Name: high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water
Uploaded: 2022-04-28T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water at JoVE.com

Авторы выражают благодарность Микаэле Зампони из Центра нейтронной науки им. Юлиха в центре им. Хайнца Майера-Лейбница, Гархинг, Германия, за часть экспериментов по рассеянию нейтронов, проведенных на приборе SPHERES. Эта работа опиралась на деятельность консорциума Лаборатории дейтерации (DLAB), финансируемого Европейским союзом по контрактам HPRI-2001-50065 и RII3-CT-2003-505925, а также на деятельность, финансируемую Исследовательским советом по инженерным и физическим наукам Соединенного Королевства (EPSRC) в рамках Института Лауэ Ланжевена EMBL DLAB в рамках грантов GR/R99393/01 и EP/C015452/1. Признана поддержка со стороны Европейской комиссии в рамках 7-й Рамочной программы в рамках Ключевого действия: укрепление европейского исследовательского пространства, исследовательских инфраструктур [Контракт 226507 (NMI3)]. Кевин Пуно и Кристиан Бек благодарят Федеральное министерство образования и научных исследований (BMBF, грант No 05K19VTB) за финансирование их постдокторских стипендий.

1. Подготовьте дейтерированный буфер для белков в жидком состоянии
<ol><li>Растворите все компоненты буфера в чистом виде D2O.</li>
	<li>Если pH-электрод был откалиброван в H2O, отрегулируйте pD по формуле pD = pH + 0,4 с помощью NaOD или DCl34. ПРИМЕЧАНИЕ: Использование D 2 O ...

Нейтронная спектроскопия является единственным методом, позволяющим зондировать усредненную по ансамблю ps-ns динамику образцов белка независимо от размера белка или сложности раствора при использовании дейтерации6. В частности, исследуя самодиффузию белковых сборок в ра...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum sample holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, &#8805;99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td> 
			543047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D, 99.9%)</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>DLM-4DR-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning high-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.5901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 75871-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator plate, 140 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>00470.G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nPDyn</td>
			<td></td>
			<td>v3.x</td>
			<td>see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>92641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 0.5-10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 100-1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 20-200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-0206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>372072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water

Рассеяние нейтронов дает возможность исследовать динамику в образцах для широкого диапазона энергий неразрушающим способом и без маркировки, кроме дейтерия. В частности, спектроскопия обратного рассеяния нейтронов регистрирует сигналы рассеяния при нескольких углах рассеяния одновременно и хорошо подходит для изучения динамики биологических систем на шкале времени ps-ns. ИспользуяD2O- и, возможно, дейтерированные буферные компоненты, метод позволяет контролировать как диффузию центра масс, так и движения основной цепи и боковой цепи (внутреннюю динамику) белков в жидком состоянии.
Кроме того, динамика гидратационной воды может быть изучена с использованием порошков пердейтерированных белков, гидратированных с H2O. В этой статье представлен рабочий процесс, используемый на приборе IN16B в Институте Лауэ-Ланжевена (ILL) для исследования динамики белковой и гидратационной воды. Объясняется приготовление образцов раствора и образцов гидратированного протеинового порошка с использованием парообмена. Описана процедура анализа данных как белковой, так и гидратационной динамики воды для различных типов наборов данных (квазиупругие спектры или сканирование с фиксированным окном), которые могут быть получены на спектрометре обратного рассеяния нейтронов.
Метод проиллюстрирован двумя исследованиями с участием амилоидных белков. Показано, что агрегация лизоцима в сферические агрегаты размером с мкм, обозначенные частицами, происходит в одностадийном процессе в пространственно-временном диапазоне, исследованном на IN16B, в то время как внутренняя динамика остается неизменной. Далее изучали динамику гидратации воды тау на гидратированных порошках пердейтерированного белка. Показано, что поступательные движения воды активируются при образовании амилоидных волокон. Наконец, обсуждаются критические шаги в протоколе относительно того, как рассеяние нейтронов позиционируется по отношению к изучению динамики по отношению к другим экспериментальным биофизическим методам.

Агрегацию лизоцима в твердые частицы проводили при 90 ° C с концентрацией белка 50 мг / мл в дейтерированном буфере (0,1 М NaCl при pD 10,5). Образование твердых частиц вызывается повышением температуры до 90 °C и происходит в течение 6 часов (дополнительный рисунок S8). Сбор данных проводилс...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water at JoVE.com

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Спектроскопия обратного рассеяния нейтронов обеспечивает неразрушающий и свободный от меток доступ к ps-ns динамике белков и их гидратационной воде. Рабочий процесс представлен двумя исследованиями амилоидных белков: динамики лизоцима во время агрегации с временным разрешением и динамики гидратационной воды тау при образовании волокон.

Нейтронная спектроскопия высокого разрешения для исследования пикосекундно-наносекундной динамики белков и гидратационной воды

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Обратные рассеяния нейтронов измеряют глобальную диффузию и внутреннюю динамику белков и гидратационной воды без радиационного повреждения. Нейтронная спектроскопия одновременно обращается к пространственным и временным корреляциям на молекулярном уровне. В мягкой материи и биологических материалах особенно интересно получить косвенную информацию о локальном порядке в этих системах расстройств дальнего действия.Таким образом, обратное рассеяние нейтронов может быть использовано для изучения динамики в биологии, химии или материальном смысле. Еще одной сильной областью является энергетика, с исследованиями, например, по батареям и топливным элементам. Обратное рассеяние нейтронов успешно используется для изучения молекулярной динамики белков, участвующих в нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона.Полученные результаты помогают нам лучше понять молекулярные признаки этих патологий и могут проложить путь к разработке лучшей диагностики. Чтобы подготовить держатель образца, начните с тщательной очистки плоского алюминиевого держателя образца, его уплотнения и винтов из индиевой проволоки водой, затем этанолом, а затем дайте ему высохнуть. Взвесьте различные части держателя образца, включая дно, крышку и индиевую проволоку, отдельно на прецизионных весах.Поместите одномиллиметровое уплотнение из индиевой проволоки в канавку нижней части держателя образца, оставив небольшое перекрытие в месте соединения двух концов. Добавьте около 100 миллиграммов лиофилизированного белка так, чтобы он заполнил внутреннюю поверхность нижней части держателя образца. Затем поместите держатель образца в эксикатор с чашкой Петри, содержащей порошок пятиокиси фосфора, на 24 часа, чтобы полностью высушить протеиновый порошок.Взвесьте высушенную нижнюю часть держателя образца, содержащую индиевую печать и высушенный порошок, чтобы получить массу высушенного образца. Удалите пятиокись фосфора из эксикатора и поместите внутрь чашку Петри с оксидом дейтерия, а также образец для гидратации порошка. Повторите сушку и гидратацию три раза для полного обмена водорода на дейтерий.Регулярно измеряйте массу порошка, чтобы проверить уровень гидратации, и когда гидратация немного превысит желаемый уровень, подождите, пока масса медленно уменьшится. Как только желаемая гидратация будет получена, быстро наденьте крышку на нижнюю часть и сначала закройте держатель образца четырьмя винтами, чтобы остановить парообмен. Установите и затяните все оставшиеся винты до тех пор, пока между нижней частью и крышкой не останется зазора.Взвесьте герметичный держатель образца, чтобы проверить возможные потери гидратации из-за утечек после нейтронного эксперимента. Чтобы приготовить образец в жидком состоянии, растворите белок в дейтерированном буфере. Используя воду, определите подходящий объем жидкости, которую нужно поместить в держатель образца.Прежде чем работать с любым материалом, убедитесь, что доза ионизирующего излучения составляет менее 100 микрозивертов в час. Затем тщательно высушите образец и удалите все предыдущие образцы. Поместите образец на палочку для образца, проверьте правильность центрирования относительно центра луча и вставьте палочку для образца в криопечь.Чтобы получить данные в Nomad, перейдите на вкладку «Выполнение» и перетащите контроллер криостата печи на стартовую панель. Установите температуру 200 Кельвинов. Используйте быстрый режим и тайм-аут в 30 минут, чтобы температура успела стабилизироваться.Нажмите на значок обновления, чтобы запустить изменение температуры в фоновом режиме для сбора данных во время снижения температуры. Перетащите контроллер доплеровских настроек IN16 на панель запуска. Установите профиль скорости на точную скорость, задайте значение на максимальную дельту E, смещение энергии на 0,00 микроэлектронвольта и количество каналов на 128, чтобы получить конфигурацию эластичного сканирования с фиксированным окном.Перетащите контроллер подсчета на панель запуска, заполните поле субтитров именем, позволяющим легко идентифицировать данные, и установите сканирование продолжительностью 30 секунд с 60 повторениями. Затем перетащите контроллер доплеровских настроек IN16 на панель запуска. Установите профиль скорости на знак, набор на скорость со значением 4,5 метра в секунду и количество каналов на 2048 для получения квазиупругой конфигурации рассеяния нейтронов.Перетащите контроллер подсчета и заполните поле субтитров именем, которое позволяет легко идентифицировать данные. Установите сканирование по 30 минут с четырьмя повторениями. Для повышения температуры перетащите контроллер криостата печи, установите температуру на 310 Кельвинов и установите рампу в заданное значение с дельтой 0,05 Кельвина в течение шести секунд.Используйте тайм-аут 200 минут. Используйте цикл for с 65 повторениями. Внутрь вставьте контроллер доплеровских настроек IN16, затем контроллер подсчета и установите однократное сканирование продолжительностью 30 секунд.Затем вставьте доплеровские настройки IN16, как описано ранее, но с использованием смещения энергии 1,5 микроэлектронвольт и 1024 каналов. Затем вставьте контроллер подсчета и установите однократное сканирование продолжительностью три минуты. Чтобы получить последнее квазиупругое рассеяние нейтронов в 312 кельвинов, перетащите доплеровские настройки IN16 и контроллеры подсчета, настроенные так, как показано ранее.Затем нажмите кнопку «Пуск», чтобы запустить сценарий. Сканирование лизосом упругого и неупругого фиксированного окна показало увеличение сигнала при передаче низкого импульса и низкой передаче энергии, в то время как сигнал при передаче высокой энергии и передаче низкого импульса уменьшился. Начальный коэффициент диффузии центра масс составлял 15 ангстрем в квадрате в наносекунду, который затем экспоненциально уменьшался с течением времени.При температурах выше 220 Кельвинов гидратационная вода вокруг тау-волокон была значительно более подвижной, чем вокруг тау-мономеров. Доля молекул воды, претерпевающих поступательное движение, а также коэффициенты поступательной и вращательной диффузии молекул воды были увеличены вокруг волокон. Концентрация белка должна составлять 2000 миллиграмм на мл или, по меньшей мере, 20 миллиграмм на мл для белковых белков из-за ограничений обратного рассеяния нейтронов из-за потока нейтронов или фона буфера держателя образца.Обратное рассеяние нейтронов недавно было применено, например, для понимания того, как вода, которая является естественным белком окружающей среды, может быть полностью заменена синтетическим полимером для биотехнологического применения, такого как, например, доставка лекарств.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Спектроскопии ядерного магнитного резонанса для идентификации нескольких фосфорилирований искробезопасных неупорядоченных белков

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Анализ одиночных частиц с высокой разрешающей способностью при электронно-микроскопической микроскопии Изображения с использованием SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Ковалентной иммобилизации белков для одной молекулы силой спектроскопии

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Измерения взаимодействий шаровых и волокнистых белков спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и микромасштабной Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Высокое разрешение Комплекс Профилирование криосликинг BN-MS Анализ

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Интегрированная Рамана спектроскопия и массовая спектрометрия Платформа для изучения одноклеточного потребления наркотиков, метаболизма и эффектов

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Поперечное секционирование зрелого риса (Oryza sativa L.) Ядра для сканирующей электронной микроскопии с использованием наконечников пипеток в качестве поддержки иммобилизации

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Двухцветная флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия для изучения белково-белкового взаимодействия и динамики белка в живых клетках

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

CD-спектроскопия для изучения взаимодействий ДНК и белка

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...