Name: high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water
Uploaded: 2022-04-28T13:10:00
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저자들은 SPHERES 장비에서 수행된 중성자 산란 실험의 일부에 대해 독일 가르힝의 Heinz Maier-Leibnitz Zentrum에 있는 Jülich 중성자 과학 센터의 Michaela Zamponi에게 감사를 표합니다. 이 작업은 HPRI-2001-50065 및 RII3-CT-2003-505925 계약에 따라 유럽 연합이 자금을 지원하는 DLAB(Deuteration Laboratory) 컨소시엄의 활동과 보조금 GR/R99393/01 및 EP/C015452/1에 따라 Institut Laue Langevin EMBL DLAB 내에서 영국 공학 및 물리 과학 연구 위원회(EPSRC)가 자금을 지원하는 활동의 혜택을 받았습니다. 제7차 프레임워크 프로그램에 따른 유럽연합 집행위원회(European Commission)의 주요 조치: 유럽 연구 영역 강화, 연구 인프라 강화(Key Action: Strengthening the European Research Area, Research Infrastructures)를 통해 [계약 226507(NMI3)]을 인정합니다. 케빈 푸노 (Kevin Pounot)와 크리스티안 벡 (Christian Beck)은 박사후 연구원 기금에 대해 연방 교육 연구부 (BMBF, 보조금 번호 05K19VTB)에 감사드립니다.

1. 액체 상태의 단백질에 대한 중수소화 완충액 준비
<ol><li>완충액의 모든 성분을 순수한D2O에 용해시킨다.</li>
	<li>pH 전극을H2O로 보정한 경우, NaOD 또는DCl34를 사용하여 pD = pH + 0.4 공식에 따라 pD를 조정하였다. 참고: H2O대신 D2O를 사용하면 단백질 용해도에 영향을 미칠 수 있으며 완충액 조건을 조정해야 할 수도 있습니다(예: 염 농...

중성자 분광법(neutron spectroscopy)은 중수소를 사용할 때 단백질의 크기나 용액의 복잡성에 관계없이 단백질 샘플의 앙상블 평균 ps-ns 역학을 조사할 수 있는 유일한 방법이다6. 구체적으로, 용액에서 단백질 어셈블리의 자체 확산을 조사함으로써, 이러한 어셈블리의 유체역학적 크기를 명확하게 결정할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이 방법은 일반적으로 낮은 중성자 플럭스에...

중성자는 기초 물리학에서 생물학에 이르기까지 다양한 분야의 샘플을 탐사하는 데 수년에 걸쳐 성공적으로 사용되어 온 전하가 없는 거대한 입자입니다1. 생물학적 응용을 위해, 소각 중성자 산란, 비탄성 중성자 산란, 중성자 결정학 및 반사 측정법이 광범위하게 사용된다 2,3,4. 비탄성 중성자 산란은 특정 표지 그 자체를 필요로 하지 않고 역학의 앙상블 평균 측정을 제공하며, 크기 또는 단백질에 의존하지 않는 신호 품질을 제공한다5. 측정은 중수소화 박테리아 용해물 또는 생체 내 3,6,7과 같은 세포내 배지를 모방하는 연구 중인 단백질에 대해 매우 복잡한 환경을 사용하여 수행할 수 있습니다. 역학을 연구하기 위해 다양한 실험 설정, 즉 i) sub-ps-ps 역학에 대한 비행 시간 액세스 제공, ii) ps-ns 역학에 대한 후방 산란 제공 액세스 및 iii) ns에서 수백 ns까지의 역학에 대한 스핀 에코 제공 액세스. 중성자 후방 산란은 브래그의 법칙 2d sinθ = nλ를 사용하며, 여기서 d는 결정에서 평면 사이의 거리, θ는 산란 각도, n은 산란 차수, λ는 파장입니다. 검출기를 향한 후방 산란을 위해 크리스털을 사용하면 일반적으로 ~0.8μeV의 높은 에너지 분해능을 달성할 수 있습니다. 에너지 교환을 측정하기 위해, 후방 산란에서 크리스털을 운반하는 도플러 드라이브를 사용하여 들어오는 중성자 파장8,9,10을 정의하고 조정하거나(그림 1), 에너지 분해능을 감소시키는 대가로 ToF(Time-of-Flight) 설정을 사용할 수 있다(11).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63664/63664fig01.jpg"> 그림 1: 도플러 드라이브가 있는 중성자 후방 산란 분광계의 스케치. 인입 빔은 위상 공간 변환(PST) 초퍼(42)에 부딪히고, 이는 샘플 위치에서의 플럭스를 증가시킨다. 그런 다음 에너지 E1(청록색 화살표)을 선택하는 도플러 드라이브에 의해 샘플을 향해 후방 산란됩니다. 그런 다음 중성자는 샘플에 의해 산란되고(화살표 색상으로 표시되는 다른 에너지로) Si 111 결정으로 만들어진 분석기는 특정 에너지 E0(여기서는 빨간색 화살표)를 가진 중성자만 후방 산란합니다. 따라서, 운동량 전달 q는 검출기 어레이 상의 중성자의 검출 위치로부터 얻어지고, 에너지 전달은 차이E1-E0로부터 얻어진다. PST에 의해 생성된 중성자 펄스에 대해 예상되는 비행 시간은 검출기 튜브를 향해 직접 산란된 중성자의 신호를 버리는 데 사용됩니다. 약어: PST = 위상 공간 변환. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63664/63664fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
후방 산란 분광법의 경우, 단백질과 같은 수소 양성자가 풍부한 샘플의 신호에 대한 주요 기여는 비간섭성 산란에서 비롯되며, 이에 대해 산란 강도 Sinc(q, ω)는 Eq (1)12로 표시됩니다
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1개)
여기서σ inc는 고려된 요소의 비간섭성 단면이고, k'는 산란된 파동 벡터의 노름이고, k는 들어오는 파동 벡터의 노름이고, q(= k - k')는 운동량 전달, r j(t)는 시간 t에서 원자 j의 위치 벡터이고, ω는 들어오는 중성자와 시스템 사이의 에너지 전달에 해당하는 주파수입니다. 꺾은 괄호는 앙상블 평균을 나타냅니다. 따라서 비간섭성 산란은 시간에 따른 원자 위치의 앙상블 평균 단일 입자 자기 상관을 조사하고 시스템의 모든 원자와 다른 시간 기원(앙상블 평균)에 대한 자체 역학 평균을 제공합니다. 산란 함수는 중간 산란 함수 I(q, t)의 시간에서의 푸리에 변환이며, 이는 Eq (2)에 의해 표시된 van Hove 상관 함수의 공간에서의 푸리에 변환으로 볼 수 있습니다.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2개)
여기서 ρ(r,t)는 위치 r과 시간 t 13에서 원자를 찾을 확률 밀도입니다.
Fickian 확산 과정의 경우, γ = Dq2로 주어진 선폭의 로렌치안으로 구성된 산란 함수에서 이중 푸리에 변환 후 자기 확산 함수 결과(Eq (3) 참조)가 발생합니다.
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq10.jpg" style="margin: auto;"> (3)
ps-ns 내부 단백질 역학14에 대한 Singwi 및 Sjölander의 점프 확산 모델 또는 수화수15,16,17에 대한 Sears의 회전 모델과 같이 보다 정교한 모델이 개발되어 유용한 것으로 나타났습니다.
프랑스 그르노블의 ILL에 있는 중성자 후방 산란(NBS) 기기 IN16B 8,9(보충 그림 S1)에서 단백질과 함께 일반적으로 사용되는 설정은 들어오는 파장을 조정하기 위한 도플러 드라이브가 있는 분석기용 Si 111 결정으로 구성되며(보충 그림 S2A), 이에 따라 ~0.2 Å-1 <q < ~2 Å-1의 운동량 전달 범위 및 -30 μeV의 에너지 전달 범위에 대한 액세스를 제공합니다< <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> < 30 μeV - 몇 ps에서 몇 ns 범위의 시간 척도 및 몇 Å의 거리에 해당합니다. 또한 IN16B는 고정 에너지 전송에서 데이터 수집을 포함하는 탄성 및 비탄성 고정 창 스캔(E/IFWS)10을 수행할 수 있는 가능성을 제공합니다. 중성자로 작업할 때 플럭스가 제한되기 때문에 E/IFWS를 사용하면 한 번의 에너지 전달에 대해 플럭스를 최대화할 수 있으므로 만족스러운 신호 대 잡음비를 얻는 데 필요한 획득 시간을 줄일 수 있습니다. 보다 최근의 옵션은 후방 산란 및 비행 시간 분광계(BATS) 모드(11)로, 도플러 드라이브보다 더 높은 플럭스로 광범위한 에너지 전달(예: -150μeV < < <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> 150μeV)을 측정할 수 있지만 에너지 분해능은 더 낮습니다(보충 그림 S2B).
중성자 산란의 중요한 특성은 incoherent 단면σ inc가 중수소보다 수소에 대해 40배 더 높은 값을 가지며 생물학적 샘플에서 일반적으로 발견되는 다른 원소에 대해서는 무시할 수 있다는 것입니다. 따라서, 액체 환경에서 단백질의 역학은 중수소화 완충액을 사용하여 연구 할 수 있으며, 분말 상태는 D 2 O로 수화 된 수소화 단백질 분말을 사용한 단백질 내부 역학 연구 또는 H2O로 수화 된 과중수소화 단백질 분말에 대한 수화수 연구를 허용합니다. 액체 상태에서, 중성자 후방 산란은 전형적으로 단백질의 질량 중심 자기 확산 (Fickian-type diffusion)과 그 내부 역학에 동시에 접근 할 수있게한다. 후자는 일반적으로 소위 점프 확산 모델 또는 기타 3,18에 의해 설명되는 백본 및 사이드 체인 운동입니다. 수소화 단백질 분말에서는 단백질 확산이 없으며 내부 역학만 모델링하면 됩니다. 수화수의 경우, 물 분자의 병진 및 회전 운동의 기여도는 운동량 전달 q에 대한 다른 의존성을 나타내며, 이는 데이터 분석 프로세스17에서 구별할 수 있습니다.
이 논문은 전개될 수 있는 것으로 밝혀진 단백질에 대한 연구와 함께 중성자 후방 산란 방법을 설명하고, 소위 교차 β 패턴19,20이라고 하는 β가닥 스택으로 구성된 표준 형태로 응집되고 길쭉한 섬유를 형성합니다. 이것은 소위 아밀로이드 응집체이며, 이는 알츠하이머 병이나 파킨슨 병과 같은 신경 퇴행성 질환에서 중심적인 역할을하기 때문에 광범위하게 연구되고 있습니다21,22. 아밀로이드 단백질에 대한 연구는 또한 아밀로이드 단백질이 할 수 있는 기능적 역할에 의해 동기가 부여된다23,24 또는 새로운 생체 재료 개발에 대한 높은 잠재력 25. 아밀로이드 응집의 물리 화학적 결정 인자는 불분명하며, 지난 몇 년 동안 엄청난 진전이 있었음에도 불구하고 아밀로이드 응집에 대한 일반적인 이론은 없다21,26.
아밀로이드 응집은 시간에 따른 단백질 구조와 안정성의 변화를 의미하며, 이에 대한 연구는 자연적으로 단백질 형태 안정성, 단백질 기능 및 단백질 에너지 환경과 관련된 역학을 의미한다27. 동역학은 가장 빠른 운동(28)에 대한 엔트로피 기여를 통해 특정 상태의 안정성과 직접적으로 연결되며, 단백질 기능은 빛에 민감한 단백질(29 )에 대한 sub-ps에서 도메인 운동에 대한 ms에 이르기까지 다양한 시간 척도의 운동에 의해 유지될 수 있으며, 이는 피코초-나노초 역학(30)에 의해 촉진될 수 있다.
아밀로이드 단백질을 연구하기 위해 중성자 후방 산란 분광법을 사용하는 두 가지 예가 제시될 것인데, 하나는 단백질 역학을 연구하기 위해 액체 상태에서, 다른 하나는 수화 물 역학을 연구하기 위해 수화된 분말 상태입니다. 첫 번째 예는 리소자임을 μm 크기의 구체(미립자라고 함)로 응집하는 것과 관련이있으며, 두 번째 예는 인간 단백질 타우(tau)의 천연 상태와 응집 상태에서의 물 역학 비교에 관한 것이다31.
리소자임은 면역 방어에 관여하는 효소로 129개의 아미노산 잔기로 구성되어 있습니다. 리소자임은 10.5의 pD 및 90°C의 온도에서 중수소화 완충액에서 미립자를 형성할 수 있습니다. 중성자 산란을 통해 우리는 리소자임의 질량 중심 확산 계수의 시간 진화가 티오플라빈 T 형광(아밀로이드 교차 β 패턴32의 형성을 모니터링하는 데 사용되는 형광 프로브)의 단일 지수 동역학을 따른다는 것을 보여주었으며, 이는 형성 미립자 상부 구조와 교차 β 패턴이 동일한 속도로 단일 단계에서 발생함을 나타냅니다. 또한, 내부 역학은 응집 과정 전반에 걸쳐 일정하게 유지되었으며, 이는 NBS 기기에서 관찰할 수 없는 빠른 구조적 변화 또는 응집 시 단백질 내부 에너지의 유의미한 변화가 없는 것으로 설명할 수 있습니다.
인간 단백질 타우(tau)는 소위 2N4R 이소형(isoform)을 위한 441개의 아미노산으로 구성된 본질적으로 무질서한 단백질(IDP)로, 특히 알츠하이머병에 관여한다33. 과중수소화된 단백질 타우의 분말에 중성자 후방 산란을 사용하여, 우리는 수화 물 역학이 섬유 상태에서 증가하고, 더 많은 물 분자 집단이 병진 운동을 겪는다는 것을 보여주었습니다. 결과는 수화수 엔트로피의 증가가 타우의 아밀로이드 세동을 유발할 수 있음을 시사합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum sample holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, &#8805;99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td> 
			543047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D, 99.9%)</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>DLM-4DR-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning high-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.5901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 75871-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator plate, 140 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>00470.G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nPDyn</td>
			<td></td>
			<td>v3.x</td>
			<td>see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>92641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 0.5-10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 100-1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 20-200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-0206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>372072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water

중성자 산란은 중수소 이외의 표지 없이 비파괴적인 방식으로 광범위한 에너지에 대한 샘플 내 역학을 조사할 수 있는 가능성을 제공합니다. 특히, 중성자 후방 산란 분광법은 여러 산란 각도에서 산란 신호를 동시에 기록하며 ps-ns 시간 척도에서 생물학적 시스템의 역학을 연구하는 데 매우 적합합니다. D2O및 중수소화 완충액 성분을 사용함으로써, 이 방법은 액체 상태에서 단백질의 질량 중심 확산 및 골격 및 측쇄 운동(내부 역학)을 모두 모니터링할 수 있습니다.
또한, 수화수 역학은 H2O로 수화된 과중수소화 단백질 분말을 사용하여 연구할 수 있습니다. 이 논문은 단백질 및 수화수 역학을 조사하기 위해 Institut Laue-Langevin(ILL)의 IN16B 기기에 사용된 워크플로를 제시합니다. 증기 교환을 이용한 용액 시료 및 수화된 단백질 분말 시료의 제조에 대해 설명합니다. 단백질 및 수화수 역학에 대한 데이터 분석 절차는 중성자 후방 산란 분광계에서 얻을 수 있는 다양한 유형의 데이터 세트(준탄성 스펙트럼 또는 고정 창 스캔)에 대해 설명됩니다.
이 방법은 아밀로이드 단백질과 관련된 두 가지 연구로 설명됩니다. 리소자임이 μm 크기의 구형 응집체(미립자로 표시됨)로 응집되는 것은 IN16B에서 조사된 공간 및 시간 범위에서 1단계 공정으로 발생하는 것으로 나타났지만 내부 역학은 변하지 않았습니다. 또한, 타우의 수화수의 역학은 과중수소화 단백질의 수화된 분말에 대해 연구되었다. 물의 병진 운동은 아밀로이드 섬유의 형성시 활성화되는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 프로토콜의 중요한 단계는 다른 실험적 생물물리학적 방법과 관련하여 역학 연구와 관련하여 중성자 산란이 어떻게 위치하는지에 대해 논의됩니다.

리소자임의 미립자 응집은 중수소화 완충액(pD 10.5에서 0.1M NaCl)에서 50mg/mL의 단백질 농도로 90°C에서 수행되었습니다. 미립자의 형성은 90°C로의 온도 상승에 의해 촉발되고 6시간 이내에 발생합니다(보충 그림 S8). 데이터 수집은 위의 프로토콜에 설명된 대로 IN16B에서 수행되었습니다(데이터는 ILL에 의해 영구적으로 큐레이팅되고 http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811 에서 액세스할 수 있?...

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High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

중성자 후방 산란 분광법은 단백질과 단백질의 수화수의 ps-ns 역학에 대한 비파괴적이고 표지 없는 접근을 제공합니다. 워크플로우는 아밀로이드 단백질에 대한 두 가지 연구, 즉 응집 중 리소자임의 시간 분해 역학과 섬유 형성 시 타우의 수화 물 역학에 대한 연구로 제공됩니다.

단백질과 수화수의 피코초-나노초 역학을 연구하기 위한 고분해능 중성자 분광법

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

중성자 후방 산란은 방사선 손상 없이 단백질과 수화수의 글로벌 확산 및 내부 역학을 측정합니다. 중성자 분광법은 분자 수준에서 공간 및 시간 상관 관계에 동시에 액세스합니다. 연질 물질 및 생물학적 물질에서 이러한 장거리 장애 시스템에 대한 지역 질서에 대한 간접적 인 정보를 얻는 것이 특히 흥미 롭습니다.따라서 중성자 후방 산란은 생물학, 화학 또는 물질적 의미에서 역학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또 다른 강력한 분야는 에너지이며, 예를 들어 배터리 및 연료 전지에 대한 연구가 있습니다. 중성자 후방 산란은 알츠하이머 및 파킨슨 병과 같은 신경 퇴행성 질환과 관련된 단백질의 분자 역학을 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다.얻은 결과는 이러한 병리의 분자적 특징을 더 잘 이해하는 데 도움이 되며 더 나은 진단을 개발할 수 있는 길을 열 수 있습니다. 샘플 홀더를 준비하려면 먼저 평평한 알루미늄 샘플 홀더와 인듐 와이어 씰 및 나사를 물로 철저히 세척한 다음 에탄올로 세척한 다음 건조시킵니다. 바닥, 뚜껑 및 인듐 와이어를 포함한 샘플 홀더의 다른 부분을 정밀 저울에서 개별적으로 칭량합니다.1밀리미터 인듐 와이어 씰을 샘플 홀더 하단 부분의 홈에 넣고 두 끝이 결합되는 부분에 작은 겹침을 남깁니다. 약 100mg의 동결건조된 단백질을 첨가하여 시료 홀더 하단 부분의 내부 표면을 채웁니다. 다음으로, 오산화인 분말이 들어 있는 페트리 접시가 있는 데시케이터에 샘플 홀더를 24시간 동안 넣어 단백질 분말을 완전히 건조시킵니다.인듐 시일 및 건조된 분말을 함유하는 샘플 홀더의 건조된 바닥 부분을 칭량하여 건조된 샘플의 질량을 얻는다. 데시케이터에서 오산화인을 제거하고 분말을 수화하기 위해 내부에 산화중수소와 샘플이 포함된 페트리 접시를 넣습니다. 완전한 수소에서 중수소로의 교환을 위해 건조 및 수화를 세 번 반복합니다.분말 질량을 정기적으로 측정하여 수화 수준을 확인하고 수화가 원하는 수준보다 약간 높으면 질량이 천천히 감소할 때까지 기다립니다. 원하는 수분이 확보되면 신속하게 뚜껑을 하단 부분에 놓고 4개의 나사로 샘플 홀더를 먼저 닫아 증기 교환을 중지합니다. 바닥 부분과 뚜껑 사이에 틈이 보이지 않을 때까지 나머지 나사를 모두 놓고 조입니다.밀봉된 샘플 홀더의 무게를 측정하여 중성자 실험 후 누출로 인한 잠재적인 수화 손실이 있는지 확인합니다. 액체 상태 샘플을 준비하려면 단백질을 중수소화 완충액에 용해시킵니다. 물을 사용하여 샘플 홀더에 넣을 적절한 양의 액체를 결정합니다.물질을 취급하기 전에 전리 방사선량이 시간당 100마이크로시버트 미만인지 확인하십시오. 그런 다음 샘플 스틱을 완전히 건조시키고 이전 샘플을 제거합니다. 샘플 스틱에 샘플을 놓고 빔 중심을 기준으로 적절한 센터링을 확인한 다음 샘플 스틱을 극저온 가열로에 삽입합니다.Nomad에서 데이터를 수집하려면 실행 탭으로 이동하여 퍼니스 저온 유지 장치 컨트롤러를 런치패드로 끌어다 놓습니다. 온도를 200켈빈으로 설정합니다. 온도가 안정화될 시간을 갖도록 빠른 모드와 30분의 시간 초과를 사용합니다.리프레셔 아이콘을 클릭하여 온도가 감소하는 동안 데이터 수집을 위해 백그라운드에서 온도 램프를 실행합니다. IN16 도플러 설정 컨트롤러를 런치패드로 끌어다 놓습니다. 속도 프로파일을 정확한 속도로 설정하고, 최대 델타 E로 설정하고, 에너지 오프셋을 0.00 마이크로 전자 볼트로, 채널 수를 128로 설정하여 탄성 고정 창 스캔 구성을 얻습니다.카운트 컨트롤러를 런치패드로 끌어다 놓고, 데이터를 쉽게 식별할 수 있는 이름으로 자막 필드를 채우고, 60회 반복으로 30초의 스캔을 설정합니다. 그런 다음 IN16 도플러 설정 컨트롤러를 런치패드로 끌어다 놓습니다. 속도 프로파일을 sign으로 설정하고, 속도를 초당 4.5미터의 값으로 설정하고, 채널 수를 2048로 설정하여 유사 탄성 중성자 산란 구성을 얻습니다.카운트 컨트롤러를 드래그 앤 드롭하고 데이터를 쉽게 식별할 수 있는 이름으로 자막 필드를 채웁니다. 4 회 반복으로 30 분 동안 스캔을 설정하십시오. 온도 램프의 경우 퍼니스 저온 유지 컨트롤러 컨트롤러를 끌어다 놓고 온도를 310켈빈으로 설정한 다음 램프를 6초 동안 델타 0.05켈빈의 설정점으로 설정합니다.200분의 제한 시간을 사용합니다. 65회 반복되는 for 루프를 사용합니다. 내부에 IN16 도플러 설정 컨트롤러를 삽입한 다음 카운트 컨트롤러를 삽입하고 30초의 단일 스캔을 설정합니다.그런 다음 앞에서 설명한 대로 IN16 도플러 설정을 삽입하되 1.5마이크로 전자볼트 및 1024채널의 에너지 오프셋을 사용합니다. 그런 다음 카운트 컨트롤러를 삽입하고 3분의 단일 스캔을 설정합니다. 312켈빈의 마지막 준탄성 중성자 산란을 얻으려면 앞에서 설명한 대로 구성된 IN16 도플러 설정 및 카운트 컨트롤러를 끌어다 놓습니다.그런 다음 시작 버튼을 눌러 스크립트를 실행합니다. 리소좀 탄성 및 비탄성 고정 창 스캔은 낮은 운동량 전달 및 낮은 에너지 전달에서 신호의 증가를 보인 반면, 높은 에너지 전달 및 낮은 운동량 전달에서의 신호는 감소했습니다. 질량 확산 계수의 초기 중심은 나노초당 15옹스트롬 제곱이었고, 시간이 지남에 따라 기하급수적으로 감소했습니다.220 켈빈보다 높은 온도에서, 타우 섬유 주위의 수화수는 타우 단량체 주위보다 훨씬 더 이동성이 있었다. 병진 운동을 하는 물 분자의 분율과 물 분자의 병진 및 회전 확산 계수는 섬유 주변에서 증가했습니다. 단백질 농도는 중성자 플럭스 또는 샘플 홀더 완충액 배경의 중성자 후방 산란 제한으로 인해 ml당 2000mg 또는 단백질화된 단백질의 경우 ml당 최소 20mg이어야 합니다.예를 들어, 중성자 후방 산란은 천연 환경 단백질인 물이 약물 전달과 같은 생체 기술 응용을 위해 합성 고분자로 완전히 대체될 수 있는 방법을 이해하기 위해 최근에 적용되었습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

연구

생화학

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

체 외 형광 공명 에너지 전달에 밀리초 시간 규모에서 단백질 복합물의 역학을 공부 하는 사용 하 여

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

BN-MS 분석에 의한 고분해능 컴플렉스 프로파일링

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

단일 세포 약물 섭취, 신진 대사 및 효과를 연구하기 위한 통합 라만 분광법 및 질량 분광법 플랫폼

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

성숙한 쌀의 횡단 단면(오리자 사티 라 L.) 파이펫 팁을 사용하여 전자 현미경 이미징을 스캐닝하기 위한 커널

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

DNA 단백질 상호 작용을 연구하는 CD 분광법

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...