Name: high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water
Uploaded: 2022-04-28T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water at JoVE.com

Forfatterne takker Michaela Zamponi ved Jülich Centre for Neutron Science ved Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Tyskland, for en del af neutronspredningseksperimenterne udført på instrumentet SPHERES. Dette arbejde har nydt godt af aktiviteterne i konsortiet Deuteration Laboratory (DLAB), der finansieres af Den Europæiske Union i henhold til kontrakterne HPRI-2001-50065 og RII3-CT-2003-505925, og af UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC)-finansierede aktiviteter inden for Institut Laue Langevin EMBL DLAB under tilskud GR/R99393/01 og EP/C015452/1. Støtte fra Europa-Kommissionen under det 7. rammeprogram gennem nøgleaktionen: styrkelse af det europæiske forskningsrum, forskningsinfrastrukturer anerkendes [kontrakt 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot og Christian Beck takker Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning (BMBF, bevillingsnummer 05K19VTB) for finansiering af deres postdoc-stipendier.

1. Forbered den deutererede buffer til proteiner i flydende tilstand
<ol><li>Alle bufferens bestanddele opløses i ren D2O.</li>
	<li>Hvis pH-elektroden blev kalibreret i H2O, justeres pD i henhold til formlen pD = pH + 0,4 ved hjælp af NaOD eller DCl34. BEMÆRK: Brug af D 2O i stedet for H2O kan påvirke proteinopløseligheden, og bufferbetingelserne skal muligvis tilpasses (f.eks. ved en lille ændring i saltkoncentrationen).</li...

Neutronspektroskopi er den eneste metode, der gør det muligt at undersøge proteinprøvers ensemble-gennemsnitlige ps-ns-dynamik uanset proteinets størrelse eller opløsningens kompleksitet, når deuteration anvendes6. Specifikt ved at undersøge selvdiffusion af proteinsamlinger i opløsning kan den hydrodynamiske størrelse af sådanne samlinger entydigt bestemmes. Ikke desto mindre er metoden almindeligvis begrænset af den lave neutronflux, hvilket indebærer lange erhvervelsestider og behov...

Neutronen er en ladningsfri og massiv partikel, der med succes er blevet brugt gennem årene til at undersøge prøver på forskellige områder fra grundlæggende fysik til biologi1. Til biologiske anvendelser anvendes småvinkel neutronspredning, uelastisk neutronspredning og neutronkrystallografi og reflektometri i vid udstrækning 2,3,4. Uelastisk neutronspredning giver en ensemble-gennemsnitlig måling af dynamikken uden at kræve specifik mærkning i sig selv og en signalkvalitet, der ikke afhænger af størrelsen eller proteinet5. Målingen kan udføres ved hjælp af et meget komplekst miljø for det undersøgte protein, der efterligner det intracellulære medium, såsom et deutereret bakterielt lysat eller endda in vivo 3,6,7. Forskellige eksperimentelle opsætninger kan bruges til at studere dynamikken, nemlig i) time-of-flight-giver adgang til sub-ps-ps-dynamik, ii) backscattering-giver adgang til ps-ns-dynamik og iii) spin-ekko-giver adgang til dynamik fra ns til hundredvis af ns. Neutron backscattering gør brug af Braggs lov 2d sinθ = nλ, hvor d er afstanden mellem planer i en krystal, θ spredningsvinklen, n spredningsrækkefølgen og λ bølgelængden. Brugen af krystaller til backscattering mod detektorerne giver mulighed for at opnå en høj opløsning i energi, typisk ~ 0,8 μeV. For at måle energiudvekslingen bruges enten et Doppler-drev, der bærer en krystal i backscattering, til at definere og indstille den indkommende neutronbølgelængde 8,9,10 (figur 1), eller en time-of-flight-opsætning kan bruges på bekostning af et fald i energiopløsning 11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63664/63664fig01.jpg"> Figur 1: Skitse af et neutron backscattering spektrometer med et Doppler-drev. Den indkommende stråle rammer faserumstransformationen (PST) chopper42, hvilket øger fluxen ved prøvepositionen. Det spredes derefter tilbage mod prøven af Doppler-drevet, som vælger en energi E1 (cyanpil). Neutronerne spredes derefter af prøven (med forskellige energier repræsenteret af pilenes farve), og analysatorerne, der er lavet af Si 111-krystaller, vil kun backscatter neutroner med en bestemt energi E0 (rødfarvede pile her). Derfor opnås momentumoverførslen q fra neutronens detekterede position på detektorarrayet, og energioverførslen opnås fra forskellen E1- E0. Den forventede flyvetid for neutronpulsen produceret af PST bruges til at kassere signalet fra neutronerne spredt direkte mod detektorrørene. Forkortelse: PST = fase rumtransformation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63664/63664fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
For backscattering-spektroskopi kommer hovedbidraget til signalet fra hydrogenprotonrige prøver, såsom proteiner, fra usammenhængende spredning, for hvilken spredningsintensiteten Sinc(q, ω) er vist ved Eq (1)12
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)
Hvor σinc er det usammenhængende tværsnit af det betragtede element, er k' normen for den spredte bølgevektor, k normen for den indkommende bølgevektor, q (= k - k') momentumoverførslen, r j (t) positionsvektoren for atom j på tidspunktet t og ω frekvensen svarende til energioverførslen mellem den indkommende neutron og systemet. Vinkelbeslagene angiver ensemblegennemsnittet. Derfor undersøger usammenhængende spredning den ensemble-gennemsnitlige enkeltpartikel-selvkorrelation af atompositioner med tiden og giver selvdynamikken i gennemsnit over alle atomer i systemet og forskellige tidsoprindelser (ensemblegennemsnit). Spredningsfunktionen er Fouriertransformationen i tid af den mellemliggende spredningsfunktion I(q, t), der kan ses som Fouriertransformationen i rummet af van Hove-korrelationsfunktionen vist ved Eq (2):
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
Hvor ρ(r,t) er sandsynlighedstætheden for at finde et atom i position r og tid t 13.
For en fickiansk diffusionsproces resulterer selvdiffusionsfunktionen (se Eq (3)) efter en dobbelt Fourier-transformation i en spredningsfunktion bestående af en Lorentzian med linjebredde givet ved γ = Dq2.
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq10.jpg" style="margin: auto;"> (3)
Mere sofistikerede modeller blev udviklet og fundet nyttige, såsom springdiffusionsmodellen af Singwi og Sjölander til ps-ns interne proteindynamik14 eller rotationsmodellen af Sears til hydreringsvand15,16,17.
På neutron backscattering (NBS) instrumentet IN16B 8,9 ved ILL, Grenoble, Frankrig (supplerende figur S1), består en opsætning, der almindeligvis anvendes med proteiner, af Si 111-krystaller til analysatorerne med et Doppler-drev til tuning af den indkommende bølgelængde (supplerende figur S2A), hvilket giver adgang til momentumoverførselsområdet ~ 0,2 Å-1 < q < ~ 2 Å-1 og energioverførselsområdet på -30 μeV < <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> < 30 μeV - svarende til tidsskalaer fra nogle få ps til nogle få ns og afstande på nogle få Å. Derudover giver IN16B mulighed for at udføre elastiske og uelastiske fastvinduesscanninger (E/IFWS)10, som omfatter dataindsamling ved en fast energioverførsel. Da fluxen er begrænset, når man arbejder med neutroner, tillader E/IFWS maksimering af fluxen for en energioverførsel, hvilket reducerer den anskaffelsestid, der er nødvendig for at opnå et tilfredsstillende signal-støj-forhold. En nyere mulighed er backscattering og time-of-flight spektrometer (BATS) mode11, som muliggør måling af en lang række energioverførsler (f.eks. -150 μeV < < <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> 150 μeV) med en højere flux end med Doppler-drevet, men på bekostning af en lavere energiopløsning (supplerende figur S2B).
En vigtig egenskab ved neutronspredning er, at det usammenhængende tværsnit σinc har en 40 gange højere værdi for hydrogen end for deuterium og er ubetydelig for andre grundstoffer, der almindeligvis findes i biologiske prøver. Derfor kan dynamikken af proteiner i et flydende miljø studeres ved hjælp af en deutereret buffer, og pulvertilstanden muliggør undersøgelse af enten proteinets indre dynamik med hydrogeneret proteinpulver hydreret med D 2 Oeller undersøgelsen af hydreringsvand til perdeutereret proteinpulver hydreret med H2O. I flydende tilstand tillader neutron backscattering typisk samtidig adgang til massecentrets selvdiffusion af proteiner (Fickian-type diffusion) og deres interne dynamik. Sidstnævnte er rygrads- og sidekædebevægelser, der normalt beskrives af den såkaldte springdiffusionsmodel eller andre 3,18. I hydrogeneret proteinpulver er proteindiffusionen fraværende, og kun intern dynamik skal modelleres. For hydreringsvand præsenterer bidragene fra translationelle og rotationsbevægelser af vandmolekyler en anden afhængighed af momentumoverførslen q, hvilket muliggør deres sondring i dataanalyseprocessen17.
Dette papir illustrerer neutron backscattering metoden med undersøgelsen af proteiner, der viste sig at være i stand til at udfolde sig, aggregere i en kanonisk form bestående af stakke af β-strenge - det såkaldte cross-β mønster 19,20 - og danne aflange fibre. Dette er den såkaldte amyloidaggregering, som er grundigt undersøgt på grund af dens centrale rolle i neurodegenerative lidelser som Alzheimers eller Parkinsons sygdomme21,22. Undersøgelsen af amyloidproteinerne er også motiveret af den funktionelle rolle, de kan spille 23,24 eller deres store potentiale for udvikling af nye biomaterialer25. De fysisk-kemiske determinanter for amyloidaggregeringen forbliver uklare, og der findes ingen generel teori om amyloidaggregering på trods af enorme fremskridt i de seneste år21,26.
Amyloidaggregering indebærer ændringer i proteinstruktur og stabilitet med tiden, hvis undersøgelse naturligt indebærer dynamik, knyttet til proteinkonformationsstabilitet, proteinfunktion og proteinenergilandskab27. Dynamik er direkte knyttet til stabiliteten af en bestemt tilstand gennem det entropiske bidrag til de hurtigste bevægelser28, og proteinfunktionen kan opretholdes af bevægelser på forskellige tidsskalaer fra sub-ps for lysfølsomme proteiner29 til ms for domænebevægelser, hvilket kan lettes af picosekund-nanosekund dynamik30.
To eksempler på anvendelse af neutron backscattering spektroskopi til at studere amyloidproteiner vil blive præsenteret, et i flydende tilstand for at studere proteindynamik og et i hydratiseret pulvertilstand for at studere hydreringsvanddynamik. Det første eksempel vedrører aggregering af lysozym i μm-store kugler (kaldet partikler) efterfulgt i realtid5, og det andet en sammenligning af vanddynamik i indfødte og aggregerede tilstande af det humane protein tau31.
Lysozym er et enzym involveret i immunforsvaret og består af 129 aminosyrerester. Lysozym kan danne partikler i deutereret buffer ved pD på 10,5 og ved en temperatur på 90 °C. Med neutronspredning viste vi, at tidsudviklingen af lysozyms center-of-mass diffusionskoefficient følger den enkelte eksponentielle kinetik af thioflavin T-fluorescens (en fluorescerende sonde, der bruges til at overvåge dannelsen af amyloid cross-β mønstre32), hvilket indikerer, at formationspartikeloverbygningerne og tvær-β mønstre forekommer i et enkelt trin med samme hastighed. Desuden forblev den interne dynamik konstant gennem hele aggregeringsprocessen, hvilket kan forklares enten ved en hurtig konformationsændring, der ikke kan observeres på NBS-instrumenter, eller ved fraværet af signifikant ændring i proteinintern energi ved aggregering.
Det humane protein tau er et iboende forstyrret protein (IDP) bestående af 441 aminosyrer til den såkaldte 2N4R-isoform, som især er involveret i Alzheimers sygdom33. Ved hjælp af neutron backscattering på pulvere af perdeutereret protein tau viste vi, at hydreringsvanddynamikken øges i fibertilstanden, med en højere population af vandmolekyler, der gennemgår translationelle bevægelser. Resultatet tyder på, at en stigning i hydreringsvandentropi kan drive amyloidflimmer af tau.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum sample holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, &#8805;99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td> 
			543047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D, 99.9%)</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>DLM-4DR-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning high-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.5901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 75871-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator plate, 140 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>00470.G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nPDyn</td>
			<td></td>
			<td>v3.x</td>
			<td>see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>92641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 0.5-10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 100-1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 20-200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-0206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>372072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water

Neutronspredning giver mulighed for at undersøge dynamikken i prøver for en bred vifte af energier på en ikke-destruktiv måde og uden anden mærkning end deuterium. Især registrerer neutron backscattering spektroskopi spredningssignalerne ved flere spredningsvinkler samtidigt og er velegnet til at studere dynamikken i biologiske systemer på ps-ns tidsskalaen. Ved at anvende D2O- og muligvis deutererede bufferkomponenter muliggør metoden overvågning af både massecenterdiffusion og rygrads- og sidekædebevægelser (intern dynamik) af proteiner i flydende tilstand.
Derudover kan hydreringsvanddynamikken studeres ved at anvende pulvere af perdeutererede proteiner hydreret medH2O. Dette papir præsenterer arbejdsgangen anvendt på instrumentet IN16B på Institut Laue-Langevin (ILL) for at undersøge protein- og hydreringsvanddynamik. Fremstillingen af opløsningsprøver og hydratiserede proteinpulverprøver ved hjælp af dampudveksling forklares. Dataanalyseproceduren for både protein- og hydreringsvanddynamik er beskrevet for forskellige typer datasæt (kvasielastiske spektre eller scanninger med fast vindue), der kan opnås på et neutronbackscattering-spektrometer.
Metoden illustreres med to studier med amyloidproteiner. Aggregeringen af lysozym i sfæriske aggregater i μm-størrelse - betegnet partikler - er vist at forekomme i en ettrinsproces på rum- og tidsintervallet undersøgt på IN16B, mens den interne dynamik forbliver uændret. Endvidere blev dynamikken i hydreringsvand af tau undersøgt på hydratiserede pulvere af perdeutereret protein. Det er vist, at translationelle bevægelser af vand aktiveres ved dannelsen af amyloidfibre. Endelig diskuteres kritiske trin i protokollen om, hvordan neutronspredning er placeret med hensyn til studiet af dynamik med hensyn til andre eksperimentelle biofysiske metoder.

Aggregeringen af lysozym i partikler blev udført ved 90 °C med en proteinkoncentration på 50 mg/ml i en deutereret buffer (0,1 M NaCl ved pD 10,5). Dannelsen af partikler udløses af temperaturstigningen til 90 °C og sker inden for 6 timer (supplerende figur S8). Dataindsamlingen blev udført på IN16B, som beskrevet i protokollen ovenfor (data er permanent kurateret af ILL og tilgængelige på http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).
Et QENS-spektrum blev erhvervet v...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water at JoVE.com

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Neutron backscattering spektroskopi giver en ikke-destruktiv og etiketfri adgang til ps-ns dynamikken i proteiner og deres hydreringsvand. Arbejdsprocessen præsenteres med to undersøgelser af amyloidproteiner: på lysozyms tidsopløste dynamik under aggregering og på hydreringsvanddynamikken i tau ved fiberdannelse.

Neutronspektroskopi med høj opløsning til undersøgelse af picosekund-nanosekunddynamik af proteiner og hydreringsvand

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Neutron backscatterings måler global diffusion og intern dynamik af proteiner og hydreringsvand uden strålingsskader. Neutronspektroskopi har samtidig adgang til rumlige og tidsmæssige korrelationer på molekylært niveau. I blødt stof og biologiske materialer er det særligt interessant at få indirekte information om lokal orden på disse langtrækkende lidelsessystemer.Så neutron backscattering kan bruges til at studere dynamik i biologi, kemi eller materiel forstand. Et andet stærkt felt er energi med undersøgelser af f.eks. batterier og brændselsceller. Neutron backscattering er blevet brugt med succes til at studere den molekylære dynamik af proteiner involveret i neurodegenerative sygdomme som Alzheimers og Parkinsons.De opnåede resultater hjælper os med bedre at forstå de molekylære kendetegn ved disse patologier og kan bane vejen for at udvikle bedre diagnostik. For at forberede prøveholderen skal du starte med grundigt at rengøre en flad aluminiumsprøveholder og dens indiumtrådforsegling og skruer med vand efterfulgt af ethanol og derefter lade den tørre. De forskellige dele af prøveholderen, herunder bund, låg og indiumtråd, vejes separat på en præcisionsvægt.Anbring den ene millimeter indiumtrådforsegling i rillen på den nederste del af prøveholderen, og efterlad en lille overlapning, hvor de to ender samles. Der tilsættes ca. 100 mg frysetørret protein, således at det fylder den indre overflade af den nederste del af prøveholderen. Derefter anbringes prøveholderen i en ekssikkator med en petriskål indeholdende fosforpentoxidpulver i 24 timer for at tørre proteinpulveret helt.Den tørrede nederste del af prøveholderen indeholdende indiumforseglingen og det tørrede pulver afvejes for at nå frem til massen af den tørrede prøve. Fjern fosforpentoxid fra ekssikkatoren og læg en petriskål med deuteriumoxid samt prøven indeni for at hydrere pulveret. Gentag tørringen og hydreringen tre gange for fuldstændig brint til deuteriumudveksling.Mål pulvermassen regelmæssigt for at kontrollere hydreringsniveauet, og når hydreringen er lidt over det ønskede niveau, skal du vente på, at massen falder langsomt. Når den ønskede hydrering er opnået, skal du hurtigt sætte låget på den nederste del og lukke prøveholderen først med fire skruer for at stoppe dampudvekslingen. Placer og stram alle de resterende skruer, indtil der ikke er noget synligt mellemrum mellem bunddelen og låget.Vej den forseglede prøveholder for at kontrollere for eventuelt hydreringstab via lækager efter neutroneksperimentet. For at forberede væsketilstandsprøven opløses proteinet i den deutererede buffer. Brug vand til at bestemme den passende mængde væske, der skal lægges i prøveholderen.Før du håndterer noget materiale, skal du sikre dig, at den ioniserende strålingsdosis er mindre end 100 mikrosievert i timen. Tør derefter prøvestiften grundigt, og fjern eventuel tidligere prøve. Placer prøven på prøvepinden, kontroller for korrekt centrering i forhold til strålecentret, og sæt prøvepinden i kryoovnen.For at hente data i Nomad skal du gå til udførelsesfanen og trække og slippe en ovnkryostatcontroller i startområdet. Indstil temperaturen til 200 Kelvin. Brug hurtig tilstand og en timeout på 30 minutter, så temperaturen har tid til at stabilisere sig.Klik på opdateringsikonet for at køre temperaturrampen i baggrunden for dataindsamling under temperaturfaldet. Træk og slip IN16 Doppler-indstillingscontrolleren i startområdet. Indstil hastighedsprofilen til nøjagtig hastighed, indstillet til maks. delta E, energiforskydningen til 0,00 mikroelektronvolt og antallet af kanaler til 128 for at opnå en elastisk fast vinduesscanningskonfiguration.Træk og slip en tællecontroller ind i startområdet, udfyld undertekstfeltet med et navn, der gør det nemt at identificere dataene, og indstil scanninger på 30 sekunder med 60 gentagelser. Træk og slip derefter IN16 Doppler-indstillingscontrolleren i startområdet. Indstil hastighedsprofilen til at signere, indstil efter til hastighed med en værdi på 4,5 meter pr. sekund og antallet af kanaler til 2048 for at opnå en kvasielastisk neutronspredningskonfiguration.Træk og slip en tællecontroller, og udfyld undertekstfeltet med et navn, der gør det nemt at identificere dataene. Indstil scanninger på 30 minutter med fire gentagelser. For temperaturrampen skal du trække og slippe en ovnkryostatregulator, indstille temperaturen til 310 Kelvin og indstille rampen til indstillingspunkt med et delta på 0,05 Kelvin i seks sekunder.Brug en timeout på 200 minutter. Brug en for løkke med 65 gentagelser. Indvendigt skal du indsætte en IN16 doppler-indstillingscontroller, efterfulgt af tællecontrolleren og indstille en enkelt scanning på 30 sekunder.Indsæt derefter IN16 Doppler-indstillinger som beskrevet tidligere, men ved hjælp af en energiforskydning på 1,5 mikroelektronvolt og 1024 kanaler. Indsæt derefter tællecontrolleren, og indstil en enkelt scanning på tre minutter. For at opnå den sidste kvasielastiske neutronspredning på 312 Kelvin skal du trække og slippe IN16 Doppler-indstillingerne og tællecontrollerne, der er konfigureret som tidligere vist.Tryk derefter på startknappen for at køre scriptet. De lysosomelastiske og uelastiske faste vinduesscanninger viste en stigning i signalet ved lav momentumoverførsel og lav energioverførsel, mens signalet ved høj energioverførsel og lav momentumoverførsel faldt. Det oprindelige centrum for massediffusionskoefficienten var 15 angstrom kvadreret pr. Nanosekund, som derefter faldt eksponentielt over tid.Ved temperaturer højere end 220 Kelvin var hydreringsvandet omkring taufibrene betydeligt mere mobilt end omkring tau-monomererne. Fraktionen af vandmolekyler, der gennemgår translationel bevægelse, og både vandmolekylernes translations- og rotationsdiffusionskoefficienter blev øget omkring fibre. Proteinkoncentrationen bør være 2000 mg pr. ml eller mindst 20 mg pr. ml for proteinerede proteiner på grund af neutronrygspredningsbegrænsninger fra neutronflux eller prøveholderbufferbaggrund.Neutron backscattering er for nylig blevet anvendt, for eksempel for at forstå, hvordan vand, som er de naturlige miljøproteiner, fuldt ud kan erstattes af en syntetisk polymer til bioteknologisk anvendelse som for eksempel lægemiddelafgivelse.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for Identifikation af flere fosforyleringer af Intrinsically Disordered Proteiner

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

High-resolution single particle analyse fra elektronkryo-mikroskopi billeder ved hjælp af SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering af proteiner for enkelt molekyle kraft spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Måling af interaktioner af kugleformede og fintrådede proteiner af Kernemagnetisk resonans-spektroskopi (NMR) og individuel Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruger i Vitro fluorescens resonans energioverførsel at studere dynamikken i proteinkomplekser på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Complexome-profilering med høj opløsning ved Cryoslicing BN-MS-analyse

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

En integreret Raman spektroskopi og massespektrometri platform til at studere enkelt-celle stof optagelse, metabolisme, og effekter

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tværgående 2000 af ældre ris(Oryza sativa L.) Kerner til scanning elektronmikroskopi imaging ved hjælp af pipette tips som immobilisering Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Dual-Color Fluorescens Krydskorrelation Spektroskopi til undersøgelse protein-protein interaktion og protein dynamik i levende celler

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

CD-spektroskopi til undersøgelse af DNA-proteininteraktioner

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...