Name: high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water
Uploaded: 2022-04-28T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water at JoVE.com

המחברים אסירי תודה למיכאלה זמפוני במרכז יוליך למדעי הנייטרונים במרכז היינץ מאייר-לייבניץ, גרכינג, גרמניה, על חלק מניסויי פיזור הנייטרונים שנערכו במכשיר SPHERES. עבודה זו הפיקה תועלת מפעילויות קונסורציום מעבדת Deuteration Laboratory (DLAB) הממומן על ידי האיחוד האירופי תחת חוזים HPRI-2001-50065 ו- RII3-CT-2003-505925, ומפעילות במימון מועצת המחקר להנדסה ומדעי הפיזיקה בבריטניה (EPSRC) במסגרת Institut Laue Langevin EMBL DLAB תחת מענקים GR/R99393/01 ו- EP/C015452/1. תמיכה על ידי הנציבות האירופית במסגרת תוכנית המסגרת השביעית באמצעות פעולת המפתח: חיזוק אזור המחקר האירופי, תשתיות מחקר מוכרת [חוזה 226507 (NMI3)]. קווין פואנו וכריסטיאן בק מודים למשרד הפדרלי לחינוך ומחקר (BMBF, מענק מספר 05K19VTB) על מימון מלגות הפוסט-דוקטורט שלהם.

1. הכינו את החיץ המנוטרל לחלבונים במצב נוזלי
<ol><li>ממיסים את כל רכיבי המאגר ב-D2O טהור.</li>
	<li>אם אלקטרודת ה- pH כוילתה ב- H2O, התאם את ה- pD בהתאם לנוסחה pD = pH + 0.4 באמצעות NaOD או DCl34. הערה: השימוש ב-D 2O במקום ב-H2O עשוי להשפיע על מסיסות החלבון, וייתכן שיהיה צור?...

ספקטרוסקופיית נויטרונים היא השיטה היחידה המאפשרת לחקור את הדינמיקה הממוצעת של ps-ns של דגימות חלבון, ללא קשר לגודל החלבון או למורכבות התמיסה כאשר משתמשים בדאוטרציה6. באופן ספציפי, על ידי בדיקת דיפוזיה עצמית של מכלולי חלבונים בתמיסה, ניתן לקבוע באופן חד משמעי את הגודל ההידרודינ?...

הנייטרון הוא חלקיק מסיבי וחסר מטען ששימש בהצלחה לאורך השנים לבדיקת דגימות בתחומים שונים, מפיזיקה בסיסית ועד ביולוגיה1. עבור יישומים ביולוגיים, פיזור נייטרונים בזווית קטנה, פיזור נייטרונים בלתי אלסטי, קריסטלוגרפיה ורפלקטומטריה של נייטרונים נמצאים בשימוש נרחב 2,3,4. פיזור נייטרונים קשיח מספק מדידה ממוצעת של הדינמיקה ללא צורך בתיוג ספציפי כשלעצמו, ואיכות אות שאינה תלויה בגודל או בחלבון5. המדידה יכולה להיעשות באמצעות סביבה מורכבת מאוד עבור החלבון הנחקר המחקה את התווך התוך-תאי, כגון ליזט חיידקי או אפילו in vivo 3,6,7. ניתן להשתמש במערכי ניסוי שונים כדי לחקור את הדינמיקה, כלומר i) גישה של זמן טיסה לדינמיקות sub-ps-ps, ii) גישה המעניקה פיזור לאחור לדינמיקות ps-ns, ו-iii) גישה נותנת ספין-הד לדינמיקה מ-ns למאות ns. פיזור אחורי של נייטרונים עושה שימוש בחוק בראג 2d sinθ = nλ, כאשר d הוא המרחק בין מישורים בגביש, θ זווית הפיזור, n סדר הפיזור ו-λ אורך הגל. השימוש בגבישים לפיזור לאחור לכיוון הגלאים מאפשר השגת רזולוציה גבוהה באנרגיה, בדרך כלל ~0.8 μeV. כדי למדוד את חילופי האנרגיה, משתמשים בכונן דופלר הנושא גביש בפיזור לאחור כדי להגדיר ולכוונן את אורך גל הנייטרונים הנכנס 8,9,10 (איור 1), או שניתן להשתמש במערך זמן טיסה במחיר של ירידה ברזולוציית האנרגיה 11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63664/63664fig01.jpg"> איור 1: שרטוט של ספקטרומטר פיזור לאחור של נייטרונים עם כונן דופלר. הקרן הנכנסת פוגעת במסוק טרנספורמציית חלל הפאזה (PST)42, המגדיל את השטף במיקום הדגימה. לאחר מכן הוא מפוזר לאחור לכיוון הדגימה על ידי כונן דופלר, אשר בוחר אנרגיה E1 (חץ ציאן). לאחר מכן הנייטרונים מפוזרים על ידי הדגימה (עם אנרגיות שונות המיוצגות על ידי צבע החיצים) והאנלייזרים, העשויים מגבישי Si 111, יפזרו לאחור נייטרונים רק עם אנרגיה ספציפית E0 (חיצים בצבע אדום כאן). לפיכך, העברת התנע q מתקבלת מהמיקום שזוהה של הנייטרון על מערך הגלאים, והעברת האנרגיה מתקבלת מההפרש E1- E0. זמן הטיסה הצפוי לפעימת הנייטרונים המופקת על ידי ה-PST משמש להשלכת האות מהנייטרונים המפוזרים ישירות לעבר צינורות הגלאי. קיצור: PST = טרנספורמציה של מרחב פאזה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63664/63664fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
עבור ספקטרוסקופיית פיזור לאחור, התרומה העיקרית לאות מדגימות עשירות בפרוטוני מימן, כגון חלבונים, מגיעה מפיזור לא קוהרנטי, שעבורו עוצמת הפיזור Sinc(q, ω) מוצגת על ידי Eq (1)12
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)
כאשר σinc הוא חתך הרוחב הלא קוהרנטי של היסוד הנחשב, k' הוא הנורמה של וקטור הגל המפוזר, k הנורמה של וקטור הגל הנכנס, q (= k - k') העברת התנע, r j(t) וקטור המיקום של אטום j בזמן t, ו-ω התדר המתאים למעבר האנרגיה בין הנייטרון הנכנס למערכת. הסוגריים הזוויתיים מציינים את ממוצע ההרכב. לפיכך, פיזור לא קוהרנטי בוחן את המתאם העצמי הממוצע של חלקיק בודד של מיקומי אטומים עם זמן ונותן את הדינמיקה העצמית הממוצעת על פני כל האטומים במערכת ומקורות זמן שונים (ממוצע אנסמבל). פונקציית הפיזור היא התמרת פורייה בזמן של פונקציית פיזור הביניים I(q, t), שניתן לראותה כהתמרת פורייה במרחב של פונקציית מתאם ואן הוב המוצגת על ידי Eq (2):
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
כאשר ρ(r,t) היא צפיפות ההסתברות למציאת אטום במיקום r ובזמן t 13.
עבור תהליך דיפוזיה פיקיאנית, פונקציית הדיפוזיה העצמית נוצרת (ראו Eq (3)) לאחר התמרת פורייה כפולה בפונקציית פיזור המורכבת מלורנציאן של רוחב קו הנתון על ידי γ = Dq2.
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq10.jpg" style="margin: auto;"> (3)
מודלים מתוחכמים יותר פותחו ונמצאו שימושיים כגון מודל דיפוזיית הקפיצה על ידי Singwi ו- Sjölander עבור ps-ns דינמיקה פנימית של חלבונים14 או מודל הסיבוב על ידי סירס עבור מי הידרציה15,16,17.
במכשיר פיזור אחורי של נייטרונים (NBS) IN16B8,9 ב-ILL, גרנובל, צרפת (איור משלים S1), מערך נפוץ עם חלבונים מורכב מגבישי Si 111 עבור האנלייזרים עם כונן דופלר לכוונון אורך הגל הנכנס (איור משלים S2A), ובכך נותן גישה לטווח העברת התנע ~0.2 Å-1 < q < ~2 Å-1 וטווח העברת אנרגיה של -30 μeV < <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> < 30 μeV - מתאים לטווחי זמן הנעים בין כמה ps לכמה ns ומרחקים של כמה Å. בנוסף, IN16B מציע את האפשרות לבצע סריקות גמישות ובלתי אלסטיות של חלונות קבועים (E/IFWS)10, הכוללות איסוף נתונים בהעברת אנרגיה קבועה. מכיוון שהשטף מוגבל בעבודה עם נייטרונים, E/IFWS מאפשר למקסם את השטף להעברת אנרגיה אחת, ובכך מקצר את זמן הרכישה הדרוש לקבלת יחס אות לרעש מספק. אפשרות עדכנית יותר היא מצב ספקטרומטר פיזור לאחור וזמן טיסה (BATS)11, המאפשר מדידה של מגוון רחב של העברות אנרגיה, (למשל, -150 μeV < < <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> 150 μeV), עם שטף גבוה יותר מאשר עם כונן דופלר, אך במחיר של רזולוציית אנרגיה נמוכה יותר (איור משלים S2B).
תכונה חשובה של פיזור נייטרונים היא שחתך הרוחב הלא קוהרנטי σinc הוא בעל ערך גבוה פי 40 עבור מימן מאשר עבור דאוטריום, והוא זניח עבור יסודות אחרים הנמצאים בדרך כלל בדגימות ביולוגיות. לכן, ניתן לחקור את הדינמיקה של חלבונים בסביבה נוזלית באמצעות מאגר deuterated, ומצב האבקה מאפשר לחקור דינמיקה פנימית של חלבונים עם אבקת חלבון מוקשה hydrated עם D 2 O, או המחקר של מים הידרציה עבוראבקת חלבון perdeuterated hydrated עם H2O. במצב נוזלי, פיזור אחורי של נייטרונים מאפשר בדרך כלל גישה בו זמנית לדיפוזיה העצמית של מרכז המסה של חלבונים (דיפוזיה מסוג פיקיאן) ולדינמיקה הפנימית שלהם. אלה האחרונים הם תנועות עמוד השדרה ושרשרת הצד המתוארות בדרך כלל על ידי מה שנקרא מודל דיפוזיה קפיצה או אחרים 3,18. באבקות חלבון מוקשה, דיפוזיית החלבון נעדרת ויש למדל רק דינמיקה פנימית. עבור מי הידרציה, התרומות של תנועות תרגומיות וסיבוביות של מולקולות מים מציגות תלות שונה בהעברת התנע q, המאפשרת את ההבחנה ביניהן בתהליך ניתוח הנתונים17.
מאמר זה מדגים את שיטת הפיזור לאחור של נייטרונים באמצעות מחקר של חלבונים שנמצאו מסוגלים להתפתח, להצטבר לצורה קנונית המורכבת מערימות של β-גדילים - מה שמכונה תבנית β צולבת19,20 - וליצור סיבים מוארכים. זהו מה שנקרא צבירה עמילואיד, אשר נחקר בהרחבה בשל תפקידו המרכזי בהפרעות נוירודגנרטיביות כגון אלצהיימר או פרקינסון21,22. המחקר של חלבוני העמילואיד מונע גם על ידי התפקיד הפונקציונלי שהם יכולים למלא 23,24 או הפוטנציאל הגבוה שלהם לפיתוח ביו-חומרים חדשים25. הדטרמיננטים הפיזיקוכימיים של צבירת העמילואיד עדיין אינם ברורים, ואין תיאוריה כללית של צבירת עמילואיד, למרות התקדמות עצומה במהלך השנים האחרונות21,26.
צבירת עמילואיד מרמזת על שינויים במבנה החלבון וביציבותו עם הזמן, שהמחקר שלהם מרמז באופן טבעי על דינמיקה, הקשורה ליציבות קונפורמציה של חלבונים, תפקוד חלבונים ונוף אנרגיית חלבון27. דינמיקה קשורה ישירות ליציבות של מצב מסוים באמצעות התרומה האנטרופית עבור התנועות המהירות ביותר28, ותפקוד החלבונים יכול להתקיים על ידי תנועות בסקאלות זמן שונות, החל מ-sub-ps עבור חלבונים רגישים לאור29 ועד ms עבור תנועות תחום, אשר ניתן להקל על ידי דינמיקה פיקו-שנייה-ננו-שנייה30.
יוצגו שתי דוגמאות לשימוש בספקטרוסקופיית פיזור לאחור של נייטרונים לחקר חלבוני עמילואיד, אחת במצב נוזלי לחקר דינמיקה של חלבונים ואחת במצב אבקה רוויית לחות לחקר דינמיקת מי הידרציה. הדוגמה הראשונה נוגעת לצבירה של ליזוזים לכדורים בגודל מיקרומטר (הנקראים חלקיקים) ואחריה בזמן אמת5, והשנייה השוואה של דינמיקת מים במצבים טבעיים ומצטברים של החלבון האנושי טאו31.
ליזוזים הוא אנזים המעורב בהגנה החיסונית ומורכב משאריות של 129 חומצות אמינו. ליזוזים יכול ליצור חלקיקים בחיץ מפורק ב pD של 10.5 ובטמפרטורה של 90 ° C. עם פיזור נייטרונים, הראינו כי התפתחות הזמן של מקדם הדיפוזיה של מרכז המסה של ליזוזים עוקבת אחר הקינטיקה המעריכית היחידה של תיאופלבין T פלואורסצנטי (בדיקה פלואורסצנטית המשמשת לניטור היווצרות תבניות β צולבות עמילואיד32), מה שמצביע על כך שהיווצרות מבני על חלקיקיים ותבניות β צולבות מתרחשות בשלב אחד עם אותו קצב. יתר על כן, הדינמיקה הפנימית נשארה קבועה לאורך כל תהליך הצבירה, אשר ניתן להסביר או על ידי שינוי קונפורמציה מהיר שלא ניתן לצפות בו על מכשירי NBS, או על ידי היעדר שינוי משמעותי באנרגיה הפנימית של החלבונים בעת הצבירה.
החלבון האנושי טאו הוא חלבון בעל הפרעה מהותית (IDP) המורכב מ-441 חומצות אמינו עבור מה שמכונה איזופורם 2N4R, אשר מעורב באופן בולט במחלת אלצהיימר33. באמצעות פיזור לאחור של נייטרונים על אבקות של חלבון טאו מפורר, הראינו כי דינמיקת מי הידרציה מוגברת במצב הסיבים, כאשר אוכלוסייה גבוהה יותר של מולקולות מים עוברות תנועות תרגומיות. התוצאה מצביעה על כך שעלייה באנטרופיית מי הידרציה עשויה להניע את פרפור העמילואיד של טאו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum sample holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, &#8805;99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td> 
			543047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D, 99.9%)</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>DLM-4DR-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning high-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.5901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 75871-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator plate, 140 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>00470.G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nPDyn</td>
			<td></td>
			<td>v3.x</td>
			<td>see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>92641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 0.5-10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 100-1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 20-200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-0206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>372072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water

פיזור נייטרונים מציע את האפשרות לחקור את הדינמיקה בתוך הדגימות עבור מגוון רחב של אנרגיות באופן לא הרסני וללא תיוג מלבד דאוטריום. בפרט, ספקטרוסקופיית פיזור אחורי של נייטרונים מתעדת את אותות הפיזור במספר זוויות פיזור בו זמנית ומתאימה היטב לחקר הדינמיקה של מערכות ביולוגיות בסקאלת הזמן ps-ns. על ידי שימוש ברכיבי D2O - ואולי גם רכיבי חיץ מפורקים - השיטה מאפשרת ניטור הן של דיפוזיה של מרכז המסה והן של תנועות עמוד השדרה והשרשרת הצידית (דינמיקה פנימית) של חלבונים במצב נוזלי.
בנוסף, ניתן לחקור את דינמיקת מי ההידרציה על ידי שימוש באבקות של חלבונים מחוררים עם H2O. מאמר זה מציג את תהליך העבודה שהופעל במכשיר IN16B במכון Laue-Langevin (ILL) כדי לחקור דינמיקה של חלבונים ומי הידרציה. הכנת דגימות תמיסה ודגימות אבקת חלבון hydrated באמצעות חילופי אדים מוסבר. הליך ניתוח הנתונים עבור דינמיקת מים של חלבונים והידרציה מתואר עבור סוגים שונים של מערכי נתונים (ספקטרום קוואזיאלסטי או סריקות חלונות קבועים) שניתן לקבל על ספקטרומטר פיזור אחורי של נייטרונים.
השיטה מודגמת באמצעות שני מחקרים שכללו חלבוני עמילואיד. הצבירה של ליזוזים לצברים כדוריים בגודל מיקרומטר - חלקיקים מסומנים - מתרחשת בתהליך בן שלב אחד על טווח המרחב והזמן שנבחן על IN16B, בעוד שהדינמיקה הפנימית נותרת ללא שינוי. יתר על כן, הדינמיקה של מי הידרציה של טאו נחקרה על אבקות לחות של חלבון perdeuterated. זה מראה כי תנועות תרגום של מים מופעלות על היווצרות של סיבי עמילואיד. לבסוף, נדונים צעדים קריטיים בפרוטוקול לגבי האופן שבו פיזור נייטרונים ממוקם ביחס לחקר הדינמיקה ביחס לשיטות ביופיזיקליות ניסיוניות אחרות.

הצבירה של ליזוזים לחלקיקים בוצעה ב 90 ° C עם ריכוז חלבון של 50 מ"ג / מ"ל בחיץ deuterated (0.1 M NaCl ב pD 10.5). היווצרות חלקיקים מופעלת על-ידי עליית הטמפרטורה ל-90°C ומתרחשת תוך 6 שעות (איור משלים S8). איסוף הנתונים בוצע ב-IN16B, כמתואר בפרוטוקול לעיל (הנתונים נאספים לצמיתות על ידי ה-ILL ונגישים ב-http://dx.doi.org/10....

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water at JoVE.com

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

ספקטרוסקופיית פיזור אחורי של נייטרונים מציעה גישה לא הרסנית ונטולת תוויות לדינמיקה של ps-ns של חלבונים ומי ההידרציה שלהם. תהליך העבודה מוצג עם שני מחקרים על חלבוני עמילואיד: על הדינמיקה שנפתרה בזמן של ליזוזים במהלך צבירה ועל דינמיקת מי ההידרציה של טאו על היווצרות סיבים.

ספקטרוסקופיית נייטרונים ברזולוציה גבוהה לחקר דינמיקה של פיקו-שנייה-ננו-שנייה של חלבונים ומי לחות

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

פיזור אחורי של נייטרונים מודד דיפוזיה גלובלית ודינמיקה פנימית של חלבונים ומי הידרציה ללא נזקי קרינה. ספקטרוסקופיית נייטרונים ניגשת בו זמנית למתאמים מרחביים ובזמן ברמה המולקולרית. בחומר רך ובחומרים ביולוגיים, מעניין במיוחד לקבל מידע עקיף על הסדר המקומי על מערכות אי-סדר ארוכות טווח אלה.לכן ניתן להשתמש בפיזור לאחור של נייטרונים כדי לחקור דינמיקה בביולוגיה, כימיה או חוש חומרי. תחום חזק נוסף הוא אנרגיה, עם מחקרים, למשל, על סוללות ותאי דלק. פיזור לאחור של נייטרונים שימש בהצלחה לחקר הדינמיקה המולקולרית של חלבונים המעורבים במחלות נוירודגנרטיביות כגון אלצהיימר ופרקינסון.התוצאות המתקבלות עוזרות לנו להבין טוב יותר את סימני ההיכר המולקולריים של פתולוגיות אלה ועשויות לסלול את הדרך לפיתוח אבחון טוב יותר. כדי להכין את מחזיק הדגימה, התחל על ידי ניקוי יסודי של מחזיק דגימת אלומיניום שטוח ואטם חוט אינדיום שלו וברגים עם מים, ולאחר מכן אתנול, ולאחר מכן לתת לו להתייבש. שקול את החלקים השונים של מחזיק הדגימה, כולל התחתית, המכסה וחוט האינדיום, בנפרד על איזון מדויק.הניחו את אטם חוט האינדיום במילימטר אחד בחריץ של החלק התחתון של מחזיק הדגימה, והשאירו חפיפה קטנה במקום שבו שני הקצוות מתחברים. הוסף סביב 100 מיליגרם של חלבון lyophilized כך שהוא ממלא את פני השטח הפנימיים של החלק התחתון של מחזיק הדגימה. לאחר מכן, הניחו את מחזיק הדגימה במייבש עם צלחת פטרי המכילה אבקת תחמוצת זרחן למשך 24 שעות כדי לייבש לחלוטין את אבקת החלבון.שקול את החלק התחתון המיובש של מחזיק הדגימה המכיל את חותם האינדיום ואת האבקה המיובשת כדי לקבל את המסה של הדגימה המיובשת. הסר את תחמוצת הזרחן מן מייבש ולשים צלחת פטרי עם תחמוצת דאוטריום, כמו גם את הדגימה בפנים עבור לחות האבקה. חזור על הייבוש והלחות שלוש פעמים להחלפת מימן מלאה לדאוטריום.מדדו את מסת האבקה באופן קבוע כדי לבדוק את רמת ההידרציה, וכאשר ההידרציה מעט מעל הרמה הרצויה, המתינו עד שהמסה תרד לאט. לאחר קבלת ההידרציה הרצויה, הניחו במהירות את המכסה על החלק התחתון וסגרו תחילה את מחזיק הדגימה עם ארבעה ברגים כדי לעצור את חילופי האדים. מניחים ומהדקים את כל הברגים הנותרים עד שלא נראה רווח בין החלק התחתון למכסה.שקלו את מחזיק הדגימה האטום כדי לבדוק אם יש אובדן הידרציה פוטנציאלי כתוצאה מדליפות לאחר ניסוי הנייטרונים. כדי להכין את דגימת המצב הנוזלי, יש להמיס את החלבון במאגר המפורק. באמצעות מים, לקבוע את נפח הנוזל המתאים לשים במחזיק הדגימה.לפני הטיפול בחומר כלשהו, יש לוודא שמינון הקרינה המייננת נמוך מ-100 מיקרוסיוורטים לשעה. לאחר מכן, יבש היטב את מקל הדגימה והסר כל דגימה קודמת. הניחו את הדגימה על מקל הדגימה, בדקו אם יש מרכוז נכון ביחס למרכז הקרן והכניסו את מקל הדגימה לכבשן הקריו.כדי להשיג נתונים ב- Nomad, עבור אל כרטיסיית הביצוע וגרור ושחרר בקר קריוסטט תנור לתוך כן השיגור. כוונו את הטמפרטורה ל-200 קלווין. השתמש במצב מהיר ופסק זמן של 30 דקות כדי שלטמפרטורה יהיה זמן להתייצב.לחץ על סמל הרענון כדי להפעיל את רמפת הטמפרטורה ברקע לרכישת נתונים במהלך ירידת הטמפרטורה. גרור ושחרר את בקר ההגדרות IN16 Doppler לתוך נקודת ההתחלה. הגדר את פרופיל המהירות למהירות מדויקת, הגדר על ידי דלתא E מקסימלית, קיזוז האנרגיה ל- 0.00 מיקרו אלקטרון-וולט, ומספר הערוצים ל- 128 כדי לקבל תצורת סריקות חלון קבועה אלסטית.גרור ושחרר בקר ספירה לתוך נקודת הזינוק, מלא את שדה הכתוביות בשם המאפשר זיהוי קל של הנתונים, והגדר סריקות של 30 שניות עם 60 חזרות. לאחר מכן, גרור ושחרר את בקר ההגדרות של דופלר IN16 לתוך נקודת השיגור. הגדר את פרופיל המהירות לחתימה, את הגדר לפי מהירות עם ערך של 4.5 מטר לשנייה, ואת מספר הערוצים ל- 2048 כדי לקבל תצורת פיזור נייטרונים קוואזי אלסטי.גרור ושחרר בקר ספירה ומלא את שדה הכתוביות בשם המאפשר זיהוי קל של הנתונים. הגדר סריקות של 30 דקות עם ארבע חזרות. עבור כבש הטמפרטורה, גרור ושחרר בקר קריוסטט תנור, הגדר את הטמפרטורה ל -310 קלווין, והגדר את הרמפה לנקודה עם דלתא של 0.05 קלווין למשך שש שניות.השתמש בפסק זמן של 200 דקות. השתמש בלולאה עם 65 חזרות. בפנים, הכנס בקר הגדרות דופלר IN16, ואחריו בקר הספירה והגדר סריקה יחידה של 30 שניות.לאחר מכן, הכנס הגדרות דופלר IN16 כפי שתואר קודם לכן, אך באמצעות היסט אנרגיה של 1.5 מיקרו אלקטרון-וולט ו-1024 ערוצים. לאחר מכן, הכנס את בקר הספירה והגדר סריקה אחת של שלוש דקות. כדי לקבל את פיזור הנייטרונים האלסטי האחרון של 312 קלווין, גרור ושחרר את הגדרות דופלר IN16 ואת בקרי הספירה שהוגדרו כפי שהודגם קודם לכן.לאחר מכן, לחץ על לחצן התחל כדי להפעיל את הסקריפט. סריקות החלון הקבוע האלסטי והבלתי אלסטי הראו עלייה באות בהעברת תנע נמוכה והעברת אנרגיה נמוכה, בעוד שהאות בהעברת אנרגיה גבוהה והעברת תנע נמוכה ירד. המרכז הראשוני של מקדם דיפוזיית המסה היה 15 אנגסטרום בריבוע לננו-שנייה, אשר ירד באופן אקספוננציאלי עם הזמן.בטמפרטורות גבוהות מ-220 קלווין, מי ההידרציה סביב סיבי הטאו היו ניידים יותר באופן משמעותי מאשר סביב מונומרי הטאו. שבריר מולקולות המים שעברו תנועה תרגומית ומקדמי הדיפוזיה התרגומית והסיבוב של מולקולות המים גדלו סביב סיבים. ריכוז החלבון צריך להיות 2000 מיליגרם למ"ל או לפחות 20 מיליגרם למ"ל עבור חלבונים חלבונים עקב מגבלות פיזור גב נייטרונים משטף נייטרונים או רקע חיץ מחזיק דגימה.פיזור לאחור של נייטרונים יושם לאחרונה, למשל, כדי להבין כיצד מים, שהם החלבונים הסביבתיים הטבעיים, יכולים להיות מוחלפים במלואם על ידי פולימר סינתטי ליישום ביוטכנולוגי כמו, למשל, אספקת תרופות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

מדידת אינטראקציות של חלבונים הכדוריים, Filamentous על ידי תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

הפרדה ברזולוציה גבוהה בפרופיל מלא-ניתוח בהקפאה בסון-MS

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

ספקטרוסקופיית ראמאן משולבת ופלטפורמת ספקטרומטר המסה ללימוד תא יחיד קליטת סמים, מטבוליזם, ואפקטים

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

ספקטרוסקופיה של תקליטור לחקר אינטראקציות בין DNA לחלבון

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...