Name: high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water
Uploaded: 2022-04-28T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water at JoVE.com

De auteurs zijn Michaela Zamponi van het Jülich Centre for Neutron Science van het Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Duitsland, dankbaar voor een deel van de neutronenverstrooiingsexperimenten die zijn uitgevoerd op het instrument SPHERES. Dit werk heeft geprofiteerd van de activiteiten van het Deuteration Laboratory (DLAB) consortium gefinancierd door de Europese Unie onder contracten HPRI-2001-50065 en RII3-CT-2003-505925, en van de UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) gefinancierde activiteiten binnen het Institut Laue Langevin EMBL DLAB onder subsidies GR/R99393/01 en EP/C015452/1. Steun van de Europese Commissie in het kader van het 7e kaderprogramma via de kernactiviteit: versterking van de Europese onderzoeksruimte, onderzoeksinfrastructuren wordt erkend [contract 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot en Christian Beck bedanken het federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF, subsidienummer 05K19VTB) voor de financiering van hun postdoctorale beurzen.

1. Bereid de gedeutereerde buffer voor eiwitten in vloeibare toestand voor
<ol><li>Los alle componenten van de buffer op in zuiver D2O.</li>
	<li>Als de pH-elektrode is gekalibreerd in H2O, past u de pD aan volgens de formule pD = pH + 0,4 met NaOD of DCl34. OPMERKING: Het gebruik van D 2 Oin plaats van H2O kan de oplosbaarheid van eiwitten beïnvloeden en de buffercondities moeten mogelijk worden aangepast (bijvoorbeeld door een kl...

Neutronenspectroscopie is de enige methode waarmee de ensemblegemiddelde ps-ns-dynamiek van eiwitmonsters kan worden onderzocht, ongeacht de grootte van het eiwit of de complexiteit van de oplossing wanneer deuteratie wordt gebruikt6. Door zelfdiffusie van eiwitassemblages in oplossing te onderzoeken, kan de hydrodynamische grootte van dergelijke assemblages ondubbelzinnig worden bepaald. Niettemin wordt de methode gewoonlijk beperkt door de lage neutronenflux, wat lange acquisitietijden impliceer...

Het neutron is een ladingloos en massief deeltje dat in de loop der jaren met succes is gebruikt om monsters te onderzoeken op verschillende gebieden, van fundamentele fysica tot biologie1. Voor biologische toepassingen worden neutronenverstrooiing met een kleine hoek, inelastische neutronenverstrooiing en neutronenkristallografie en reflectometrie op grote schaal gebruikt 2,3,4. Inelastische neutronenverstrooiing biedt een ensemblegemiddelde meting van de dynamiek zonder dat specifieke etikettering per se nodig is, en een signaalkwaliteit die niet afhankelijk is van de grootte of het eiwit5. De meting kan worden uitgevoerd met behulp van een zeer complexe omgeving voor het onderzochte eiwit dat het intracellulaire medium nabootst, zoals een gedeutereerd bacterieel lysaat of zelfs in vivo 3,6,7. Verschillende experimentele opstellingen kunnen worden gebruikt om de dynamica te bestuderen, namelijk i) time-of-flight-giving access to sub-ps-ps dynamics, ii) backscattering-giving access to ps-ns dynamics, and iii) spin-echo-giving access to dynamics from ns to hundreds of ns. Neutronenverstrooiing maakt gebruik van de wet van Bragg 2d sinθ = nλ, waarbij d de afstand is tussen vlakken in een kristal, θ de verstrooiingshoek, n de verstrooiingsvolgorde en λ de golflengte. Het gebruik van kristallen voor backscattering naar de detectoren zorgt voor het bereiken van een hoge resolutie in energie, meestal ~ 0,8 μeV. Om de energie-uitwisseling te meten, wordt ofwel een Doppler-aandrijving met een kristal in backscattering gebruikt om de inkomende neutronengolflengte 8,9,10 te definiëren en af te stemmen (figuur 1), of een time-of-flight-opstelling kan worden gebruikt ten koste van een afname van de energieresolutie 11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63664/63664fig01.jpg"> Figuur 1: Schets van een neutronen-backscattering spectrometer met een Doppler-aandrijving. De inkomende bundel raakt de phase space transformation (PST) chopper42, waardoor de flux op de monsterpositie toeneemt. Vervolgens wordt het teruggekaatst naar het monster door de Doppler-aandrijving, die een energie E1 (cyaanpijl) selecteert. De neutronen worden vervolgens verstrooid door het monster (met verschillende energieën vertegenwoordigd door de kleur van de pijlen) en de analyzers, gemaakt van Si 111-kristallen, zullen alleen neutronen met een specifieke energie E0 terugverstrooien (rood gekleurde pijlen hier). Daarom wordt de momentumoverdracht q verkregen uit de gedetecteerde positie van het neutron op de detectorarray en wordt de energieoverdracht verkregen uit het verschil E1- E0. De verwachte vluchttijd voor de neutronenpuls die door de PST wordt geproduceerd, wordt gebruikt om het signaal van de neutronen die rechtstreeks naar de detectorbuizen zijn verspreid, weg te gooien. Afkorting: PST = phase space transformation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63664/63664fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Voor backscatteringspectroscopie is de belangrijkste bijdrage aan het signaal van waterstofprotonrijke monsters, zoals eiwitten, afkomstig van onsamenhangende verstrooiing, waarvoor de verstrooiingsintensiteit Sinc(q, ω) wordt weergegeven door Eq (1)12
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)
Waarbij σinc de onsamenhangende doorsnede van het beschouwde element is, is k' de norm van de verstrooide golfvector, k de norm van de inkomende golfvector, q (= k - k') de impulsoverdracht, r j(t) de positievector van atoom j op tijdstip t, en ω de frequentie die overeenkomt met de energieoverdracht tussen het inkomende neutron en het systeem. De hoekige haakjes geven het ensemblegemiddelde aan. Vandaar dat onsamenhangende verstrooiing de ensemble-gemiddelde zelfcorrelatie van één deeltje van atoomposities met de tijd onderzoekt en de zelfdynamiek gemiddeld geeft over alle atomen in het systeem en verschillende tijdsoorsprongen (ensemblegemiddelde). De verstrooiingsfunctie is de Fouriertransformatie in de tijd van de tussenliggende verstrooiingsfunctie I(q, t), die kan worden gezien als de Fouriertransformatie in de ruimte van de van Hove-correlatiefunctie weergegeven door Eq (2):
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
Waarbij ρ(r,t) de kansdichtheid is van het vinden van een atoom op positie r en tijd t 13.
Voor een Fickisch diffusieproces resulteert de zelfdiffusiefunctie (zie Eq (3)) na een dubbele Fouriertransformatie in een verstrooiingsfunctie bestaande uit een Lorentzian met een lijnbreedte gegeven door γ = Dq2.
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq10.jpg" style="margin: auto;"> (3)
Meer geavanceerde modellen werden ontwikkeld en nuttig bevonden, zoals het sprongdiffusiemodel van Singwi en Sjölander voor ps-ns interne eiwitdynamica14 of het rotatiemodel van Sears voor hydratatiewater15,16,17.
Op het neutron backscattering (NBS) instrument IN16B 8,9 bij de IBL, Grenoble, Frankrijk (aanvullende figuur S1), bestaat een opstelling die vaak wordt gebruikt met eiwitten uit Si 111-kristallen voor de analyzers met een doppleraandrijving voor het afstemmen van de inkomende golflengte (aanvullende figuur S2A), waardoor toegang wordt gegeven tot het momentumoverdrachtsbereik ~ 0,2 Å-1 < q < ~ 2 Å-1 en energieoverdrachtsbereik van -30 μeV < <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> < 30 μeV-overeenkomend met tijdschalen variërend van enkele ps tot enkele ns en afstanden van enkele Å. Daarnaast biedt IN16B de mogelijkheid om elastische en inelastische fixed-window scans (E/IFWS)10 uit te voeren, waaronder data-acquisitie bij een vaste energieoverdracht. Omdat de flux beperkt is bij het werken met neutronen, maakt E/IFWS het mogelijk om de flux voor één energieoverdracht te maximaliseren, waardoor de acquisitietijd die nodig is om een bevredigende signaal-ruisverhouding te verkrijgen, wordt verkort. Een recentere optie is de backscattering en time-of-flight spectrometer (BATS) -modus11, waarmee een breed scala aan energieoverdrachten kan worden gemeten (bijv. -150 μeV < < <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> 150 μeV), met een hogere flux dan met de Doppler-aandrijving, maar ten koste van een lagere energieresolutie (aanvullende figuur S2B).
Een belangrijke eigenschap van neutronenverstrooiing is dat de onsamenhangende doorsnede σinc een 40 keer hogere waarde heeft voor waterstof dan voor deuterium en verwaarloosbaar is voor andere elementen die vaak in biologische monsters worden aangetroffen. Daarom kan de dynamiek van eiwitten in een vloeibare omgeving worden bestudeerd met behulp van een gedeutereerde buffer, en de poedertoestand maakt de studie mogelijk van ofwel eiwitinterne dynamiek met gehydrogeneerd eiwitpoeder gehydrateerd met D 2 O, of de studie van hydratatiewater voor geperdeutereerd eiwitpoeder gehydrateerdmet H2O. In vloeibare toestand maakt neutronenverstrooiing meestal gelijktijdige toegang mogelijk tot het massacentrum zelfdiffusie van eiwitten (Fickian-type diffusie) en hun interne dynamiek. De laatste zijn ruggengraat- en zijketenbewegingen die meestal worden beschreven door het zogenaamde sprongdiffusiemodel of andere 3,18. In gehydrogeneerde eiwitpoeders is de eiwitdiffusie afwezig en hoeft alleen de interne dynamiek te worden gemodelleerd. Voor hydratatiewater vertonen de bijdragen van translatie- en rotatiebewegingen van watermoleculen een andere afhankelijkheid van de momentumoverdracht q, wat hun onderscheid in het data-analyseproces mogelijk maakt17.
Dit artikel illustreert de neutronen-backscatering-methode met de studie van eiwitten die zich bleken te kunnen ontvouwen, aggregeren tot een canonieke vorm bestaande uit stapels β-strengen - het zogenaamde cross-β-patroon19,20 - en langwerpige vezels vormen. Dit is de zogenaamde amyloïde aggregatie, die uitgebreid wordt bestudeerd vanwege zijn centrale rol bij neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer of Parkinson21,22. De studie van de amyloïde eiwitten wordt ook gemotiveerd door de functionele rol die ze kunnen spelen 23,24 of hun hoge potentieel voor de ontwikkeling van nieuwe biomaterialen25. De fysisch-chemische determinanten van de amyloïde aggregatie blijven onduidelijk en er is geen algemene theorie van amyloïde aggregatie beschikbaar, ondanks enorme vooruitgang in de afgelopen jaren21,26.
Amyloïde aggregatie impliceert veranderingen in eiwitstructuur en stabiliteit met de tijd, waarvan de studie van nature dynamiek impliceert, gekoppeld aan eiwitconformatiestabiliteit, eiwitfunctie en eiwitenergielandschap27. Dynamica is direct gekoppeld aan de stabiliteit van een specifieke toestand door de entropische bijdrage voor de snelste bewegingen28, en de eiwitfunctie kan worden ondersteund door bewegingen op verschillende tijdschalen van sub-ps voor lichtgevoelige eiwitten29 tot ms voor domeinbewegingen, die kunnen worden vergemakkelijkt door picoseconde-nanoseconde dynamica30.
Twee voorbeelden van het gebruik van neutronenbackscattering spectroscopie om amyloïde eiwitten te bestuderen zullen worden gepresenteerd, één in vloeibare toestand om eiwitdynamica te bestuderen en één in gehydrateerde poedertoestand om hydratatiewaterdynamica te bestuderen. Het eerste voorbeeld betreft de aggregatie van lysozym in bolletjes ter grootte van μm (deeltjes genoemd) gevolgd in real time5, en het tweede een vergelijking van de waterdynamiek in inheemse en geaggregeerde toestanden van het menselijke eiwit tau31.
Lysozym is een enzym dat betrokken is bij de immuunafweer en bestaat uit 129 aminozuurresiduen. Lysozym kan deeltjes vormen in gedeutereerde buffer bij pD van 10,5 en bij een temperatuur van 90 °C. Met neutronenverstrooiing toonden we aan dat de tijdsevolutie van de diffusiecoëfficiënt van het massamiddelpunt van lysozym de enkele exponentiële kinetiek van thioflavine-T-fluorescentie volgt (een fluorescerende sonde die wordt gebruikt om de vorming van amyloïde cross-β-patronen32 te volgen, wat aangeeft dat de vorming van deeltjessuperstructuren en kruis-β patronen in één stap met dezelfde snelheid plaatsvinden. Bovendien bleef de interne dynamiek constant gedurende het aggregatieproces, wat kan worden verklaard door een snelle conformatieverandering die niet kan worden waargenomen op NBS-instrumenten, of door de afwezigheid van significante verandering in interne eiwitenergie bij aggregatie.
Het menselijke eiwit tau is een intrinsiek ongeordend eiwit (IDP) bestaande uit 441 aminozuren voor de zogenaamde 2N4R-isovorm, die met name betrokken is bij de ziekte van Alzheimer33. Met behulp van neutronenverstrooiing op poeders van geperdeutereerd eiwit tau, toonden we aan dat de hydratatiewaterdynamiek wordt verhoogd in de vezeltoestand, met een hogere populatie watermoleculen die translationele bewegingen ondergaan. Het resultaat suggereert dat een toename van hydratatiewaterentropie de amyloïde fibrillatie van tau zou kunnen veroorzaken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum sample holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, &#8805;99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td> 
			543047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D, 99.9%)</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>DLM-4DR-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning high-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.5901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 75871-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator plate, 140 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>00470.G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nPDyn</td>
			<td></td>
			<td>v3.x</td>
			<td>see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>92641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 0.5-10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 100-1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 20-200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-0206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>372072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water

Neutronenverstrooiing biedt de mogelijkheid om de dynamiek in monsters te onderzoeken voor een breed scala aan energieën op een niet-destructieve manier en zonder andere etikettering dan deuterium. Met name neutronen-backscatteringsspectroscopie registreert de verstrooiingssignalen onder meerdere verstrooiingshoeken tegelijk en is zeer geschikt om de dynamiek van biologische systemen op de ps-ns-tijdschaal te bestuderen. Door gebruik te maken van D2O- en mogelijk gedeutereerde buffercomponenten - maakt de methode het mogelijk om zowel het centrum van massadiffusie als backbone- en zijketenbewegingen (interne dynamiek) van eiwitten in vloeibare toestand te monitoren.
Bovendien kan hydratatiewaterdynamiek worden bestudeerd door poeders van geperdeutereerde eiwitten gehydrateerd met H2O te gebruiken. Dit artikel presenteert de workflow die wordt gebruikt op het instrument IN16B van het Institut Laue-Langevin (ILL) om de dynamiek van eiwit- en hydratatiewater te onderzoeken. De bereiding van oplossingsmonsters en gehydrateerde eiwitpoedermonsters met behulp van dampuitwisseling wordt uitgelegd. De data-analyseprocedure voor zowel eiwit- als hydratatiewaterdynamica wordt beschreven voor verschillende soorten datasets (quasi-elastische spectra of fixed-window scans) die kunnen worden verkregen op een neutronenbackscattering spectrometer.
De methode wordt geïllustreerd met twee studies met amyloïde eiwitten. De aggregatie van lysozym in bolvormige aggregaten ter grootte van μm - aangeduid met deeltjes - blijkt plaats te vinden in een proces van één stap op het ruimte- en tijdsbereik dat op IN16B wordt onderzocht, terwijl de interne dynamiek ongewijzigd blijft. Verder werd de dynamiek van hydratatiewater van tau bestudeerd op gehydrateerde poeders van geperdeuteerd eiwit. Het is aangetoond dat translationele bewegingen van water worden geactiveerd bij de vorming van amyloïde vezels. Ten slotte worden kritische stappen in het protocol besproken over hoe neutronenverstrooiing is gepositioneerd met betrekking tot de studie van dynamica ten opzichte van andere experimentele biofysische methoden.

De aggregatie van lysozym tot deeltjes werd uitgevoerd bij 90 °C met een eiwitconcentratie van 50 mg/ml in een gedeutereerde buffer (0,1 M NaCl bij pD 10,5). De vorming van deeltjes wordt veroorzaakt door de temperatuurstijging tot 90 °C en vindt plaats binnen 6 uur (aanvullende figuur S8). De data-acquisitie werd uitgevoerd op IN16B, zoals beschreven in het bovenstaande protocol (gegevens worden permanent beheerd door de IBL en zijn toegankelijk op http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).
<p ...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water at JoVE.com

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Neutronenbackscattering spectroscopie biedt een niet-destructieve en labelvrije toegang tot de ps-ns dynamiek van eiwitten en hun hydratatiewater. De workflow wordt gepresenteerd met twee studies over amyloïde eiwitten: over de tijd-opgeloste dynamiek van lysozym tijdens aggregatie en over de hydratatiewaterdynamiek van tau op vezelvorming.

Neutronenspectroscopie met hoge resolutie om picoseconde-nanosecondedynamiek van eiwitten en hydratatiewater te bestuderen

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Neutronenbackscatterings meten de globale diffusie en interne dynamiek van eiwitten en hydratatiewater zonder stralingsschade. Neutronenspectroscopie heeft tegelijkertijd toegang tot ruimtelijke en tijdscorrelaties op moleculair niveau. In zachte materie en biologische materialen is het bijzonder interessant om indirecte informatie te verkrijgen over de lokale orde op deze langeafstandsstoornissystemen.Dus neutronenverstrooiing kan worden gebruikt om dynamica in biologie, scheikunde of materiële zin te bestuderen. Een ander sterk veld is energie, met studies over bijvoorbeeld batterijen en brandstofcellen. Neutronenverstrooiing is met succes gebruikt om de moleculaire dynamiek te bestuderen van eiwitten die betrokken zijn bij neurodegeneratieve ziekten zoals Alzheimer en Parkinson.De verkregen resultaten helpen ons de moleculaire kenmerken van deze pathologieën beter te begrijpen en kunnen de weg vrijmaken voor het ontwikkelen van betere diagnostiek. Om de monsterhouder voor te bereiden, begint u met het grondig reinigen van een platte aluminium monsterhouder en de indiumdraadafdichting en schroeven met water, gevolgd door ethanol en laat u deze vervolgens drogen. Weeg de verschillende delen van de monsterhouder, inclusief de bodem, het deksel en de indiumdraad, afzonderlijk af op een precisiebalans.Plaats de indiumdraadafdichting van één millimeter in de groef van het onderste deel van de monsterhouder en laat een kleine overlap achter waar de twee uiteinden samenkomen. Voeg ongeveer 100 milligram gelyofiliseerd eiwit toe, zodat het het binnenoppervlak van het onderste deel van de monsterhouder vult. Plaats vervolgens de monsterhouder gedurende 24 uur in een exsiccator met een petrischaaltje met fosforpentoxidepoeder om het eiwitpoeder volledig te drogen.Weeg het gedroogde onderste deel van de monsterhouder met het indiumzegel en het gedroogde poeder af om de massa van het gedroogde monster te verkrijgen. Verwijder de fosforpentoxide uit de exsiccator en plaats een petrischaaltje met deuteriumoxide en het monster erin om het poeder te hydrateren. Herhaal het drogen en hydrateren drie keer voor volledige uitwisseling van waterstof naar deuterium.Meet de poedermassa regelmatig om het hydratatieniveau te controleren en wanneer de hydratatie iets boven het gewenste niveau ligt, wacht dan tot de massa langzaam afneemt. Zodra de gewenste hydratatie is verkregen, plaatst u snel het deksel op het onderste deel en sluit u de monsterhouder eerst met vier schroeven om de dampuitwisseling te stoppen. Plaats en draai alle resterende schroeven vast totdat er geen opening zichtbaar is tussen het onderste deel en het deksel.Weeg de verzegelde monsterhouder af om te controleren op mogelijk hydratatieverlies via lekken na het neutronenexperiment. Om het vloeibare toestandsmonster te bereiden, lost u het eiwit op in de gedeutereerde buffer. Bepaal met behulp van water het juiste volume vloeistof dat in de monsterhouder moet worden gedaan.Voordat u een materiaal hanteert, moet u ervoor zorgen dat de ioniserende stralingsdosis minder dan 100 microsievert per uur is. Droog vervolgens de monsterstok grondig af en verwijder eventuele eerdere monsters. Plaats het monster op de monsterstaaf, controleer op de juiste centrering ten opzichte van het middelpunt van de bundel en steek de monsterstok in de cryooven.Om gegevens in Nomad te verkrijgen, gaat u naar het tabblad Uitvoering en sleept u een cryostaatcontroller voor ovens naar het lanceerplatform. Stel de temperatuur in op 200 Kelvin. Gebruik de snelle modus en een time-out van 30 minuten zodat de temperatuur de tijd heeft om te stabiliseren.Klik op het opfrispictogram om de temperatuurstijging op de achtergrond uit te voeren voor gegevensverzameling tijdens de temperatuurdaling. Sleep de IN16 Doppler-instellingencontroller naar het launchpad. Stel het snelheidsprofiel in op nauwkeurige snelheid, de set door op max delta E, de energie-offset op 0,00 micro-elektronvolt en het aantal kanalen op 128 om een elastische vaste vensterscanconfiguratie te verkrijgen.Sleep een telcontroller naar het launchpad, vul het ondertitelveld met een naam waarmee de gegevens eenvoudig kunnen worden geïdentificeerd en stel scans van 30 seconden in met 60 herhalingen. Sleep vervolgens de IN16 Doppler-instellingencontroller naar het launchpad. Stel het snelheidsprofiel in om te ondertekenen, de ingestelde op snelheid met een waarde van 4,5 meter per seconde en het aantal kanalen op 2048 om een quasi-elastische neutronenverstrooiingsconfiguratie te verkrijgen.Sleep een telcontroller en vul het ondertitelveld met een naam waarmee de gegevens eenvoudig kunnen worden geïdentificeerd. Stel scans van 30 minuten in met vier herhalingen. Voor de temperatuurhelling sleept en laat u een oven-cryostaatcontroller vallen, stelt u de temperatuur in op 310 Kelvin en stelt u de oprit gedurende zes seconden in op het instelpunt met een delta van 0,05 Kelvin.Gebruik een time-out van 200 minuten. Gebruik een for-lus met 65 herhalingen. Plaats binnenin een IN16 doppler-instellingencontroller, gevolgd door de telcontroller en stel een enkele scan van 30 seconden in.Plaats vervolgens IN16 Doppler-instellingen zoals eerder beschreven, maar met een energie-offset van 1,5 micro-elektronvolt en 1024 kanalen. Plaats vervolgens de telcontroller en stel een enkele scan van drie minuten in. Om de laatste quasi-elastische neutronenverstrooiing van 312 Kelvin te verkrijgen, sleept u de IN16 Doppler-instellingen en telcontrollers die zijn geconfigureerd zoals eerder gedemonstreerd.Druk vervolgens op de startknop om het script uit te voeren. De lysosoomelastische en inelastische vaste vensterscans toonden een toename van het signaal bij lage momentumoverdracht en lage energieoverdracht, terwijl het signaal bij hoge energieoverdracht en lage momentumoverdracht afnam. Het oorspronkelijke centrum van de massadiffusiecoëfficiënt was 15 angstrom in het kwadraat per nanoseconde, die vervolgens exponentieel afnam in de loop van de tijd.Bij temperaturen hoger dan 220 Kelvin was het hydratatiewater rond de tauvezels aanzienlijk mobieler dan rond de tau-monomeren. De fractie van watermoleculen die een translationele beweging ondergingen en zowel de translatie- als rotatiediffusiecoëfficiënten van de watermoleculen werden rond vezels verhoogd. De eiwitconcentratie moet 2000 milligram per ml zijn of ten minste 20 milligram per ml voor geproteïniseerde eiwitten als gevolg van neutronenterugverstrooiingsbeperkingen door neutronenflux of bufferachtergrond van de monsterhouder.Neutronen backscattering is onlangs toegepast, bijvoorbeeld om te begrijpen hoe water, de natuurlijke milieu-eiwitten, volledig kan worden vervangen door een synthetisch polymeer voor biotechnologische toepassingen zoals bijvoorbeeld medicijnafgifte.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) en Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Hoge-resolutie Complexome profilering door Cryoslicing BN-MS analyse

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Een geïntegreerde Raman-spectroscopie en massaspectrometrie platform voor het bestuderen van de opname van één cel drug, metabolisme, en effecten

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Dwarsdoorsnede van rijpe rijst(Oryza sativa L.) Kernels voor scanning elektronenmicroscopie beeldvorming met behulp van pipet tips als immobilisatie ondersteuning

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

CD-spectroscopie om DNA-eiwitinteracties te bestuderen

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...