Name: high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water
Uploaded: 2022-04-28T13:10:00
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Los autores agradecen a Michaela Zamponi en el Centro Jülich para la Ciencia de Neutrones en el Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Alemania, por parte de los experimentos de dispersión de neutrones realizados en el instrumento SPHERES. Este trabajo se ha beneficiado de las actividades del consorcio Deuteration Laboratory (DLAB) financiado por la Unión Europea bajo los Contratos HPRI-2001-50065 y RII3-CT-2003-505925, y de la actividad financiada por el Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas del Reino Unido (EPSRC) dentro del Institut Laue Langevin EMBL DLAB bajo las subvenciones GR / R99393/01 y EP / C015452 / 1. Se reconoce el apoyo de la Comisión Europea en el marco del 7º Programa Marco a través de la Acción Clave: Fortalecimiento del Espacio Europeo de Investigación, Infraestructuras de Investigación [Contrato 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot y Christian Beck agradecen al Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF, número de subvención 05K19VTB) por la financiación de sus becas postdoctorales.

1. Preparar el tampón deuterado para proteínas en estado líquido
<ol><li>Disolver todos los componentes del tampón enD2Opuro.</li>
	<li>Si el electrodo de pH se calibró enH2O, ajuste el pD de acuerdo con la fórmula pD = pH + 0.4 usando NaOD o DCl34. NOTA: El uso de D2O en lugar deH2Opodría afectar la solubilidad de las proteínas y las condiciones tampón podrían necesitar ser adaptadas (por ejemplo, por un ligero cambio en la concentr...

La espectroscopia de neutrones es el único método que permite sondear la dinámica ps-ns promediada por conjuntos de muestras de proteínas, independientemente del tamaño de la proteína o de la complejidad de la solución cuando se utiliza la deuteración6. Específicamente, al sondear la autodifusión de ensamblajes de proteínas en solución, el tamaño hidrodinámico de dichos ensamblajes puede determinarse inequívocamente. No obstante, el método está comúnmente limitado por el bajo flu...

El neutrón es una partícula masiva y sin carga que se ha utilizado con éxito a lo largo de los años para sondear muestras en diversos campos, desde la física fundamental hasta la biología1. Para aplicaciones biológicas, la dispersión de neutrones de ángulo pequeño, la dispersión inelástica de neutrones y la cristalografía y reflectometría de neutrones se utilizan ampliamente 2,3,4. La dispersión inelástica de neutrones proporciona una medición promediada por conjuntos de la dinámica sin requerir un etiquetado específico per se, y una calidad de señal que no depende del tamaño o la proteína5. La medición se puede hacer utilizando un ambiente altamente complejo para la proteína en estudio que imita el medio intracelular, como un lisado bacteriano deuterado o incluso in vivo 3,6,7. Se pueden usar diferentes configuraciones experimentales para estudiar la dinámica, a saber, i) acceso de tiempo de vuelo a la dinámica sub-ps-ps, ii) acceso de retrodispersión a la dinámica ps-ns, y iii) acceso de spin-echo a la dinámica de ns a cientos de ns. La retrodispersión de neutrones hace uso de la ley de Bragg 2d sinθ = nλ, donde d es la distancia entre planos en un cristal, θ el ángulo de dispersión, n el orden de dispersión y λ la longitud de onda. El uso de cristales para la retrodispersión hacia los detectores permite lograr una alta resolución en energía, típicamente ~ 0.8 μeV. Para medir el intercambio de energía, se utiliza una unidad Doppler que lleva un cristal en retrodispersión para definir y ajustar la longitud de onda de neutrones entrantes 8,9,10 (Figura 1), o se puede usar una configuración de tiempo de vuelo a costa de una disminución en la resolución de energía 11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63664/63664fig01.jpg"> Figura 1: Croquis de un espectrómetro de retrodispersión de neutrones con una unidad Doppler. El haz entrante golpea el helicóptero de transformación del espacio de fase (PST)42, lo que aumenta el flujo en la posición de la muestra. Luego se retrodispersa hacia la muestra mediante la unidad Doppler, que selecciona una energía E1 (flecha cian). Los neutrones son dispersados por la muestra (con diferentes energías representadas por el color de las flechas) y los analizadores, hechos de cristales de Si 111, solo dispersarán neutrones con una energía específica E0 (flechas de color rojo aquí). Por lo tanto, la transferencia de momento q se obtiene de la posición detectada del neutrón en la matriz del detector, y la transferencia de energía se obtiene de la diferencia E1- E0. El tiempo de vuelo esperado para el pulso de neutrones producido por el PST se utiliza para descartar la señal de los neutrones dispersos directamente hacia los tubos detectores. Abreviatura: PST = transformación del espacio de fase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63664/63664fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para la espectroscopia de retrodispersión, la principal contribución a la señal de muestras ricas en protones de hidrógeno, como las proteínas, proviene de la dispersión incoherente, para la cual la intensidad de dispersión Sinc(q, ω) se muestra mediante Eq (1)12
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)
Donde σinc es la sección transversal incoherente del elemento considerado, k' es la norma del vector de onda disperso, k la norma del vector de onda entrante, q (= k - k') la transferencia de momento, r j(t) el vector de posición del átomo j en el tiempo t, y ω la frecuencia correspondiente a la transferencia de energía entre el neutrón entrante y el sistema. Los corchetes angulares denotan el promedio del conjunto. Por lo tanto, la dispersión incoherente sondea la autocorrelación de partículas individuales promediada por conjuntos de las posiciones de los átomos con el tiempo y da la autodinámica promediada sobre todos los átomos en el sistema y diferentes orígenes de tiempo (promedio de conjunto). La función de dispersión es la transformada de Fourier en el tiempo de la función de dispersión intermedia I(q, t), que puede ser vista como la transformada de Fourier en el espacio de la función de correlación de van Hove mostrada por Eq (2):
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
Donde ρ(r,t) es la densidad de probabilidad de encontrar un átomo en la posición r y el tiempo t 13.
Para un proceso de difusión fickiano, la función de autodifusión resulta (ver Eq (3)) después de una doble transformada de Fourier en una función de dispersión que consiste en un lorentziano de ancho de línea dado por γ = Dq2.
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq10.jpg" style="margin: auto;"> (3)
Se desarrollaron modelos más sofisticados que se encontraron útiles, como el modelo de difusión de salto de Singwi y Sjölander para la dinámica interna de proteínas ps-ns14 o el modelo de rotación de Sears para el agua de hidratación15,16,17.
En el instrumento de retrodispersión de neutrones (NBS) IN16B8,9 en el ILL, Grenoble, Francia (Figura suplementaria S1), una configuración comúnmente utilizada con proteínas consiste en cristales de Si 111 para los analizadores con un accionamiento Doppler para ajustar la longitud de onda entrante (Figura suplementaria S2A), dando así acceso al rango de transferencia de momento ~0.2 Å-1 < q < ~2 Å-1 y rango de transferencia de energía de -30 μeV < <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> < 30 μeV- correspondiente a escalas de tiempo que van desde unos pocos ps a unos pocos ns y distancias de unos pocos Å. Además, IN16B ofrece la posibilidad de realizar escaneos elásticos e inelásticos de ventana fija (E/IFWS)10, que incluyen la adquisición de datos en una transferencia de energía fija. Como el flujo es limitado cuando se trabaja con neutrones, E/IFWS permite maximizar el flujo para una transferencia de energía, reduciendo así el tiempo de adquisición necesario para obtener una relación señal-ruido satisfactoria. Una opción más reciente es el modo11 del espectrómetro de retrodispersión y tiempo de vuelo (BATS), que permite la medición de una amplia gama de transferencias de energía (por ejemplo, -150 μeV < < <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> 150 μeV), con un flujo más alto que con el accionamiento Doppler, pero a costa de una resolución de energía más baja (Figura suplementaria S2B).
Una propiedad importante de la dispersión de neutrones es que la sección transversal incoherente σinc tiene un valor 40 veces mayor para el hidrógeno que para el deuterio y es insignificante para otros elementos que se encuentran comúnmente en muestras biológicas. Por lo tanto, la dinámica de las proteínas en un ambiente líquido se puede estudiar mediante el uso de un tampón deuterado, y el estado del polvo permite el estudio de la dinámica interna de la proteína con proteína en polvo hidrogenada hidratada con D2O, o el estudio del agua de hidratación para la proteína perdeuterada en polvo hidratada conH2O. En estado líquido, la retrodispersión de neutrones permite típicamente el acceso simultáneo a la autodifusión del centro de masa de las proteínas (difusión de tipo fickiano) y su dinámica interna. Estos últimos son movimientos de columna vertebral y de cadena lateral generalmente descritos por el llamado modelo de difusión de salto u otros 3,18. En los polvos de proteína hidrogenada, la difusión de proteínas está ausente y solo se necesita modelar la dinámica interna. Para el agua de hidratación, las contribuciones de los movimientos de traslación y rotación de las moléculas de agua presentan una dependencia diferente de la transferencia de momento q, lo que permite su distinción en el proceso de análisis de datos17.
Este artículo ilustra el método de retrodispersión de neutrones con el estudio de proteínas que se encontraron capaces de desplegarse, agregarse en una forma canónica que consiste en pilas de β hebras -el llamado patrón de β cruzado19,20- y formar fibras alargadas. Se trata de la llamada agregación amiloide, ampliamente estudiada debido a su papel central en trastornos neurodegenerativos como el Alzheimer o el Parkinson21,22. El estudio de las proteínas amiloides también está motivado por el papel funcional que pueden desempeñar 23,24 o su alto potencial para el desarrollo de nuevos biomateriales25. Los determinantes fisicoquímicos de la agregación amiloide siguen sin estar claros, y no se dispone de una teoría general de la agregación amiloide, a pesar del tremendo progreso durante los últimos años21,26.
La agregación amiloide implica cambios en la estructura y estabilidad de las proteínas con el tiempo, cuyo estudio implica naturalmente dinámica, vinculada a la estabilidad de la conformación de proteínas, la función de las proteínas y el paisaje de energía de las proteínas27. La dinámica está directamente relacionada con la estabilidad de un estado específico a través de la contribución entrópica para los movimientos más rápidos28, y la función de la proteína puede ser sostenida por movimientos en varias escalas de tiempo desde sub-ps para proteínas sensibles a la luz29 hasta ms para movimientos de dominio, que pueden ser facilitados por la dinámica de picosegundos-nanosegundos30.
Se presentarán dos ejemplos de uso de la espectroscopia de retrodispersión de neutrones para estudiar proteínas amiloides, uno en estado líquido para estudiar la dinámica de proteínas y otro en estado de polvo hidratado para estudiar la dinámica del agua de hidratación. El primer ejemplo se refiere a la agregación de lisozima en esferas de tamaño μm (llamadas partículas) seguidas en tiempo real5, y el segundo a una comparación de la dinámica del agua en estados nativos y agregados de la proteína humana tau31.
La lisozima es una enzima implicada en la defensa inmune y está compuesta por 129 residuos de aminoácidos. La lisozima puede formar partículas en tampón deuterado a pD de 10,5 y a una temperatura de 90 °C. Con la dispersión de neutrones, demostramos que la evolución temporal del coeficiente de difusión del centro de masa de la lisozima sigue la cinética exponencial única de la fluorescencia de tioflavina T (una sonda fluorescente utilizada para monitorear la formación de patrones de β cruzada amiloide32), lo que indica que la formación de superestructuras particuladas y patrones de β cruzada ocurren en un solo paso con la misma velocidad. Además, la dinámica interna se mantuvo constante durante todo el proceso de agregación, lo que puede explicarse por un cambio conformacional rápido que no se puede observar en los instrumentos NBS, o por la ausencia de un cambio significativo en la energía interna de las proteínas tras la agregación.
La proteína humana tau es una proteína intrínsecamente desordenada (IDP) que consta de 441 aminoácidos para la llamada isoforma 2N4R, que está notablemente involucrada en la enfermedad de Alzheimer33. Usando retrodispersión de neutrones en polvos de proteína tau perdeuterada, demostramos que la dinámica del agua de hidratación aumenta en el estado de fibra, con una mayor población de moléculas de agua sometidas a movimientos de traslación. El resultado sugiere que un aumento en la entropía del agua de hidratación podría conducir a la fibrilación amiloide de tau.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum sample holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, &#8805;99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td> 
			543047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D, 99.9%)</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>DLM-4DR-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning high-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.5901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 75871-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator plate, 140 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>00470.G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nPDyn</td>
			<td></td>
			<td>v3.x</td>
			<td>see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>92641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 0.5-10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 100-1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 20-200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-0206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>372072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water

La dispersión de neutrones ofrece la posibilidad de sondear la dinámica dentro de las muestras para una amplia gama de energías de una manera no destructiva y sin etiquetar más que el deuterio. En particular, la espectroscopia de retrodispersión de neutrones registra las señales de dispersión en múltiples ángulos de dispersión simultáneamente y es muy adecuada para estudiar la dinámica de los sistemas biológicos en la escala de tiempo ps-ns. Al emplear D2O, y posiblemente componentes tampón deuterados, el método permite monitorear tanto la difusión del centro de masa como los movimientos de la columna vertebral y la cadena lateral (dinámica interna) de las proteínas en estado líquido.
Además, la dinámica del agua de hidratación se puede estudiar empleando polvos de proteínas perdeuteradas hidratadas conH2O. Este artículo presenta el flujo de trabajo empleado en el instrumento IN16B en el Institut Laue-Langevin (ILL) para investigar la dinámica del agua de proteínas e hidratación. Se explica la preparación de muestras de solución y muestras de proteína hidratada en polvo mediante intercambio de vapor. El procedimiento de análisis de datos para la dinámica del agua de proteínas e hidratación se describe para diferentes tipos de conjuntos de datos (espectros cuasielásticos o escaneos de ventana fija) que se pueden obtener en un espectrómetro de retrodispersión de neutrones.
El método se ilustra con dos estudios que involucran proteínas amiloides. Se muestra que la agregación de lisozima en agregados esféricos de tamaño μm -partículas denotadas- ocurre en un proceso de un solo paso en el rango de espacio y tiempo sondeado en IN16B, mientras que la dinámica interna permanece sin cambios. Además, se estudió la dinámica del agua de hidratación de tau en polvos hidratados de proteína perdeuterada. Se muestra que los movimientos de traslación del agua se activan tras la formación de fibras amiloides. Finalmente, se discuten los pasos críticos en el protocolo sobre cómo se posiciona la dispersión de neutrones con respecto al estudio de la dinámica con respecto a otros métodos biofísicos experimentales.

La agregación de lisozima en partículas se realizó a 90 °C con una concentración de proteína de 50 mg/mL en un tampón deuterado (0,1 M NaCl a pD 10,5). La formación de partículas se desencadena por el aumento de la temperatura a 90 °C y se produce dentro de las 6 h (Figura suplementaria S8). La adquisición de datos se realizó en IN16B, como se describe en el protocolo anterior (los datos son seleccionados permanentemente por el ILL y accesibles en http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811)....

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High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

La espectroscopia de retrodispersión de neutrones ofrece un acceso no destructivo y sin etiquetas a la dinámica ps-ns de las proteínas y su agua de hidratación. El flujo de trabajo se presenta con dos estudios sobre proteínas amiloides: sobre la dinámica resuelta en el tiempo de la lisozima durante la agregación y sobre la dinámica del agua de hidratación de tau en la formación de fibra.

Espectroscopía de neutrones de alta resolución para estudiar la dinámica de picosegundos-nanosegundos de proteínas y agua de hidratación

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

La retrodispersión de neutrones mide la difusión global y la dinámica interna de las proteínas y el agua de hidratación sin daño por radiación. La espectroscopia de neutrones accede simultáneamente a las correlaciones espaciales y temporales a nivel molecular. En materia blanda y materiales biológicos, es particularmente interesante obtener información indirecta sobre el orden local en estos sistemas de desorden de largo alcance.Por lo tanto, la retrodispersión de neutrones se puede usar para estudiar la dinámica en biología, química o sentido material. Otro campo fuerte es la energía, con estudios, por ejemplo, sobre baterías y pilas de combustible. La retrodispersión de neutrones se ha utilizado con éxito para estudiar la dinámica molecular de proteínas involucradas en enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer y el Parkinson.Los resultados obtenidos nos ayudan a comprender mejor las características moleculares de estas patologías y pueden allanar el camino para desarrollar mejores diagnósticos. Para preparar el portamuestras, comience limpiando a fondo un soporte de muestra de aluminio plano y su sello de alambre de indio y tornillos con agua, seguido de etanol, y luego déjelo secar. Pese las diferentes partes del portamuestras, incluida la parte inferior, la tapa y el alambre de indio, por separado en una balanza de precisión.Coloque el sello de alambre de indio de un milímetro en la ranura de la parte inferior del soporte de muestra, dejando una pequeña superposición donde se unen los dos extremos. Agregue alrededor de 100 miligramos de proteína liofilizada de modo que llene la superficie interna de la parte inferior del portamuestras. A continuación, coloque el portamuestras en un desecador con una placa de Petri que contenga polvo de pentóxido de fósforo durante 24 horas para secar completamente la proteína en polvo.Pesar la parte inferior seca del portamuestras que contiene el sello de indio y el polvo seco para obtener la masa de la muestra seca. Retire el pentóxido de fósforo del desecador y coloque una placa de Petri con óxido de deuterio, así como la muestra en el interior para hidratar el polvo. Repita el secado y la hidratación tres veces para obtener un intercambio completo de hidrógeno a deuterio.Mida la masa de polvo regularmente para verificar el nivel de hidratación y cuando la hidratación esté ligeramente por encima del nivel deseado, espere a que la masa disminuya lentamente. Una vez obtenida la hidratación deseada, coloque rápidamente la tapa en la parte inferior y cierre primero el portamuestras con cuatro tornillos para detener el intercambio de vapor. Coloque y apriete todos los tornillos restantes hasta que no haya espacio visible entre la parte inferior y la tapa.Pese el portamuestras sellado para comprobar si hay una posible pérdida de hidratación por fugas después del experimento con neutrones. Para preparar la muestra en estado líquido, disuelva la proteína en el tampón deuterado. Usando agua, determine el volumen apropiado de líquido que se colocará en el portamuestras.Antes de manipular cualquier material, asegúrese de que la dosis de radiación ionizante sea inferior a 100 microsieverts por hora. Luego, seque bien la barra de muestra y retire cualquier muestra anterior. Coloque la muestra en la barra de muestra, verifique el centrado adecuado en relación con el centro de la viga e inserte la barra de muestra en el horno criogénico.Para adquirir datos en Nomad, vaya a la pestaña de ejecución y arrastre y suelte un controlador de criostato de horno en el launchpad. Ajuste la temperatura a 200 Kelvin. Utilice el modo rápido y un tiempo de espera de 30 minutos para que la temperatura tenga tiempo de estabilizarse.Haga clic en el icono de actualización para ejecutar la rampa de temperatura en segundo plano para la adquisición de datos durante la disminución de la temperatura. Arrastre y suelte el controlador de configuración Doppler IN16 en el launchpad. Establezca el perfil de velocidad en velocidad precisa, el establecido en delta E máximo, el desplazamiento de energía en 0.00 micro electronvoltios y el número de canales en 128 para obtener una configuración de escaneos de ventana fija elástica.Arrastre y suelte un controlador de conteo en el launchpad, complete el campo de subtítulos con un nombre que permita una fácil identificación de los datos y establezca escaneos de 30 segundos con 60 repeticiones. A continuación, arrastre y suelte el controlador de configuración Doppler IN16 en el launchpad. Establezca el perfil de velocidad para firmar, el conjunto por para velocidad con un valor de 4,5 metros por segundo y el número de canales para 2048 para obtener una configuración de dispersión de neutrones cuasielástica.Arrastre y suelte un controlador de recuento y rellene el campo de subtítulos con un nombre que permita una fácil identificación de los datos. Establezca escaneos de 30 minutos con cuatro repeticiones. Para la rampa de temperatura, arrastre y suelte un controlador de criostato del horno, ajuste la temperatura a 310 Kelvin y ajuste la rampa al punto de ajuste con un delta de 0.05 Kelvin durante seis segundos.Utilice un tiempo de espera de 200 minutos. Usa un bucle for con 65 repeticiones. En el interior, inserte un controlador de configuración Doppler IN16, seguido del controlador de conteo y configure un solo escaneo de 30 segundos.Posteriormente, inserte los ajustes Doppler IN16 como se describió anteriormente, pero utilizando un desplazamiento de energía de 1.5 micro electronvoltios y 1024 canales. Luego, inserte el controlador de conteo y configure un solo escaneo de tres minutos. Para adquirir la última dispersión de neutrones cuasi elástica de 312 Kelvin, arrastre y suelte los ajustes Doppler IN16 y los controladores de conteo configurados como se demostró anteriormente.A continuación, pulse el botón de inicio para ejecutar el script. Las exploraciones de ventana fija elástica e inelástica lisosómica mostraron un aumento en la señal a baja transferencia de momento y baja transferencia de energía, mientras que la señal a alta transferencia de energía y baja transferencia de momento disminuyó. El centro inicial del coeficiente de difusión de masa fue de 15 angstrom al cuadrado por nanosegundo, que luego disminuyó exponencialmente con el tiempo.A temperaturas superiores a 220 Kelvin, el agua de hidratación alrededor de las fibras tau fue significativamente más móvil que alrededor de los monómeros tau. La fracción de moléculas de agua sometidas a movimiento de traslación y los coeficientes de difusión de traslación y rotación de las moléculas de agua se incrementaron alrededor de las fibras. La concentración de proteína debe ser de 2000 miligramos por ml o al menos 20 miligramos por ml para proteínas proteinadas debido a las limitaciones de dispersión de neutrones del flujo de neutrones o el fondo del tampón del soporte de la muestra.La retrodispersión de neutrones se ha aplicado recientemente, por ejemplo, para comprender cómo el agua, que son las proteínas ambientales naturales, puede ser completamente reemplazada por un polímero sintético para aplicaciones biotecnológicas como, por ejemplo, la administración de fármacos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Nuclear espectroscopía de resonancia magnética para la identificación de múltiples fosforilaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Investigación

Bioquímica

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Análisis de una sola partícula de alta resolución a partir de imágenes de crosmicroscopía electrónica usando SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

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Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Medición de las interacciones de las proteínas globulares y filamentosas por espectroscopia de resonancia magnética Nuclear (RMN) y microescala Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Uso en transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de Vitro para el estudio de la dinámica de los complejos de la proteína en una escala de tiempo de milisegundos

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