Name: high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water
Uploaded: 2022-04-28T13:10:00
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Die Autoren danken Michaela Zamponi vom Jülich Centre for Neutron Science am Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, für einen Teil der Neutronenstreuexperimente, die mit dem Instrument SPHERES durchgeführt wurden. Diese Arbeit profitierte von den Aktivitäten des Konsortiums Deuteration Laboratory (DLAB), das von der Europäischen Union im Rahmen der Verträge HPRI-2001-50065 und RII3-CT-2003-505925 finanziert wurde, sowie von den vom UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) finanzierten Aktivitäten innerhalb des Institut Laue Langevin EMBL DLAB im Rahmen der Zuschüsse GR/R99393/01 und EP/C015452/1. Die Unterstützung durch die Europäische Kommission im Rahmen des 7. Rahmenprogramms im Rahmen der Leitaktion zur Stärkung des Europäischen Forschungsraums und der Forschungsinfrastrukturen wird anerkannt [Vertrag 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot und Christian Beck danken dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF, Förderkennzeichen 05K19VTB) für die Förderung ihrer Postdoc-Stipendien.

1. Bereiten Sie den deuterierten Puffer für Proteine im flüssigen Zustand vor
<ol><li>Alle Bestandteile des Puffers werden in reinemD2Ogelöst.</li>
	<li>Wenn die pH-Elektrode inH2Okalibriert wurde, stellen Sie die pD nach der Formel pD = pH + 0,4 mit NaOD oder DCl34 ein. HINWEIS: Die Verwendung von D2O anstelle vonH2Okanndie Proteinlöslichkeit beeinträchtigen und die Pufferbedingungen müssen möglicherweise angepasst werden (z...

Die Neutronenspektroskopie ist die einzige Methode, die es ermöglicht, die ensemblegemittelte ps-ns-Dynamik von Proteinproben unabhängig von der Größe des Proteins oder der Komplexität der Lösung bei Verwendung der Deuterierung zu untersuchen6. Insbesondere durch die Untersuchung der Selbstdiffusion von Proteinanordnungen in Lösung kann die hydrodynamische Größe solcher Anordnungen eindeutig bestimmt werden. Nichtsdestotrotz ist die Methode in der Regel durch den geringen Neutronenfluss b...

Das Neutron ist ein ladungsloses und massereiches Teilchen, das im Laufe der Jahre erfolgreich zur Untersuchung von Proben in verschiedenen Bereichen von der Grundlagenphysik bis zur Biologieeingesetzt wurde 1. Für biologische Anwendungen werden Kleinwinkel-Neutronenstreuung, inelastische Neutronenstreuung sowie Neutronenkristallographie und Reflektometrie häufig eingesetzt 2,3,4. Die inelastische Neutronenstreuung ermöglicht eine ensemblegemittelte Messung der Dynamik, ohne dass eine spezifische Markierung an sich erforderlich ist, und eine Signalqualität, die nicht von der Größe oder dem Protein abhängt5. Die Messung kann in einer hochkomplexen Umgebung für das untersuchte Protein durchgeführt werden, die das intrazelluläre Medium nachahmt, wie z. B. ein deuteriertes bakterielles Lysat oder sogar in vivo 3,6,7. Verschiedene experimentelle Aufbauten können verwendet werden, um die Dynamik zu untersuchen, nämlich i) Flugzeit-gebender Zugang zu sub-ps-ps-Dynamik, ii) Rückstreuung-gebender Zugang zu ps-ns-Dynamik und iii) Spin-Echo-gebender Zugang zu Dynamik von ns bis zu Hunderten von ns. Die Neutronenrückstreuung nutzt das Braggsche Gesetz 2d sinθ = nλ, wobei d der Abstand zwischen Ebenen in einem Kristall, θ der Streuwinkel, n die Streuordnung und λ die Wellenlänge ist. Die Verwendung von Kristallen für die Rückstreuung zu den Detektoren ermöglicht es, eine hohe Energieauflösung von typischerweise ~0,8 μeV zu erreichen. Um den Energieaustausch zu messen, wird entweder ein Dopplerantrieb verwendet, der einen Kristall in der Rückstreuung trägt, um die einfallende Neutronenwellenlänge 8,9,10 zu definieren und einzustellen (Abbildung 1), oder es kann ein Time-of-Flight-Setup auf Kosten einer Verringerung der Energieauflösung 11 verwendet werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63664/63664fig01.jpg"> Abbildung 1: Skizze eines Neutronenrückstreuspektrometers mit Dopplerantrieb. Der einfallende Strahl trifft auf den Phasenraumtransformations-Chopper42 (PST), der den Fluss an der Probenposition erhöht. Es wird dann durch den Dopplerantrieb, der eine Energie E1 (cyanfarbener Pfeil) wählt, in Richtung der Probe zurückgestreut. Die Neutronen werden dann von der Probe gestreut (mit unterschiedlichen Energien, die durch die Farbe der Pfeile dargestellt werden) und die Analysatoren, die aus Si 111-Kristallen bestehen, streuen nur Neutronen mit einer spezifischen Energie E0 zurück (hier rote Pfeile). Daher wird der Impulstransfer q aus der detektierten Position des Neutrons auf dem Detektorarray und der Energietransfer aus der Differenz E1 - E0 erhalten. Die erwartete Flugzeit für den vom PST erzeugten Neutronenpuls wird verwendet, um das Signal der Neutronen zu verwerfen, die direkt in Richtung der Detektorröhren gestreut werden. Abkürzung: PST = Phasenraumtransformation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63664/63664fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Für die Rückstreuspektroskopie kommt der Hauptbeitrag zum Signal von protonenreichen Wasserstoffproben, wie z. B. Proteinen, aus der inkohärenten Streuung, für die die Streuintensität Sinc(q, ω) durch Gl (1)12 gezeigt wird
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)
Dabei ist σinc der inkohärente Wirkungsquerschnitt des betrachteten Elements, k' die Norm des gestreuten Wellenvektors, k die Norm des eingehenden Wellenvektors, q (= k - k') die Impulsübertragung, r j(t) der Ortsvektor des Atoms j zum Zeitpunkt t und ω die Frequenz, die dem Energietransfer zwischen dem einfallenden Neutron und dem System entspricht. Die eckigen Klammern bezeichnen den Ensembledurchschnitt. Die inkohärente Streuung untersucht daher die ensemblegemittelte Einzelteilchen-Selbstkorrelation der Atompositionen mit der Zeit und liefert die Selbstdynamik gemittelt über alle Atome im System und verschiedene Zeitursprünge (Ensemble-Mittelwert). Die Streufunktion ist die zeitliche Fourier-Transformation der intermediären Streufunktion I(q, t), die als Fourier-Transformation im Raum der van-Hove-Korrelationsfunktion angesehen werden kann, die durch Gl (2) gezeigt wird:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
Wobei ρ(r,t) die Wahrscheinlichkeitsdichte ist, ein Atom an der Position r und der Zeit t 13 zu finden.
Für einen Fickschen Diffusionsprozess ergibt sich die Selbstdiffusionsfunktion (siehe Gl (3)) nach einer doppelten Fourier-Transformation in einer Streufunktion, die aus einem Lorentz-Operator mit Linienbreite besteht, der durch γ = Dq2 gegeben ist.
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq10.jpg" style="margin: auto;"> (3)
Ausgefeiltere Modelle wurden entwickelt und für nützlich befunden, wie z.B. das Sprungdiffusionsmodell von Singwi und Sjölander für die interne ps-ns-Proteindynamik14 oder das Rotationsmodell von Sears für Hydratationswasser15,16,17.
Auf dem Neutronenrückstreuinstrument IN16B 8,9 am ILL in Grenoble, Frankreich (Supplemental Figure S1), besteht ein bei Proteinen üblicherweise verwendeter Aufbau aus Si 111-Kristallen für die Analysatoren mit einem Dopplerantrieb zur Abstimmung der eingehenden Wellenlänge (Supplemental Figure S2A), wodurch der Impulsübertragungsbereich ~0,2 Å-1 < q < ~2 Å-1 und der Energieübertragungsbereich von -30 μeV < <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> < 30 μeV, was Zeitskalen von wenigen ps bis einigen ns und Entfernungen von einigen Å entspricht. Darüber hinaus bietet IN16B die Möglichkeit, elastische und inelastische Fixed-Window-Scans (E/IFWS)10 durchzuführen, die die Datenerfassung bei einer festen Energieübertragung beinhalten. Da der Fluss bei der Arbeit mit Neutronen begrenzt ist, ermöglicht E/IFWS die Maximierung des Flusses für einen Energietransfer, wodurch die Erfassungszeit reduziert wird, die benötigt wird, um ein zufriedenstellendes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten. Eine neuere Option ist das Rückstreu- und Flugzeitspektrometer (BATS) Mode11, das die Messung eines breiten Bereichs von Energietransfers (z. B. -150 μeV < < <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> 150 μeV) mit einem höheren Fluss als mit dem Dopplerantrieb, jedoch auf Kosten einer geringeren Energieauflösung ermöglicht (ergänzende Abbildung S2B).
Eine wichtige Eigenschaft der Neutronenstreuung ist, dass der inkohärente Wirkungsquerschnitt σinc für Wasserstoff einen 40-mal höheren Wert als für Deuterium hat und für andere Elemente, die üblicherweise in biologischen Proben vorkommen, vernachlässigbar ist. Daher kann die Dynamik von Proteinen in einer flüssigen Umgebung unter Verwendung eines deuterierten Puffers untersucht werden, und der Pulverzustand ermöglicht die Untersuchung entweder der inneren Dynamik von Proteinen mit hydriertem Proteinpulver, das mit D2O hydratisiert ist, oder die Untersuchung von Hydratationswasser für perdeuteriertes Proteinpulver, das mitH2Ohydratisiert ist. Im flüssigen Zustand ermöglicht die Neutronenrückstreuung typischerweise den gleichzeitigen Zugriff auf die Selbstdiffusion des Massenschwerpunkts von Proteinen (Fickian-Typ-Diffusion) und deren interne Dynamik. Bei letzteren handelt es sich um Rückgrat- und Seitenkettenbewegungen, die in der Regel durch das sogenannte Sprungdiffusionsmodell oder andere beschrieben werden 3,18. In hydrierten Proteinpulvern fehlt die Proteindiffusion und es muss nur die interne Dynamik modelliert werden. Für Hydratationswasser weisen die Beiträge von Translations- und Rotationsbewegungen von Wassermolekülen eine andere Abhängigkeit vom Impulstransfer q auf, was ihre Unterscheidung im Datenanalyseprozess ermöglicht17.
Diese Arbeit veranschaulicht die Methode der Neutronenrückstreuung anhand der Untersuchung von Proteinen, die in der Lage sind, sich zu entfalten, zu einer kanonischen Form zu aggregieren, die aus Stapeln von β-Strängen besteht - dem sogenannten Kreuz-β-Muster19,20 - und längliche Fasern zu bilden. Dabei handelt es sich um die sogenannte Amyloid-Aggregation, die aufgrund ihrer zentralen Rolle bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer oder Parkinson ausgiebig untersucht wird21,22. Die Untersuchung der Amyloid-Proteine ist auch durch die funktionelle Rolle, die sie spielen können, motiviert 23,24 oder durch ihr hohes Potenzial für die Entwicklung neuartiger Biomaterialien25. Die physikalisch-chemischen Determinanten der Amyloid-Aggregation sind nach wie vor unklar, und es gibt keine allgemeine Theorie der Amyloid-Aggregation, trotz enormer Fortschritte in den letzten Jahren21,26.
Die Amyloid-Aggregation impliziert Veränderungen in der Proteinstruktur und -stabilität im Laufe der Zeit, deren Untersuchung natürlich eine Dynamik impliziert, die mit der Stabilität der Proteinkonformation, der Proteinfunktion und der Proteinenergielandschaft zusammenhängt27. Die Dynamik ist durch den entropischen Beitrag für die schnellsten Bewegungen28 direkt mit der Stabilität eines bestimmten Zustands verbunden, und die Proteinfunktion kann durch Bewegungen auf verschiedenen Zeitskalen von sub-ps für lichtempfindliche Proteine29 bis ms für Domänenbewegungen aufrechterhalten werden, was durch die Pikosekunden-Nanosekunden-Dynamik30 erleichtert werden kann.
Es werden zwei Beispiele für die Verwendung der Neutronenrückstreuspektroskopie zur Untersuchung von Amyloidproteinen vorgestellt, eines im flüssigen Zustand, um die Proteindynamik zu untersuchen, und eines im hydratisierten Pulverzustand, um die Dynamik des Hydratationswassers zu untersuchen. Das erste Beispiel betrifft die Aggregation von Lysozym in μm-große Kügelchen (Partikel genannt), gefolgt in Echtzeit5, und das zweite ein Vergleich der Wasserdynamik in nativen und aggregierten Zuständen des menschlichen Proteins Tau31.
Lysozym ist ein Enzym, das an der Immunabwehr beteiligt ist und aus 129 Aminosäureresten besteht. Lysozym kann in deuteriertem Puffer bei einem pD-Wert von 10,5 und einer Temperatur von 90 °C Partikel bilden. Mit Hilfe der Neutronenstreuung konnten wir zeigen, dass die zeitliche Entwicklung des Massenschwerpunkt-Diffusionskoeffizienten von Lysozym der einzelnen exponentiellen Kinetik der Thioflavin-T-Fluoreszenz folgt (eine Fluoreszenzsonde, die zur Überwachung der Bildung von Amyloid-Kreuz-β-Musternverwendet wird 32), was darauf hindeutet, dass die Bildung von partikulären Überstrukturen und Kreuz-β-Mustern in einem einzigen Schritt mit der gleichen Geschwindigkeit erfolgt. Darüber hinaus blieb die interne Dynamik während des gesamten Aggregationsprozesses konstant, was entweder durch eine schnelle Konformationsänderung erklärt werden kann, die mit NBS-Instrumenten nicht beobachtet werden kann, oder durch das Fehlen einer signifikanten Änderung der internen Proteinenergie bei der Aggregation.
Das menschliche Protein Tau ist ein intrinsisch ungeordnetes Protein (IDP), das aus 441 Aminosäuren für die sogenannte 2N4R-Isoform besteht, die insbesondere an der Alzheimer-Krankheit beteiligt ist33. Mit Hilfe der Neutronenrückstreuung an Pulvern aus perdeuteriertem Proteintau konnten wir zeigen, dass die Dynamik des Hydratationswassers im Faserzustand erhöht ist, wobei eine höhere Population von Wassermolekülen Translationsbewegungen durchläuft. Das Ergebnis deutet darauf hin, dass eine Erhöhung der Entropie des Hydratationswassers das Amyloid-Flimmern von Tau antreiben könnte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum sample holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, &#8805;99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td> 
			543047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D, 99.9%)</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>DLM-4DR-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning high-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.5901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 75871-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator plate, 140 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>00470.G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nPDyn</td>
			<td></td>
			<td>v3.x</td>
			<td>see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>92641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 0.5-10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 100-1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 20-200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-0206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>372072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water

Die Neutronenstreuung bietet die Möglichkeit, die Dynamik in Proben für einen weiten Energiebereich zerstörungsfrei und ohne andere Markierung als Deuterium zu untersuchen. Insbesondere die Neutronenrückstreuspektroskopie zeichnet die Streusignale bei mehreren Streuwinkeln gleichzeitig auf und eignet sich gut, um die Dynamik biologischer Systeme auf der ps-ns-Zeitskala zu untersuchen. Durch die Verwendung vonD2O- und möglicherweise deuterierten Pufferkomponenten ermöglicht die Methode die Überwachung sowohl der Massenschwerpunktdiffusion als auch der Rückgrat- und Seitenkettenbewegungen (interne Dynamik) von Proteinen im flüssigen Zustand.
Darüber hinaus kann die Dynamik des Hydratationswassers untersucht werden, indem Pulver aus perdeuterierten Proteinen verwendet werden, die mitH2Ohydratisiert sind. In diesem Artikel wird der Arbeitsablauf des Instruments IN16B am Institut Laue-Langevin (ILL) zur Untersuchung der Protein- und Hydratationswasserdynamik vorgestellt. Die Herstellung von Lösungsproben und hydratisierten Proteinpulverproben mittels Dampfaustausch wird erläutert. Das Datenanalyseverfahren sowohl für die Protein- als auch für die Hydratationswasserdynamik wird für verschiedene Arten von Datensätzen (quasielastische Spektren oder Fixed-Window-Scans) beschrieben, die mit einem Neutronenrückstreuspektrometer erhalten werden können.
Die Methode wird anhand von zwei Studien mit Amyloid-Proteinen veranschaulicht. Es wird gezeigt, dass die Aggregation von Lysozym in μm-große sphärische Aggregate - als Partikel bezeichnet - in einem einstufigen Prozess auf dem auf IN16B untersuchten Raum- und Zeitbereich erfolgt, während die interne Dynamik unverändert bleibt. Des Weiteren wurde die Dynamik des Hydratationswassers von Tau an hydratisierten Pulvern aus perdeuteriertem Protein untersucht. Es wird gezeigt, dass Translationsbewegungen von Wasser bei der Bildung von Amyloidfasern aktiviert werden. Abschließend werden kritische Schritte im Protokoll diskutiert, wie die Neutronenstreuung im Hinblick auf die Untersuchung der Dynamik im Vergleich zu anderen experimentellen biophysikalischen Methoden positioniert ist.

Die Aggregation von Lysozym zu partikulären Partikeln erfolgte bei 90 °C mit einer Proteinkonzentration von 50 mg/ml in einem deuterierten Puffer (0,1 M NaCl bei pD 10,5). Die Partikelbildung wird durch den Temperaturanstieg auf 90 °C ausgelöst und erfolgt innerhalb von 6 h (Ergänzungsbild S8). Die Datenerfassung wurde auf IN16B durchgeführt, wie im obigen Protokoll beschrieben (die Daten werden permanent von der Fernleihe kuratiert und sind unter http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811 zugäng...

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High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Die Neutronenrückstreuspektroskopie bietet einen zerstörungsfreien und markierungsfreien Zugang zur ps-ns-Dynamik von Proteinen und deren Hydratationswasser. Der Workflow wird anhand von zwei Studien zu Amyloid-Proteinen vorgestellt: zur zeitaufgelösten Dynamik von Lysozym während der Aggregation und zur Hydratationswasserdynamik von Tau bei der Faserbildung.

Hochauflösende Neutronenspektroskopie zur Untersuchung der Pikosekunden-Nanosekunden-Dynamik von Proteinen und Hydratationswasser

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Die Neutronenrückstreuung misst die globale Diffusion und die interne Dynamik von Proteinen und Hydratationswasser ohne Strahlungsschäden. Die Neutronenspektroskopie greift gleichzeitig auf räumliche und zeitliche Zusammenhänge auf molekularer Ebene zu. In weicher Materie und biologischen Materialien ist es besonders interessant, indirekte Informationen über die lokale Ordnung auf diesen langreichweitigen Unordnungssystemen zu erhalten.Die Neutronenrückstreuung kann also verwendet werden, um die Dynamik in der Biologie, Chemie oder im materiellen Sinne zu untersuchen. Ein weiteres starkes Feld ist die Energie, mit Studien zum Beispiel zu Batterien und Brennstoffzellen. Die Neutronenrückstreuung wurde erfolgreich eingesetzt, um die molekulare Dynamik von Proteinen zu untersuchen, die an neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson beteiligt sind.Die erzielten Ergebnisse helfen uns, die molekularen Merkmale dieser Pathologien besser zu verstehen, und könnten den Weg für die Entwicklung einer besseren Diagnostik ebnen. Um den Probenhalter vorzubereiten, reinigen Sie zunächst einen flachen Aluminium-Probenhalter und seine Indiumdrahtdichtung und Schrauben gründlich mit Wasser, gefolgt von Ethanol, und lassen Sie ihn dann trocknen. Wiegen Sie die verschiedenen Teile des Probenhalters, einschließlich des Bodens, des Deckels und des Indiumdrahts, separat auf einer Präzisionswaage.Setzen Sie die ein Millimeter dicke Indiumdrahtdichtung in die Nut des unteren Teils des Probenhalters ein und lassen Sie eine kleine Überlappung an der Stelle, an der sich die beiden Enden verbinden. Fügen Sie etwa 100 Milligramm gefriergetrocknetes Protein hinzu, so dass es die Innenfläche des unteren Teils des Probenhalters ausfüllt. Als nächstes legen Sie den Probenhalter für 24 Stunden in einen Exsikkator mit einer Petrischale mit Phosphorpentoxidpulver, um das Proteinpulver vollständig zu trocknen.Wiegen Sie den getrockneten unteren Teil des Probenhalters, der die Indiumdichtung und das getrocknete Pulver enthält, um die Masse der getrockneten Probe zu erhalten. Entfernen Sie das Phosphorpentoxid aus dem Exsikkator und legen Sie eine Petrischale mit Deuteriumoxid sowie die Probe hinein, um das Pulver zu hydratisieren. Wiederholen Sie das Trocknen und Hydratisieren dreimal, um einen vollständigen Austausch von Wasserstoff zu Deuterium zu gewährleisten.Messen Sie die Pulvermasse regelmäßig, um den Hydratationsgrad zu überprüfen, und wenn der Hydratationsgrad leicht über dem gewünschten Wert liegt, warten Sie, bis die Masse langsam abnimmt. Sobald die gewünschte Hydratation erreicht ist, setzen Sie schnell den Deckel auf den unteren Teil und verschließen Sie zuerst den Probenhalter mit vier Schrauben, um den Dampfaustausch zu stoppen. Setzen Sie alle verbleibenden Schrauben ein und ziehen Sie sie fest, bis kein Spalt mehr zwischen dem unteren Teil und dem Deckel sichtbar ist.Wiegen Sie den versiegelten Probenhalter, um nach dem Neutronenexperiment auf einen möglichen Hydratationsverlust durch Lecks zu prüfen. Um die Probe im flüssigen Zustand herzustellen, lösen Sie das Protein im deuterierten Puffer auf. Bestimmen Sie mit Wasser das geeignete Flüssigkeitsvolumen, das in den Probenhalter gegeben werden soll.Stellen Sie vor dem Umgang mit Material sicher, dass die Dosis ionisierender Strahlung weniger als 100 Mikrosievert pro Stunde beträgt. Trocknen Sie dann das Probenstäbchen gründlich ab und entfernen Sie alle vorherigen Proben. Legen Sie die Probe auf das Probenstäbchen, prüfen Sie die richtige Zentrierung relativ zur Strahlmitte und setzen Sie das Probenstäbchen in den Kryoofen ein.Verwenden Sie ein Timeout von 200 Minuten. Verwenden Sie eine for-Schleife mit 65 Wiederholungen. Setzen Sie im Inneren einen IN16-Doppler-Einstellungsregler ein, gefolgt vom Zählregler und stellen Sie einen einzelnen Scan von 30 Sekunden ein.Drücken Sie dann die Starttaste, um das Skript auszuführen. Die elastischen und inelastischen Lysosomen-Scans mit festem Fenster zeigten eine Zunahme des Signals bei niedrigem Impulstransfer und niedrigem Energietransfer, während das Signal bei hohem Energietransfer und niedrigem Impulstransfer abnahm. Der anfängliche Massendiffusionskoeffizient betrug 15 Ångström im Quadrat pro Nanosekunde, der dann im Laufe der Zeit exponentiell abnahm.Bei Temperaturen über 220 Kelvin war das Hydratwasser um die Tau-Fasern herum deutlich beweglicher als um die Tau-Monomere. Der Anteil der Wassermoleküle, die eine Translationsbewegung durchlaufen, und sowohl der Translations- als auch der Rotationsdiffusionskoeffizient der Wassermoleküle waren um die Fasern herum erhöht. Die Proteinkonzentration sollte 2000 Milligramm pro ml oder mindestens 20 Milligramm pro ml für proteinierte Proteine betragen, da die Neutronenrückstreuung durch den Neutronenfluss oder den Probenhalterpufferhintergrund begrenzt ist.Die Neutronenrückstreuung wurde beispielsweise kürzlich angewendet, um zu verstehen, wie Wasser, die natürlichen Umweltproteine, vollständig durch ein synthetisches Polymer für biotechnologische Anwendungen wie z. B. die Verabreichung von Medikamenten ersetzt werden können.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Kernresonanzspektroskopie zur Identifizierung von Multiple Phosphorylierungen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Forschung

Biochemie

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Messung der Interaktionen von Kugelsternhaufen und filamentösen Proteinen Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Microscale Thermophorese (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

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