Name: high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water
Uploaded: 2022-04-28T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water at JoVE.com

Forfatterne er takknemlige for Michaela Zamponi ved Jülich Centre for Neutron Science ved Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Tyskland, for en del av nøytronspredningseksperimentene som ble utført på instrumentet SPHERES. Dette arbeidet har dratt nytte av aktivitetene til Deuteration Laboratory (DLAB) konsortiet finansiert av EU under kontraktene HPRI-2001-50065 og RII3-CT-2003-505925, og fra UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) -finansiert aktivitet innenfor Institut Laue Langevin EMBL DLAB under Grants GR / R99393/01 og EP / C015452 / 1. Støtte fra EU-kommisjonen under det 7. rammeprogrammet gjennom Key Action: Strengthening the European Research Area, Research Infrastructures er anerkjent [Contract 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot og Christian Beck takker det føderale utdannings- og forskningsdepartementet (BMBF, stipendnummer 05K19VTB) for finansiering av deres postdoktorale stipend.

1. Forbered den deutererte bufferen for proteiner i flytende tilstand
<ol><li>Oppløs alle komponentene i bufferen i ren D2O.</li>
	<li>Hvis pH-elektroden ble kalibrert i H2O, juster pD i henhold til formelen pD = pH + 0,4 ved bruk av NaOD eller DCl34. MERK: Bruk av D 2 Oi stedet for H2O kan påvirke proteinløseligheten og bufferbetingelsene må kanskje tilpasses (f.eks. ved en liten endring i saltkonsentrasjonen).</li>
</ol><p cla...

Nøytronspektroskopi er den eneste metoden som gjør det mulig å undersøke ensemble-gjennomsnittlig ps-ns-dynamikk av proteinprøver uavhengig av størrelsen på proteinet eller kompleksiteten til løsningen når deuterasjon brukes6. Spesielt, ved å undersøke selvdiffusjon av proteinsammensetninger i løsning, kan den hydrodynamiske størrelsen på slike samlinger entydig bestemmes. Likevel er metoden vanligvis begrenset av den lave nøytronfluksen, noe som innebærer lange innsamlingstider og...

Nøytronet er en ladningsløs og massiv partikkel som har blitt brukt gjennom årene til å undersøke prøver på ulike felt fra grunnleggende fysikk til biologi1. For biologiske anvendelser er småvinklet nøytronspredning, uelastisk nøytronspredning og nøytronkrystallografi og reflektometri mye brukt 2,3,4. Uelastisk nøytronspredning gir en ensemble-gjennomsnittlig måling av dynamikken uten å kreve spesifikk merking i seg selv, og en signalkvalitet som ikke avhenger av størrelsen eller proteinet5. Målingen kan gjøres ved hjelp av et svært komplekst miljø for proteinet som studeres som etterligner det intracellulære mediet, for eksempel et deuterert bakterielt lysat eller til og med in vivo 3,6,7. Ulike eksperimentelle oppsett kan brukes til å studere dynamikken, nemlig i) time-of-flight-gi tilgang til sub-ps-ps-dynamikk, ii) backscattering-gi tilgang til ps-ns dynamikk, og iii) spin-echo-gi tilgang til dynamikk fra ns til hundrevis av ns. Nøytron-backscattering gjør bruk av Braggs lov 2d sinθ = nλ, hvor d er avstanden mellom plan i en krystall, θ spredningsvinkelen, n spredningsrekkefølgen og λ bølgelengden. Bruken av krystaller for tilbakespredning mot detektorene gjør det mulig å oppnå en høy oppløsning i energi, typisk ~0,8 μeV. For å måle energiutvekslingen brukes enten en Doppler-stasjon som bærer en krystall i tilbakespredning til å definere og justere den innkommende nøytronbølgelengden 8,9,10 (figur 1), eller et flytidsoppsett kan brukes på bekostning av en reduksjon i energioppløsning 11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63664/63664fig01.jpg"> Figur 1: Skisse av et nøytron-tilbakespredningsspektrometer med dopplerdrift. Den innkommende strålen treffer faseromtransformasjonen (PST) helikopter42, noe som øker fluksen ved prøveposisjonen. Den blir deretter tilbakespredt mot prøven av Doppler-stasjonen, som velger en energi E1 (cyan pil). Nøytronene blir deretter spredt av prøven (med forskjellige energier representert ved pilens farge) og analysatorene, laget av Si 111-krystaller, vil bare tilbakespre nøytroner med en spesifikk energi E0 (rødfargede piler her). Derfor oppnås momentumoverføringen q fra den oppdagede posisjonen til nøytronet på detektormatrisen, og energioverføringen oppnås fra forskjellen E1- E0. Flytiden som forventes for nøytronpulsen produsert av PST, brukes til å forkaste signalet fra nøytronene spredt direkte mot detektorrørene. Forkortelse: PST = faseromtransformasjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63664/63664fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
For tilbakespredningsspektroskopi kommer hovedbidraget til signalet fra hydrogenprotonrike prøver, slik som proteiner, fra usammenhengende spredning, for hvilken spredningsintensiteten Sinc(q, ω) er vist ved Eq (1)12
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)
Hvor σinc er det usammenhengende tverrsnittet av elementet som vurderes, er k' normen for den spredte bølgevektoren, k normen for den innkommende bølgevektoren, q (= k - k') momentumoverføringen, r j (t) posisjonsvektoren til atom j på tidspunkt t, og ω frekvensen som tilsvarer energioverføringen mellom det innkommende nøytronet og systemet. Vinkelparentesene angir ensemblegjennomsnittet. Derfor sonderer inkoherent spredning ensemble-gjennomsnittlig enkeltpartikkel selvkorrelasjon av atomposisjoner med tiden og gir selvdynamikken gjennomsnittet over alle atomer i systemet og forskjellige tidsopprinnelser (ensemblegjennomsnitt). Spredningsfunksjonen er Fouriertransformasjonen i tid for den mellomliggende spredningsfunksjonen I (q, t), som kan sees på som Fourier-transformasjonen i rommet til van Hove-korrelasjonsfunksjonen vist ved Eq (2):
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
Hvor ρ(r,t) er sannsynlighetstettheten for å finne et atom i posisjon r og tid t 13.
For en Fickian diffusjonsprosess resulterer selvdiffusjonsfunksjonen (se Eq (3)) etter en dobbel Fourier-transformasjon i en spredningsfunksjon bestående av en Lorentzian med linjebredde gitt ved γ = Dq2.
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq10.jpg" style="margin: auto;"> (3)
Mer sofistikerte modeller ble utviklet og funnet nyttige, for eksempel hoppdiffusjonsmodellen av Singwi og Sjölander for ps-ns intern proteindynamikk14 eller rotasjonsmodellen av Sears for hydreringsvann15,16,17.
På nøytronbackscattering-instrumentet (NBS) IN16B8,9 ved ILL, Grenoble, Frankrike (tilleggsfigur S1), består et oppsett som vanligvis brukes med proteiner av Si 111-krystaller for analysatorene med en Doppler-stasjon for innstilling av den innkommende bølgelengden (tilleggsfigur S2A), og gir dermed tilgang til momentumoverføringsområdet ~0,2 Å-1 < q < ~2 Å-1 og energioverføringsområde på -30 μeV < <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> < 30 μeV-tilsvarende tidsskalaer fra noen få ps til noen få ns og avstander på noen få Å. I tillegg tilbyr IN16B muligheten til å utføre elastiske og uelastiske skanninger med faste vinduer (E/IFWS)10, som inkluderer datainnsamling ved en fast energioverføring. Siden fluksen er begrenset ved arbeid med nøytroner, tillater E / IFWS maksimering av fluksen for en energioverføring, og reduserer dermed innsamlingstiden som trengs for å oppnå et tilfredsstillende signal-støyforhold. Et nyere alternativ er backscattering and time-of-flight spectrometer (BATS) modus11, som tillater måling av et bredt spekter av energioverføringer, (f.eks. -150 μeV < < <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> 150 μeV), med en høyere fluks enn med Doppler-stasjonen, men på bekostning av en lavere energioppløsning (tilleggsfigur S2B).
En viktig egenskap ved nøytronspredning er at det usammenhengende tverrsnittet σinc har en 40 ganger høyere verdi for hydrogen enn for deuterium og er ubetydelig for andre elementer som ofte finnes i biologiske prøver. Derfor kan dynamikken til proteiner i et flytende miljø studeres ved å bruke en deuterert buffer, og pulvertilstanden tillater studier av enten proteinintern dynamikk med hydrogenert proteinpulver hydrert med D 2 O, eller studiet av hydreringsvann for perdeuterert proteinpulver hydrert med H2O. I flytende tilstand tillater nøytron-backscattering vanligvis samtidig tilgang til massesenteret selvdiffusjon av proteiner (Fickian-type diffusjon) og deres indre dynamikk. Sistnevnte er ryggrads- og sidekjedebevegelser som vanligvis beskrives av den såkalte hoppdiffusjonsmodellen eller andre 3,18. I hydrogenerte proteinpulver er proteindiffusjonen fraværende, og bare intern dynamikk må modelleres. For hydreringsvann presenterer bidragene fra translasjons- og rotasjonsbevegelser av vannmolekyler en annen avhengighet av momentumoverføringen q, noe som gjør det mulig å skille dem i dataanalyseprosessen17.
Dette papiret illustrerer nøytron-backscattering-metoden med studiet av proteiner som ble funnet å kunne utfolde seg, aggregere til en kanonisk form bestående av stabler av β-tråder - det såkalte kryss-β mønsteret19,20 - og danne langstrakte fibre. Dette er den såkalte amyloidaggregeringen, som er grundig studert på grunn av sin sentrale rolle i nevrodegenerative lidelser som Alzheimers eller Parkinsons sykdommer21,22. Studien av amyloidproteinene er også motivert av den funksjonelle rollen de kan spille 23,24 eller deres høye potensial for utvikling av nye biomaterialer25. De fysisk-kjemiske determinantene for amyloidaggregeringen er fortsatt uklare, og ingen generell teori om amyloidaggregering er tilgjengelig, til tross for enorm fremgang de siste årene21,26.
Amyloidaggregering innebærer endringer i proteinstruktur og stabilitet med tiden, hvis studie naturlig innebærer dynamikk, knyttet til proteinkonformasjonsstabilitet, proteinfunksjon og proteinenergilandskap27. Dynamikk er direkte knyttet til stabiliteten til en bestemt tilstand gjennom det entropiske bidraget for de raskeste bevegelsene28, og proteinfunksjonen kan opprettholdes av bevegelser på forskjellige tidsskalaer fra sub-ps for lysfølsomme proteiner29 til ms for domenebevegelser, noe som kan tilrettelegges av picosekund-nanosekunddynamikk30.
To eksempler på bruk av nøytron-tilbakespredningsspektroskopi for å studere amyloidproteiner vil bli presentert, en i flytende tilstand for å studere proteindynamikk og en i hydrert pulvertilstand for å studere hydreringsvanndynamikk. Det første eksemplet gjelder aggregering av lysozym i μm størrelse sfærer (kalt partikler) fulgt i sanntid5, og den andre en sammenligning av vanndynamikk i innfødte og aggregerte tilstander av det humane protein tau31.
Lysozym er et enzym involvert i immunforsvar og består av 129 aminosyrerester. Lysozym kan danne partikler i deuterert buffer ved pD på 10,5 og ved en temperatur på 90 °C. Med nøytronspredning viste vi at tidsutviklingen av lysozymets senter-av-massediffusjonskoeffisient følger den enkle eksponentielle kinetikken til tioflavin T-fluorescens (en fluorescerende sonde som brukes til å overvåke dannelsen av amyloid kryss-β mønstre32), noe som indikerer at dannelsespartikkelformige overbygninger og kryss-β-mønstre forekommer i et enkelt trinn med samme hastighet. Videre forble den interne dynamikken konstant gjennom aggregeringsprosessen, noe som kan forklares enten ved en rask konformasjonsendring som ikke kan observeres på NBS-instrumenter, eller ved fravær av signifikant endring i proteinintern energi ved aggregering.
Det humane proteinet tau er et egenordnet protein (IDP) som består av 441 aminosyrer for den såkalte 2N4R isoformen, som er spesielt involvert i Alzheimers sykdom33. Ved å bruke nøytron-backscattering på pulver av perdeuterert protein tau, viste vi at hydreringsvanndynamikken økes i fibertilstanden, med en høyere populasjon av vannmolekyler som gjennomgår translasjonsbevegelser. Resultatet antyder at en økning i hydreringsvannentropi kan drive amyloidflimmer av tau.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum sample holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, &#8805;99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td> 
			543047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D, 99.9%)</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>DLM-4DR-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning high-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.5901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 75871-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator plate, 140 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>00470.G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nPDyn</td>
			<td></td>
			<td>v3.x</td>
			<td>see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>92641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 0.5-10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 100-1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 20-200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-0206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>372072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water

Nøytronspredning gir mulighet til å undersøke dynamikken i prøver for et bredt spekter av energier på en ikke-destruktiv måte og uten annen merking enn deuterium. Spesielt registrerer nøytronbackspredningsspektroskopi spredningssignalene ved flere spredningsvinkler samtidig og er godt egnet til å studere dynamikken til biologiske systemer på ps-ns-tidsskalaen. Ved å benytte D2O - og muligens deutererte bufferkomponenter - tillater metoden overvåking av både massesenterdiffusjon og ryggrads- og sidekjedebevegelser (intern dynamikk) av proteiner i flytende tilstand.
I tillegg kan hydreringsvanndynamikk studeres ved å bruke pulver av perdeutererte proteiner hydrert med H2O. Denne artikkelen presenterer arbeidsflyten som brukes på instrumentet IN16B ved Institut Laue-Langevin (ILL) for å undersøke protein- og hydreringsvanndynamikk. Fremstilling av løsningsprøver og hydrerte proteinpulverprøver ved bruk av damputveksling blir forklart. Dataanalyseprosedyren for både protein- og hydreringsvanndynamikk er beskrevet for forskjellige typer datasett (kvasielastiske spektra eller fastvindusskanninger) som kan oppnås på et nøytron-tilbakespredningsspektrometer.
Metoden er illustrert med to studier som involverer amyloidproteiner. Aggregeringen av lysozym i μm størrelse sfæriske aggregater - betegnet partikler - er vist å forekomme i en ett-trinns prosess på rom- og tidsområdet undersøkt på IN16B, mens den interne dynamikken forblir uendret. Videre ble dynamikken i hydreringsvann av tau studert på hydrerte pulver av perdeuterert protein. Det er vist at translasjonsbevegelser av vann aktiveres ved dannelse av amyloidfibre. Til slutt diskuteres kritiske trinn i protokollen om hvordan nøytronspredning er posisjonert med hensyn til studiet av dynamikk i forhold til andre eksperimentelle biofysiske metoder.

Aggregering av lysozym til partikler ble utført ved 90 °C med en proteinkonsentrasjon på 50 mg/ml i en deuterert buffer (0,1 M NaCl ved pD 10,5). Dannelsen av partikler utløses av temperaturøkningen til 90 °C og skjer innen 6 timer (tilleggsfigur S8). Datainnsamlingen ble utført på IN16B, som beskrevet i protokollen ovenfor (dataene er permanent kuratert av ILL og tilgjengelig på http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).
Et QENS-spektrum ble ervervet ved 7 °C for...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water at JoVE.com

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Nøytron-tilbakespredningsspektroskopi gir en ikke-destruktiv og etikettfri tilgang til ps-ns-dynamikken til proteiner og deres hydreringsvann. Arbeidsflyten presenteres med to studier på amyloidproteiner: på lysozymets tidsoppløste dynamikk under aggregering og på hydreringsvanndynamikken til tau ved fiberdannelse.

Høyoppløselig nøytronspektroskopi for å studere picosekund-nanosekunddynamikk av proteiner og hydreringsvann

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Nøytronbackscatterings måler global diffusjon og indre dynamikk av proteiner og hydreringsvann uten strålingsskader. Nøytronspektroskopi får samtidig tilgang til romlige og tidskorrelasjoner på molekylært nivå. I myk materie og biologisk materiale er det spesielt interessant å få indirekte informasjon om lokal orden på disse langdistanseforstyrrelsessystemene.Så nøytron-backscattering kan brukes til å studere dynamikk i biologi, kjemi eller materiell forstand. Et annet sterkt felt er energi, med studier, for eksempel på batterier og brenselceller. Nøytron-backscattering har blitt brukt med hell for å studere molekylær dynamikk av proteiner involvert i nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers og Parkinsons.De oppnådde resultatene hjelper oss å forstå bedre de molekylære kjennetegnene til disse patologiene og kan bane vei for å utvikle bedre diagnostikk. For å klargjøre prøveholderen, start med å rengjøre en flat aluminiumsprøveholder og dens indiumtrådforsegling og skruer grundig med vann, etterfulgt av etanol, og la den tørke. Vei de forskjellige delene av prøveholderen, inkludert bunn, lokk og indiumtråd, separat på en presisjonsvekt.Plasser en millimeter indiumtrådforsegling i sporet på den nederste delen av prøveholderen, og la det være en liten overlapping der de to endene går sammen. Tilsett rundt 100 milligram lyofilisert protein slik at det fyller den indre overflaten av den nederste delen av prøveholderen. Deretter plasserer du prøveholderen i en tørketrommel med en petriskål som inneholder fosforpentoksidpulver i 24 timer for å tørke proteinpulveret helt.Vei den tørkede bunndelen av prøveholderen som inneholder indiumforseglingen og det tørkede pulveret for å oppnå massen av den tørkede prøven. Fjern fosforpentoksidet fra tørketrommelen og legg en petriskål med deuteriumoksid samt prøven inni for å hydrere pulveret. Gjenta tørking og hydrering tre ganger for fullstendig hydrogen til deuteriumutveksling.Mål pulvermassen regelmessig for å kontrollere hydreringsnivået, og når hydreringen er litt over ønsket nivå, vent til massen synker sakte. Når ønsket hydrering er oppnådd, legg lokket raskt på bunndelen og lukk prøveholderen først med fire skruer for å stoppe damputvekslingen. Plasser og stram alle gjenværende skruer til det ikke er synlig mellomrom mellom bunndelen og lokket.Vei den forseglede prøveholderen for å se etter potensielt hydreringstap via lekkasjer etter nøytroneksperimentet. For å klargjøre væsketilstandsprøven, oppløs proteinet i den deutererte bufferen. Bruk vann til å bestemme passende volum væske som skal settes i prøveholderen.Før du håndterer noe materiale, må du sørge for at den ioniserende stråledosen er mindre enn 100 mikrosievert per time. Tørk deretter prøvepinnen grundig og fjern eventuelle tidligere prøver. Plasser prøven på prøvepinnen, kontroller riktig sentrering i forhold til strålesenteret, og sett prøvepinnen inn i kryoovnen.For å hente data i Nomad, gå til utførelsesfanen og dra og slipp en ovnkryostatkontroller i lanseringsplaten. Sett temperaturen til 200 Kelvin. Bruk hurtigmodus og et tidsavbrudd på 30 minutter slik at temperaturen har tid til å stabilisere seg.Klikk på oppfriskningsikonet for å kjøre temperaturrampen i bakgrunnen for datainnsamling under temperaturnedgangen. Dra og slipp IN16 Doppler-innstillingskontrolleren til startflaten. Sett hastighetsprofilen til nøyaktig hastighet, settet med til maks delta E, energiforskyvningen til 0,00 mikroelektronvolt og antall kanaler til 128 for å oppnå en elastisk konfigurasjon for faste vindusskanninger.Dra og slipp en tellekontroller i startflaten, fyll undertekstfeltet med et navn som gjør det enkelt å identifisere dataene, og angi skanninger på 30 sekunder med 60 repetisjoner. Deretter drar og slipper du IN16 Doppler-innstillingskontrolleren til startflaten. Sett hastighetsprofilen til å signere, sett med å øke hastigheten med en verdi på 4,5 meter per sekund, og antall kanaler til 2048 for å oppnå en kvasi-elastisk nøytronspredningskonfigurasjon.Dra og slipp en tellekontroller og fyll undertekstfeltet med et navn som gjør det enkelt å identifisere dataene. Sett skanninger på 30 minutter med fire repetisjoner. For temperaturrampen, dra og slipp en ovnkryostatkontroller, sett temperaturen til 310 Kelvin, og sett rampen til settpunkt med et delta på 0,05 Kelvin i seks sekunder.Bruk et tidsavbrudd på 200 minutter. Bruk en for-sløyfe med 65 repetisjoner. Sett inn en IN16 doppler-innstillingskontroller, etterfulgt av tellekontrolleren og sett en enkelt skanning på 30 sekunder.Deretter setter du inn IN16 Doppler-innstillinger som beskrevet tidligere, men bruker en energiforskyvning på 1,5 mikro elektronvolt og 1024 kanaler. Sett deretter inn tellekontrolleren og angi en enkelt skanning på tre minutter. For å få den siste kvasi-elastiske nøytronspredningen på 312 Kelvin, dra og slipp IN16 Doppler-innstillingene og tellekontrollerne konfigurert som vist tidligere.Trykk deretter på startknappen for å kjøre skriptet. Lysosomets elastiske og uelastiske faste vindusskanninger viste en økning i signal ved lav momentumoverføring og lav energioverføring, mens signalet ved høy energioverføring og lav momentumoverføring avtok. Det opprinnelige senteret for massediffusjonskoeffisient var 15 angstrom kvadrert per nanosekund, som deretter ble eksponentielt redusert over tid.Ved temperaturer høyere enn 220 Kelvin var hydratiseringsvannet rundt tau-fibrene betydelig mer mobilt enn rundt tau-monomerene. Fraksjonen av vannmolekyler som gjennomgår translasjonsbevegelse og både translasjons- og rotasjonsdiffusjonskoeffisientene til vannmolekylene ble økt rundt fibrene. Proteinkonsentrasjonen bør være 2000 mg per ml eller minst 20 milligram per ml for proteinerte proteiner på grunn av nøytronryggspredningsbegrensninger fra nøytronfluks eller prøveholderbufferbakgrunn.Nøytron-backscattering har nylig blitt brukt, for eksempel for å forstå hvordan vann, som er de naturlige miljøproteinene, kan erstattes fullt ut av en syntetisk polymer for bioteknologisk anvendelse som for eksempel legemiddellevering.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nuclear Magnetic Resonance spektroskopi for identifisering av flere Phosphorylations med egen Uordnede Proteiner

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Høyoppløselig enkeltpartikkelanalyse fra elektronkryomikroskopi bilder ved hjelp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering av proteiner for ett molekyl Force spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Måle interaksjoner Globular og trådformede proteiner av kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi (NRM) og Mikroskala Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Høyoppløselig Complexome profilering av Cryoslicing BN-MS analyse

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

En integrert Raman spektroskopi og Mass massespektrometri Platform å studere single-Cell Drug opptak, metabolisme, og effekter

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tverrgående seksjonering av eldre ris (Oryza sativa L.) Kjerner for skanning av elektronmikroskopiavbildning ved hjelp av pipettespisser som immobiliseringsstøtte

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Tofarget fluorescens krysskorrelasjonsspektroskopi for å studere proteinproteininteraksjon og proteindynamikk i levende celler

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

CD-spektroskopi for å studere DNA-proteininteraksjoner

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...