في مساحيق البروتين المهدرجة ، يكون انتشار البروتين غائبا ويجب نمذجة الديناميات الداخلية فقط. بالنسبة لمياه الإماهة ، فإن مساهمات الحركات الانتقالية والدورانية لجزيئات الماء تقدم اعتمادا مختلفا على نقل الزخم q ، مما يسمح بتمييزها في عملية تحليل البيانات17.
توضح هذه الورقة طريقة التشتت العكسي للنيوترونات مع دراسة البروتينات التي وجد أنها قادرة على التكشف ، وتتجمع في شكل قانوني يتكون من أكوام من خيوط β - ما يسمى بنمط β المتقاطع19،20 - وتشكل أليافا ممدودة. هذا هو ما يسمى بتجميع الأميلويد ، والذي تمت دراسته على نطاق واسع بسبب دوره المركزي في الاضطرابات التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر أو مرض باركنسون21,22. إن دراسة بروتينات الأميلويد مدفوعة أيضا بالدور الوظيفي الذي يمكن أن تلعبه 23,24 أو إمكاناتها العالية لتطوير مواد حيوية جديدة25. لا تزال المحددات الفيزيائية والكيميائية لتجميع الأميلويد غير واضحة ، ولا تتوفر نظرية عامة لتجميع الأميلويد ، على الرغم من التقدم الهائل خلال السنوات الماضية21,26.
ينطوي تجميع الأميلويد على تغييرات في بنية البروتين واستقراره مع مرور الوقت ، والتي تنطوي دراستها بشكل طبيعي على ديناميكيات مرتبطة باستقرار تكوين البروتين ، ووظيفة البروتين ، ومشهد طاقة البروتين27. ترتبط الديناميكيات ارتباطا مباشرا باستقرار حالة معينة من خلال المساهمة الإنتروبية لأسرع الحركات28 ، ويمكن الحفاظ على وظيفة البروتين من خلال الحركات على نطاقات زمنية مختلفة من sub-ps للبروتينات الحساسة للضوء29 إلى ms لحركات المجال ، والتي يمكن تسهيلها بواسطة ديناميكيات بيكو ثانيةنانو ثانية 30.
سيتم تقديم مثالين على استخدام التحليل الطيفي للتشتت العكسي للنيوترونات لدراسة بروتينات الأميلويد ، أحدهما في الحالة السائلة لدراسة ديناميكيات البروتين والآخر في حالة المسحوق المائي لدراسة ديناميكيات الماء المماهة. يتعلق المثال الأول بتجميع الليزوزيم في كرات بحجم ميكرومتر (تسمى الجسيمات) متبوعة في الوقت الفعلي5 ، والثاني مقارنة لديناميكيات المياه في الحالات الأصلية والمجمعة للبروتين البشري تاو31.
الليزوزيم هو إنزيم يشارك في الدفاع المناعي ويتكون من 129 من بقايا الأحماض الأمينية. يمكن أن يشكل الليزوزيم جسيمات في المخزن المؤقت المثبط عند pD 10.5 وعند درجة حرارة 90 درجة مئوية. مع تشتت النيوترونات ، أظهرنا أن التطور الزمني لمعامل انتشار مركز الكتلة للليزوزيم يتبع الحركية الأسية المفردة لتألق ثيوفلافين T (مسبار فلوري يستخدم لمراقبة تكوين أنماط β المتقاطع الأميلويد32) ، مما يشير إلى أن الهياكل الفوقية للجسيمات وأنماط β المتقاطع تحدث في خطوة واحدة بنفس المعدل. علاوة على ذلك ، ظلت الديناميات الداخلية ثابتة طوال عملية التجميع ، والتي يمكن تفسيرها إما من خلال تغيير توافقي سريع لا يمكن ملاحظته على أدوات NBS ، أو من خلال عدم وجود تغيير كبير في الطاقة الداخلية للبروتين عند التجميع.
البروتين البشري تاو هو بروتين مضطرب جوهريا (IDP) يتكون من 441 من الأحماض الأمينية لما يسمى ب 2N4R isoform ، والذي يشارك بشكل خاص في مرض الزهايمر33. باستخدام التشتت العكسي للنيوترونات على مساحيق بروتين تاو perdeuterated ، أظهرنا أن ديناميكيات الماء المائيات تزداد في حالة الألياف ، مع وجود عدد أكبر من جزيئات الماء التي تخضع لحركات متعدية. تشير النتيجة إلى أن الزيادة في إنتروبيا الماء المائي قد تؤدي إلى رجفان الأميلويد في تاو.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum sample holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, &#8805;99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td> 
			543047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D, 99.9%)</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>DLM-4DR-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning high-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.5901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 75871-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator plate, 140 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>00470.G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nPDyn</td>
			<td></td>
			<td>v3.x</td>
			<td>see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>92641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 0.5-10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 100-1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 20-200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-0206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>372072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water

يوفر تشتت النيوترونات إمكانية سبر الديناميكيات داخل العينات لمجموعة واسعة من الطاقات بطريقة غير مدمرة وبدون تسمية بخلاف الديوتيريوم. على وجه الخصوص ، يسجل التحليل الطيفي للتشتت العكسي للنيوترونات إشارات التشتت بزوايا تشتت متعددة في وقت واحد وهو مناسب تماما لدراسة ديناميكيات الأنظمة البيولوجية على مقياس ps-ns الزمني. من خلال استخدام D2O - وربما مكونات عازلة متوقفة - تسمح الطريقة بمراقبة كل من انتشار مركز الكتلة وحركات العمود الفقري والسلسلة الجانبية (الديناميات الداخلية) للبروتينات في الحالة السائلة.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دراسة ديناميكيات مياه الترطيب عن طريق استخدام مساحيق من البروتينات المثبطة المرطبة ب H2O. تقدم هذه الورقة سير العمل المستخدم على الأداة IN16B في معهد Laue-Langevin (ILL) للتحقيق في ديناميكيات البروتين والماء المائي. يتم شرح تحضير عينات المحلول وعينات مسحوق البروتين المائي باستخدام تبادل البخار. يتم وصف إجراء تحليل البيانات لكل من ديناميات البروتين والماء الإماهة لأنواع مختلفة من مجموعات البيانات (الأطياف شبه المرنة أو عمليات المسح ذات النافذة الثابتة) التي يمكن الحصول عليها على مطياف التشتت العكسي للنيوترونات.
يتم توضيح الطريقة من خلال دراستين تتضمنان بروتينات الأميلويد. يظهر أن تجميع الليزوزيم إلى مجاميع كروية بحجم ميكرومتر - يشار إليها بالجسيمات - يحدث في عملية من خطوة واحدة على النطاق المكاني والزمني الذي تم فحصه في IN16B ، بينما تظل الديناميكيات الداخلية دون تغيير. علاوة على ذلك ، تمت دراسة ديناميات ماء الترطيب في تاو على مساحيق رطبة من البروتين perdeuteated. يتبين أن الحركات الانتقالية للماء يتم تنشيطها عند تكوين ألياف الأميلويد. أخيرا ، تتم مناقشة الخطوات الحاسمة في البروتوكول حول كيفية وضع تشتت النيوترونات فيما يتعلق بدراسة الديناميات فيما يتعلق بالطرق الفيزيائية الحيوية التجريبية الأخرى.

تم إجراء تجميع الليزوزيم في الجسيمات عند 90 درجة مئوية بتركيز بروتين 50 مجم / مل في مخزن مؤقت مقسم (0.1 M NaCl عند pD 10.5). يتم تشغيل تكوين الجسيمات من خلال زيادة درجة الحرارة إلى 90 درجة مئوية ويحدث في غضون 6 ساعات (الشكل التكميلي S8). تم الحصول على البيانات على IN16B ، كما هو موضح في البروتوكول أع?...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water at JoVE.com

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

يوفر التحليل الطيفي للتشتت العكسي للنيوترونات وصولا غير مدمر وخالي من الملصقات إلى ديناميكيات ps-ns للبروتينات ومياه ترطيبها. يتم تقديم سير العمل مع دراستين حول بروتينات الأميلويد: حول ديناميكيات الليزوزيم التي تم حلها زمنيا أثناء التجميع وعلى ديناميكيات الماء المائية لتاو عند تكوين الألياف.

مطيافية نيوترونية عالية الدقة لدراسة ديناميكيات بيكو ثانية-نانوثانية للبروتينات ومياه الترطيب

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

يقيس التشتت العكسي للنيوترونات الانتشار العالمي والديناميكيات الداخلية للبروتينات ومياه الترطيب دون ضرر إشعاعي. يصل التحليل الطيفي النيوتروني في وقت واحد إلى الارتباطات المكانية والزمنية على المستوى الجزيئي. في المادة اللينة والمواد البيولوجية ، من المثير للاهتمام بشكل خاص الحصول على معلومات غير مباشرة عن النظام المحلي على أنظمة الاضطرابات طويلة المدى هذه.ومن ثم، يمكن استخدام التشتت العكسي للنيوترونات لدراسة الديناميات في علم الأحياء، أو الكيمياء، أو الحس المادي. مجال قوي آخر هو الطاقة ، مع دراسات ، على سبيل المثال ، على البطاريات وخلايا الوقود. تم استخدام التشتت العكسي للنيوترونات بنجاح لدراسة الديناميات الجزيئية للبروتينات المشاركة في الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر وباركنسون.تساعدنا النتائج التي تم الحصول عليها على فهم أفضل للسمات الجزيئية لهذه الأمراض وقد تمهد الطريق لتطوير تشخيصات أفضل. لتحضير حامل العينة ، ابدأ بتنظيف حامل عينة مسطح من الألومنيوم تماما وختم سلك الإنديوم والبراغي بالماء ، متبوعا بالإيثانول ، ثم اتركه يجف. قم بوزن الأجزاء المختلفة من حامل العينة، بما في ذلك الجزء السفلي والغطاء وسلك الإنديوم، بشكل منفصل على ميزان دقيق.ضع ختم سلك الإنديوم الذي يبلغ طوله ملليمترا واحدا في أخدود الجزء السفلي من حامل العينة ، تاركا تداخلا صغيرا حيث ينضم الطرفان. أضف حوالي 100 ملليغرام من البروتين المجفف بالتجميد بحيث يملأ السطح الداخلي للجزء السفلي من حامل العينة. بعد ذلك ، ضع حامل العينة في مجفف مع طبق بتري يحتوي على مسحوق خامس أكسيد الفوسفور لمدة 24 ساعة لتجفيف مسحوق البروتين تماما.قم بوزن الجزء السفلي المجفف من حامل العينة الذي يحتوي على ختم الإنديوم والمسحوق المجفف للحصول على كتلة العينة المجففة. قم بإزالة خامس أكسيد الفوسفور من المجفف وضع طبق بتري مع أكسيد الديوتيريوم وكذلك العينة بالداخل لترطيب المسحوق. كرر التجفيف والترطيب ثلاث مرات لتبادل كامل للهيدروجين إلى الديوتيريوم.قم بقياس كتلة المسحوق بانتظام للتحقق من مستوى الترطيب وعندما يكون الترطيب أعلى قليلا من المستوى المطلوب ، انتظر حتى تنخفض الكتلة ببطء. بمجرد الحصول على الترطيب المطلوب ، ضع الغطاء بسرعة على الجزء السفلي وأغلق حامل العينة أولا بأربعة براغي لإيقاف تبادل البخار. ضع وشد جميع البراغي المتبقية حتى لا تظهر فجوة بين الجزء السفلي والغطاء.قم بوزن حامل العينة المختوم للتحقق من أي فقد محتمل للترطيب عن طريق التسريبات بعد تجربة النيوترونات. لتحضير عينة الحالة السائلة ، قم بإذابة البروتين في المخزن المؤقت المثنى. باستخدام الماء، حدد الحجم المناسب للسائل لوضعه في حامل العينة.قبل التعامل مع أي مادة ، تأكد من أن جرعة الإشعاع المؤين أقل من 100 ميكروسيفرت في الساعة. بعد ذلك ، جفف عصا العينة تماما وأزل أي عينة سابقة. ضع العينة على عصا العينة ، وتحقق من التمركز المناسب بالنسبة لمركز الحزمة ، وأدخل عصا العينة في فرن التبريد.للحصول على البيانات في Nomad ، انتقل إلى علامة تبويب التنفيذ واسحب وحدة تحكم cryostat للفرن وأفلتها في لوحة التشغيل. ضبط درجة الحرارة إلى 200 كلفن. استخدم الوضع السريع ومهلة 30 دقيقة حتى تستقر درجة الحرارة.انقر على أيقونة تجديد المعلومات لتشغيل منحدر درجة الحرارة في الخلفية للحصول على البيانات أثناء انخفاض درجة الحرارة. اسحب وحدة التحكم في إعدادات IN16 Doppler وأفلتها في لوحة التشغيل. اضبط ملف تعريف السرعة على سرعة دقيقة ، واضبط على الحد الأقصى لدلتا E ، وإزاحة الطاقة إلى 0.00 ميكرو إلكترون فولت ، وعدد القنوات إلى 128 للحصول على تكوين مسح نافذة ثابتة مرنة.قم بسحب وإسقاط وحدة تحكم العد في لوحة التشغيل ، واملأ حقل الترجمة باسم يسمح بسهولة التعرف على البيانات ، وقم بتعيين عمليات المسح لمدة 30 ثانية مع 60 تكرارا. بعد ذلك، اسحب وحدة التحكم في إعدادات IN16 Doppler وأفلتها في لوحة التشغيل. اضبط ملف تعريف السرعة على التوقيع ، والتعيين حسب السرعة بقيمة 4.5 متر في الثانية ، وعدد القنوات إلى 2048 للحصول على تكوين تشتت نيوتروني شبه مرن.قم بسحب وإسقاط وحدة تحكم العد واملأ حقل الترجمة باسم يسمح بسهولة التعرف على البيانات. اضبط عمليات المسح لمدة 30 دقيقة مع أربع تكرارات. بالنسبة لمنحدر درجة الحرارة ، قم بسحب وإسقاط وحدة التحكم في cryostat الفرن ، واضبط درجة الحرارة على 310 كلفن ، واضبط المنحدر على نقطة ضبط دلتا 0.05 كلفن لمدة ست ثوان.استخدم مهلة 200 دقيقة. استخدم حلقة for مع 65 تكرارا. في الداخل ، أدخل وحدة تحكم إعدادات دوبلر IN16 ، متبوعة بوحدة التحكم في العد واضبط مسحا واحدا لمدة 30 ثانية.بعد ذلك ، أدخل إعدادات IN16 Doppler كما هو موضح سابقا ، ولكن باستخدام إزاحة طاقة تبلغ 1.5 ميكرو إلكترون فولت و 1024 قناة. بعد ذلك ، أدخل وحدة التحكم في العد وقم بتعيين مسح واحد لمدة ثلاث دقائق. للحصول على آخر تشتت نيوتروني شبه مرن يبلغ 312 كلفن ، اسحب وأفلت إعدادات IN16 Doppler ووحدات التحكم في العد التي تم تكوينها كما هو موضح سابقا.ثم اضغط على زر البدء لتشغيل البرنامج النصي. أظهرت عمليات مسح النوافذ الثابتة المرنة وغير المرنة للجسيمات الليزوزومية زيادة في الإشارة عند نقل الزخم المنخفض ونقل الطاقة المنخفض ، بينما انخفضت الإشارة عند نقل الطاقة العالية ونقل الزخم المنخفض. كان المركز الأولي لمعامل انتشار الكتلة 15 أنجستروم تربيع لكل نانوثانية ، والذي انخفض بعد ذلك أضعافا مضاعفة بمرور الوقت.عند درجات حرارة أعلى من 220 كلفن ، كان ماء الترطيب حول ألياف تاو أكثر قدرة على الحركة بشكل ملحوظ من حول مونومرات تاو. تم زيادة جزء جزيئات الماء التي تخضع لحركة انتقالية ومعاملات الانتشار الانتقالي والدوران لجزيئات الماء حول الألياف. يجب أن يكون تركيز البروتين 2000 ملليغرام لكل مل أو 20 ملليغرام على الأقل لكل مل للبروتينات البروتينية بسبب قيود تشتت النيوترونات الخلفية من تدفق النيوترون أو الخلفية العازلة لحامل العينة.تم مؤخرا تطبيق التشتت العكسي للنيوترونات ، على سبيل المثال ، لفهم كيف يمكن استبدال الماء ، وهو البروتينات البيئية الطبيعية ، بالكامل ببوليمر اصطناعي لتطبيق التكنولوجيا الحيوية مثل ، على سبيل المثال ، توصيل الدواء.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

النووي التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي لتحديد Phosphorylations متعددة من جوهريا المختلين البروتينات

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

عالية الدقة تحليل الجسيمات واحد من البريد الإلكتروني المجهر الصور باستخدام سفير

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

تجميد التساهمية من البروتينات للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

قياس تفاعلات البروتينات كروي والخيطية مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) وعبارة ثيرموفوريسيس (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

استخدام الأنابيب الفلورية الرنين نقل الطاقة لدراسة ديناميات البروتين المجمعات في مقياس زمني ميلي ثانية

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

التنميط العالي الاستبانة بواسطة Cryoslicing BN-MS التحليل

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

والتحليل الطيفي رامان المتكاملة وكتله الطيف الكتلي لدراسة امتصاص المخدرات خليه واحده, الأيض, والآثار

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

المقطع المستعرض من الأرز الناضج(Oryza sativa L.) حبات لمسح المجهر الإلكتروني التصوير باستخدام نصائح ماصة كدعم تعطيل

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

التحليل الطيفي المزدوج اللون للفلورسين المترابط لدراسة التفاعل بين البروتين والبروتين وديناميكيات البروتين في الخلايا الحية

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

التحليل الطيفي للقرص المضغوط لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي والبروتين

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...