Name: high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water
Uploaded: 2022-04-28T13:10:00
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Os autores são gratos a Michaela Zamponi, do Jülich Centre for Neutron Science no Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Alemanha, por parte dos experimentos de espalhamento de nêutrons realizados no instrumento SPHERES. Este trabalho beneficiou das actividades do consórcio Deuteration Laboratory (DLAB) financiado pela União Europeia ao abrigo dos contratos HPRI-2001-50065 e RII3-CT-2003-505925, e da actividade financiada pelo UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) no âmbito do Institut Laue Langevin EMBL DLAB ao abrigo das subvenções GR/R99393/01 e EP/C015452/1. É reconhecido o apoio da Comissão Europeia no âmbito do 7.º Programa-Quadro através da Acção-chave: Reforçar o Espaço Europeu da Investigação, as infraestruturas de investigação [Contrato 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot e Christian Beck agradecem ao Ministério Federal de Educação e Pesquisa (BMBF, bolsa número 05K19VTB) pelo financiamento de suas bolsas de pós-doutorado.

1. Preparar o tampão deuterado para proteínas no estado líquido
<ol><li>Dissolva todos os componentes do tampão em D2O puro.</li>
	<li>Se o eletrodo de pH foi calibrado em H2O, ajustar o pD de acordo com a fórmula pD = pH + 0,4 usando NaOD ou DCl34. NOTA: A utilização de D2 O em vez de H2O pode afectar a solubilidade das proteínas e as condições de tampão poderão ter de ser adaptadas (por exemplo, por uma ligeira altera?...

A espectroscopia de nêutrons é o único método que permite sondar a dinâmica ps-ns média do conjunto de amostras de proteínas, independentemente do tamanho da proteína ou da complexidade da solução quando a deuteração é usada6. Especificamente, investigando a autodifusão de conjuntos de proteínas em solução, o tamanho hidrodinâmico de tais montagens pode ser determinado de forma inequívoca. No entanto, o método é comumente limitado pelo baixo fluxo de nêutrons, o que implica l...

O nêutron é uma partícula massiva e sem carga que tem sido usada com sucesso ao longo dos anos para sondar amostras em vários campos, da física fundamental à biologia1. Para aplicações biológicas, o espalhamento de nêutrons a baixo ângulo, o espalhamento inelástico de nêutrons, a cristalografia e a reflectometria de nêutronssão extensivamente utilizados 2,3,4. O espalhamento inelástico de nêutrons fornece uma medida média da dinâmica sem a necessidade de marcação específica per se, e uma qualidade de sinal que não depende do tamanho ou da proteína5. A medida pode ser feita utilizando um ambiente de alta complexidade para a proteína em estudo que mimetiza o meio intracelular, como um lisado bacteriano deuterado ou mesmo invivo3,6,7. Diferentes configurações experimentais podem ser usadas para estudar a dinâmica, a saber: i) tempo de voo dando acesso à dinâmica sub-ps-ps, ii) retroespalhamento-dando acesso à dinâmica ps-ns, e iii) spin-eco-dando acesso à dinâmica de ns a centenas de ns. O retroespalhamento de nêutrons faz uso da lei de Bragg 2d sinθ = nλ, onde d é a distância entre planos em um cristal, θ o ângulo de espalhamento, n a ordem de espalhamento e λ o comprimento de onda. O uso de cristais para retroespalhamento em direção aos detectores permite alcançar uma alta resolução de energia, tipicamente ~0,8 μeV. Para medir a troca de energia, um drive Doppler carregando um cristal em retroespalhamento é usado para definir e sintonizar o comprimento de onda de nêutrons de entrada 8,9,10 (Figura 1), ou uma configuração de tempo de voo pode ser usada ao custo de uma diminuição na resolução de energia 11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63664/63664fig01.jpg"> Figura 1: Esboço de um espectrômetro de retroespalhamento de nêutrons com acionamento Doppler. O feixe de entrada atinge o chopper42 de transformação do espaço de fase (PST), o que aumenta o fluxo na posição da amostra. Em seguida, ele é retroespalhado em direção à amostra pelo drive Doppler, que seleciona uma energia E1 (seta ciano). Os nêutrons são então espalhados pela amostra (com diferentes energias representadas pela cor das setas) e os analisadores, feitos de cristais de Si 111, só retroespalharão nêutrons com uma energia específica E0 (setas de cor vermelha aqui). Assim, a transferência de momento q é obtida a partir da posição detectada do nêutron no arranjo do detector, e a transferência de energia é obtida a partir da diferença E1- E0. O tempo de voo esperado para o pulso de nêutrons produzido pelo PST é usado para descartar o sinal dos nêutrons espalhados diretamente em direção aos tubos do detector. Abreviação: PST = transformação do espaço de fase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63664/63664fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para a espectroscopia de retroespalhamento, a principal contribuição para o sinal de amostras ricas em prótons de hidrogênio, como proteínas, vem do espalhamento incoerente, para o qual a intensidade de espalhamento Sinc(q, ω) é mostrada por Eq (1)12
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1º)
Onde σinc é a seção transversal incoerente do elemento considerado, k' é a norma do vetor de onda disperso, k a norma do vetor de onda de entrada, q (= k - k') a transferência de momento, r j(t) o vetor de posição do átomo j no tempo t, e ω a frequência correspondente à transferência de energia entre o nêutron de entrada e o sistema. Os colchetes angulares denotam a média do conjunto. Assim, o espalhamento incoerente sonda a autocorrelação de partícula única média do conjunto das posições dos átomos com o tempo e fornece a autodinâmica média sobre todos os átomos no sistema e diferentes origens de tempo (média do conjunto). A função de espalhamento é a transformada de Fourier no tempo da função de espalhamento intermediário I(q, t), que pode ser vista como a transformada de Fourier no espaço da função de correlação de van Hove mostrada por Eq (2):
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2º)
Onde ρ(r,t) é a densidade de probabilidade de encontrar um átomo na posição r e no tempo t 13.
Para um processo de difusão fickiano, a função de autodifusão resulta (ver Eq (3)) após uma transformada dupla de Fourier em uma função de espalhamento consistindo em um Lorentziano de largura de linha dado por γ = Dq2.
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq10.jpg" style="margin: auto;"> (3º)
Modelos mais sofisticados foram desenvolvidos e considerados úteis, como o modelo de difusão por salto de Singwi e Sjölander para dinâmica interna de proteínas ps-ns14 ou o modelo de rotação por Sears para água de hidratação15,16,17.
No instrumento de retroespalhamento de nêutrons (NBS) IN16B 8,9 no ILL, Grenoble, França (Figura Suplementar S1), uma configuração comumente usada com proteínas consiste em cristais de Si 111 para os analisadores com um drive Doppler para sintonizar o comprimento de onda de entrada (Figura Suplementar S2A), dando acesso à faixa de transferência de momento ~0,2 Å-1 < q < ~2 Å-1 e faixa de transferência de energia de -30 μeV < <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> < 30 μeV-correspondente a escalas de tempo que variam de alguns ps a alguns ns e distâncias de alguns Å. Além disso, o IN16B oferece a possibilidade de realizar varreduras de janela fixa elástica e inelástica (E/IFWS)10, que incluem a aquisição de dados em uma transferência de energia fixa. Como o fluxo é limitado quando se trabalha com nêutrons, o E/IFWS permite maximizar o fluxo para uma transferência de energia, reduzindo assim o tempo de aquisição necessário para obter uma relação sinal-ruído satisfatória. Uma opção mais recente é o modo11 do espectrômetro de retroespalhamento e tempo de voo (BATS), que permite a medição de uma ampla faixa de transferências de energia (por exemplo, -150 μeV < < <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> 150 μeV), com um fluxo maior do que com o acionamento Doppler, mas ao custo de uma resolução de energia menor (Figura Suplementar S2B).
Uma propriedade importante do espalhamento de nêutrons é que a seção transversal incoerente σinc tem um valor 40 vezes maior para o hidrogênio do que para o deutério e é insignificante para outros elementos comumente encontrados em amostras biológicas. Portanto, a dinâmica de proteínas em ambiente líquido pode ser estudada usando um tampão deuterado, e o estado de pó permite o estudo da dinâmica interna de proteínas com proteína hidrogenada em pó hidratadacom D 2 O, ou o estudo de água de hidratação para proteína perdeuterada em pó hidratada com H2O. No estado líquido, o retroespalhamento de nêutrons normalmente permite o acesso simultâneo do centro de massa de autodifusão de proteínas (difusão tipo fickiano) e sua dinâmica interna. Estes últimos são movimentos da espinha dorsal e da cadeia lateral usualmente descritos pelo chamado modelo de salto-difusãoou outros3,18. Em pós de proteína hidrogenada, a difusão da proteína está ausente e apenas a dinâmica interna precisa ser modelada. Para a água de hidratação, as contribuições dos movimentos de translação e rotação das moléculas de água apresentam uma dependência diferente da transferência de momento q, o que permite sua distinção no processo de análise dos dados17.
Este trabalho ilustra o método de retroespalhamento de nêutrons com o estudo de proteínas que se mostraram capazes de se desdobrar, agregar em uma forma canônica composta por pilhas de fitas de β - o chamado padrão de β cruzada19,20 - e formar fibras alongadas. Trata-se da chamada agregação amiloide, que é extensivamente estudada devido ao seu papel central em doenças neurodegenerativas, como as doenças de Alzheimer ouParkinson21,22. O estudo das proteínas amiloides também é motivado pelo papel funcional que elas podem desempenhar23,24 ou seu alto potencial para o desenvolvimento de novosbiomateriais25. Os determinantes físico-químicos da agregação amiloide permanecem obscuros, e nenhuma teoria geral da agregação amiloide está disponível, apesar do enorme progresso nos últimosanos21,26.
A agregação amiloide implica mudanças na estrutura e estabilidade de proteínas com o tempo, cujo estudo implica naturalmente dinâmica, ligada à estabilidade da conformação proteica, função proteica e paisagem energética proteica27. A dinâmica está diretamente ligada à estabilidade de um estado específico através da contribuição entrópica para os movimentos mais rápidos28, e a função da proteína pode ser sustentada por movimentos em várias escalas de tempo, desde sub-ps para proteínas sensíveis à luz29 até ms para movimentos de domínio, o que pode ser facilitado pela dinâmica picossegundo-nanossegundo30.
Dois exemplos de uso de espectroscopia de retroespalhamento de nêutrons para estudar proteínas amiloides serão apresentados, um no estado líquido para estudar a dinâmica de proteínas e outro no estado pó hidratado para estudar a dinâmica da água de hidratação. O primeiro exemplo diz respeito à agregação de lisozima em esferas de tamanho μm (chamadas partículas) seguidas em tempo real5, e o segundo uma comparação da dinâmica da água em estados nativos e agregados da proteína humana tau31.
A lisozima é uma enzima envolvida na defesa imunológica e é composta por 129 resíduos de aminoácidos. A lisozima pode formar partículas em tampão deuterado a pD de 10,5 e a uma temperatura de 90 °C. Com o espalhamento de nêutrons, mostramos que a evolução temporal do coeficiente de difusão do centro de massa da lisozima segue a cinética exponencial única da fluorescência da tioflavina T (uma sonda fluorescente usada para monitorar a formação de padrões de β cruzada amiloide32), indicando que a formação de superestruturas particuladas e padrões de β cruzada ocorrem em uma única etapa com a mesma taxa. Além disso, a dinâmica interna permaneceu constante durante todo o processo de agregação, o que pode ser explicado por uma rápida mudança conformacional que não pode ser observada nos instrumentos NBS, ou pela ausência de mudança significativa na energia interna da proteína na agregação.
A proteína humana tau é uma proteína intrinsecamente desordenada (IDP) constituída por 441 aminoácidos para a chamada isoforma 2N4R, que está notavelmente envolvida na doença de Alzheimer33. Usando retroespalhamento de nêutrons em pós de proteína perdeuterada tau, mostramos que a dinâmica da água de hidratação está aumentada no estado de fibra, com uma maior população de moléculas de água sofrendo movimentos de translação. O resultado sugere que um aumento na entropia da água de hidratação pode conduzir a fibrilação amiloide da tau.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum sample holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, &#8805;99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td> 
			543047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D, 99.9%)</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>DLM-4DR-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning high-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.5901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 75871-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator plate, 140 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>00470.G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nPDyn</td>
			<td></td>
			<td>v3.x</td>
			<td>see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>92641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 0.5-10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 100-1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 20-200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-0206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>372072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water

O espalhamento de nêutrons oferece a possibilidade de sondar a dinâmica dentro das amostras para uma ampla gama de energias de forma não destrutiva e sem marcação além do deutério. Em particular, a espectroscopia de retroespalhamento de nêutrons registra os sinais de espalhamento em vários ângulos de espalhamento simultaneamente e é adequada para estudar a dinâmica de sistemas biológicos na escala de tempo ps-ns. Ao empregar D2O - e possivelmente componentes tampão deuterizados - o método permite monitorar tanto a difusão do centro de massa quanto os movimentos da espinha dorsal e da cadeia lateral (dinâmica interna) de proteínas em estado líquido.
Adicionalmente, a dinâmica da água de hidratação pode ser estudada empregando-se pós de proteínas perdeuteradas hidratadas com H2O. Este artigo apresenta o fluxo de trabalho empregado no instrumento IN16B no Institut Laue-Langevin (ILL) para investigar a dinâmica da água e proteína de hidratação. A preparação de amostras de solução e amostras de proteína hidratada em pó usando troca de vapor é explicada. O procedimento de análise de dados para a dinâmica da proteína e da água de hidratação é descrito para diferentes tipos de conjuntos de dados (espectros quasielásticos ou varreduras de janela fixa) que podem ser obtidos em um espectrômetro de retroespalhamento de nêutrons.
O método é ilustrado com dois estudos envolvendo proteínas amiloides. A agregação da lisozima em agregados esféricos de tamanho μm - partículas denotadas - é mostrada para ocorrer em um processo de uma etapa no espaço e intervalo de tempo sondados em IN16B, enquanto a dinâmica interna permanece inalterada. Posteriormente, a dinâmica da água de hidratação da tau foi estudada em pós hidratados de proteína perdeuterada. Mostra-se que os movimentos de translação da água são ativados na formação de fibras amiloides. Finalmente, etapas críticas no protocolo são discutidas quanto ao posicionamento do espalhamento de nêutrons em relação ao estudo da dinâmica em relação a outros métodos biofísicos experimentais.

A agregação da lisozima em partículas foi realizada a 90 °C com concentração proteica de 50 mg/mL em tampão deuterado (NaCl 0,1 M a pD 10,5). A formação de particulados é desencadeada pelo aumento da temperatura para 90 °C e ocorre dentro de 6 h (Figura Suplementar S8). A aquisição de dados foi realizada no IN16B, conforme descrito no protocolo acima (os dados são permanentemente curados pelo ILL e acessíveis em http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).
Um e...

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High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

A espectroscopia de retroespalhamento de nêutrons oferece um acesso não destrutivo e livre de rótulos à dinâmica ps-ns de proteínas e sua água de hidratação. O fluxo de trabalho é apresentado com dois estudos sobre proteínas amiloides: sobre a dinâmica resolvida no tempo da lisozima durante a agregação e sobre a dinâmica da água de hidratação da tau após a formação de fibras.

Espectroscopia de Nêutrons de Alta Resolução para Estudo da Dinâmica de Proteínas e Água de Hidratação de Picossegundos-Nanossegundos

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

O retroespalhamento de nêutrons mede a difusão global e a dinâmica interna de proteínas e água de hidratação sem danos por radiação. A espectroscopia de nêutrons acessa simultaneamente correlações espaciais e temporais em nível molecular. Em matéria mole e materiais biológicos, é particularmente interessante obter informações indiretas sobre a ordem local nesses sistemas de desordem de longo alcance.Assim, o retroespalhamento de nêutrons pode ser usado para estudar dinâmica em biologia, química ou senso material. Outro campo forte é o da energia, com estudos, por exemplo, sobre baterias e células de combustível. O retroespalhamento de nêutrons tem sido usado com sucesso para estudar a dinâmica molecular de proteínas envolvidas em doenças neurodegenerativas, como Alzheimer e Parkinson.Os resultados obtidos nos ajudam a entender melhor as características moleculares dessas patologias e podem abrir caminho para o desenvolvimento de melhores diagnósticos. Para preparar o porta-amostras, comece limpando cuidadosamente um porta-amostras plano de alumínio e sua vedação de fio de índio e parafusos com água, seguido de etanol, e depois deixe secar. Pese as diferentes partes do porta-amostras, incluindo o fundo, a tampa e o fio de índio, separadamente em uma balança de precisão.Coloque o selo de fio de índio de um milímetro no sulco da parte inferior do porta-amostras, deixando uma pequena sobreposição onde as duas extremidades se unem. Adicione cerca de 100 miligramas de proteína liofilizada de modo a preencher a superfície interior da parte inferior do porta-amostras. Em seguida, coloque o porta-amostras em um exsicador com uma placa de Petri contendo pentóxido de fósforo em pó por 24 horas para secar completamente o pó proteico.Pesar a parte inferior seca do porta-amostras que contém o selo de índio e o pó seco para obter a massa da amostra seca. Retire o pentóxido de fósforo do exsicador e coloque uma placa de Petri com óxido de deutério, bem como a amostra dentro para hidratar o pó. Repita a secagem e hidratação três vezes para completar a troca de hidrogênio por deutério.Meça a massa de pó regularmente para verificar o nível de hidratação e quando a hidratação estiver ligeiramente acima do nível desejado, espere que a massa diminua lentamente. Uma vez obtida a hidratação desejada, coloque rapidamente a tampa na parte inferior e feche primeiro o porta-amostras com quatro parafusos para interromper a troca de vapor. Coloque e aperte todos os parafusos restantes até que não seja visível nenhum espaço entre a parte inferior e a tampa.Pesar o porta-amostras selado para verificar se existe qualquer potencial perda de hidratação devido a fugas após a experiência com neutrões. Para preparar a amostra no estado líquido, dissolver a proteína no tampão deuterado. Usando água, determine o volume adequado de líquido a ser colocado no porta-amostras.Antes de manusear qualquer material, verifique se a dose de radiação ionizante é inferior a 100 microsieverts por hora. Em seguida, seque bem o palito de amostra e remova qualquer amostra anterior. Coloque a amostra no palito de amostra, verifique se há centralização adequada em relação ao centro do feixe e insira o bastão de amostra no forno de crioterapia.Para adquirir dados no Nomad, vá para a guia de execução e arraste e solte um controlador de criostato de forno na barra de lançamento. Ajuste a temperatura para 200 Kelvin. Use o modo rápido e um tempo limite de 30 minutos para que a temperatura tenha tempo para estabilizar.Clique no ícone de atualização para executar a rampa de temperatura em segundo plano para aquisição de dados durante a diminuição da temperatura. Arraste e solte o controlador de configurações do Doppler IN16 na barra de ativação. Defina o perfil de velocidade para velocidade precisa, o ajuste para delta E máximo, o deslocamento de energia para 0,00 micro elétron-volt e o número de canais para 128 para obter uma configuração de varreduras de janela fixa elástica.Arraste e solte um controlador de contagem na barra de ativação, preencha o campo de legenda com um nome que permita fácil identificação dos dados e defina varreduras de 30 segundos com 60 repetições. Em seguida, arraste e solte o controlador de configurações do Doppler IN16 na barra de ativação. Defina o perfil de velocidade para assinar, o definido por velocidade com um valor de 4,5 metros por segundo e o número de canais até 2048 para obter uma configuração de espalhamento de nêutrons quase elástico.Arraste e solte um controlador de contagem e preencha o campo de legenda com um nome que permita fácil identificação dos dados. Defina varreduras de 30 minutos com quatro repetições. Para a rampa de temperatura, arraste e solte um controlador de criostato do forno, ajuste a temperatura para 310 Kelvin e ajuste a rampa para definir o ponto com um delta de 0,05 Kelvin por seis segundos.Use um tempo limite de 200 minutos. Use um loop for com 65 repetições. Dentro, insira um controlador de configurações de doppler IN16, seguido pelo controlador de contagem e defina uma única varredura de 30 segundos.Posteriormente, insira as configurações do Doppler IN16 conforme descrito anteriormente, mas usando um deslocamento de energia de 1,5 micro elétron-volt e 1024 canais. Em seguida, insira o controlador de contagem e defina uma única varredura de três minutos. Para adquirir o último espalhamento de nêutrons quase elástico de 312 Kelvin, arraste e solte as configurações do Doppler IN16 e os controladores de contagem configurados conforme demonstrado anteriormente.Em seguida, pressione o botão Iniciar para executar o script. As varreduras de janela fixa elástica e inelástica do lisossomo mostraram um aumento no sinal na transferência de baixo momento e baixa transferência de energia, enquanto o sinal na transferência de alta energia e baixa transferência de momento diminuiu. O coeficiente inicial do centro de difusão de massa foi de 15 angstrom ao quadrado por nanossegundo, que então diminuiu exponencialmente ao longo do tempo.Em temperaturas superiores a 220 Kelvin, a água de hidratação ao redor das fibras de tau foi significativamente mais móvel do que ao redor dos monômeros de tau. A fração de moléculas de água submetidas ao movimento de translação e os coeficientes de translação e rotação de difusão das moléculas de água foram aumentados ao redor das fibras. A concentração de proteínas deve ser de 2000 miligramas por ml ou, pelo menos, de 20 miligramas por ml para as proteínas proteinadas devido às limitações de retroespalhamento de neutrões decorrentes do fluxo de neutrões ou do fundo do tampão do porta-amostras.O retroespalhamento de nêutrons tem sido aplicado recentemente, por exemplo, para entender como a água, que são as proteínas ambientais naturais, pode ser totalmente substituída por um polímero sintético para aplicação biotecnológica como, por exemplo, a liberação de fármacos.

Research

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Biochemistry

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