Name: high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water
Uploaded: 2022-04-28T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water at JoVE.com

Yazarlar, Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Almanya'daki Jülich Nötron Bilimi Merkezi'nden Michaela Zamponi'ye, SPHERES cihazı üzerinde yapılan nötron saçılma deneylerinin bir parçası için minnettarlar. Bu çalışma, Avrupa Birliği tarafından HPRI-2001-50065 ve RII3-CT-2003-505925 Sözleşmeleri kapsamında finanse edilen Deuterasyon Laboratuvarı (DLAB) konsorsiyumunun faaliyetlerinden ve GR/R99393/01 ve EP/C015452/1 Hibeleri kapsamında Institut Laue Langevin EMBL DLAB bünyesindeki İngiltere Mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi (EPSRC) tarafından finanse edilen faaliyetlerden yararlanmıştır. Avrupa Komisyonu'nun 7. Çerçeve Programı kapsamında Anahtar Eylem: Avrupa Araştırma Alanı'nın Güçlendirilmesi, Araştırma Altyapıları aracılığıyla verdiği destek kabul edilmektedir [Sözleşme 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot ve Christian Beck, Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı'na (BMBF, hibe numarası 05K19VTB) doktora sonrası burslarının finansmanı için teşekkür eder.

1. Deuterated tamponu sıvı haldeki proteinler için hazırlayın
<ol><li>Tamponun tüm bileşenlerini safD2O içinde çözün.</li>
	<li>pH elektroduH2O'dakalibre edilmişse, pD'yi NaOD veya DCl34 kullanarak pD = pH + 0.4 formülüne göre ayarlayın. NOT:H2O yerineD2O kullanımı protein çözünürlüğünü etkileyebilir ve tampon koşullarının uyarlanması gerekebilir (örneğin, tuz konsantrasyonundaki küçük bir değişi...

Nötron spektroskopisi, proteinin boyutuna veya döterasyon kullanıldığında çözeltinin karmaşıklığına bakılmaksızın protein örneklerinin topluluk ortalamalı ps-ns dinamiklerinin araştırılmasına izin veren tek yöntemdir6. Spesifik olarak, çözelti içindeki protein gruplarının kendiliğinden difüzyonunu araştırarak, bu tür montajların hidrodinamik boyutu açık bir şekilde belirlenebilir. Bununla birlikte, yöntem genellikle düşük nötron akısı ile sınırlıdır,...

Nötron, temel fizikten biyolojiye kadar çeşitli alanlardaki örnekleri araştırmak için yıllar boyunca başarıyla kullanılan yüksüz ve büyük bir parçacıktır1. Biyolojik uygulamalar için, küçük açılı nötron saçılması, elastik olmayan nötron saçılması ve nötron kristalografisi ve reflektometrisi yaygın olarak kullanılmaktadır 2,3,4. Elastik olmayan nötron saçılması, kendi başına belirli bir etiketleme gerektirmeden dinamiklerin topluluk ortalamalı bir ölçümünü ve boyuta veya protein5'e bağlı olmayan bir sinyal kalitesi sağlar. Ölçüm, incelenen protein için, deuterated bakteriyel lizat veya hatta in vivo 3,6,7 gibi hücre içi ortamı taklit eden oldukça karmaşık bir ortam kullanılarak yapılabilir. Dinamikleri incelemek için farklı deney düzenekleri kullanılabilir, yani i) uçuş zamanı-alt-ps-ps dinamiklerine erişim sağlar, ii) ps-ns dinamiklerine geri saçılma-erişim sağlar ve iii) spin-echo-ns'den yüzlerce ns'ye kadar dinamiklere erişim sağlar. Nötron geri saçılması, Bragg'ın 2d sinθ = nλ yasasını kullanır; burada d, bir kristaldeki düzlemler arasındaki mesafe, θ saçılma açısı, n saçılma sırası ve λ dalga boyudur. Dedektörlere doğru geri saçılma için kristallerin kullanılması, tipik olarak ~ 0.8 μeV olan enerjide yüksek bir çözünürlük elde etmeyi sağlar. Enerji değişimini ölçmek için, gelen nötron dalga boyunu 8,9,10 (Şekil 1) tanımlamak ve ayarlamak için geri saçılmada bir kristal taşıyan bir Doppler sürücüsü kullanılır veya enerji çözünürlüğü11'deki bir düşüş pahasına bir uçuş zamanı kurulumu kullanılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63664/63664fig01.jpg"> Resim 1: Doppler tahrikli bir nötron geri saçılma spektrometresinin taslağı. Gelen ışın, numune konumundaki akıyı artıran faz uzayı dönüşümü (PST) kıyıcısı42'ye çarpar. Daha sonra bir enerjiE1 (camgöbeği oku) seçen Doppler sürücüsü tarafından numuneye doğru geri saçılır. Nötronlar daha sonra numune tarafından dağılır (okların rengiyle temsil edilen farklı enerjilerle) ve Si 111 kristallerinden yapılmış analizörler, nötronları yalnızca belirli bir enerji E0 (burada kırmızı renkli oklar) ile geri saçarlar. Bu nedenle, momentum transferi q , nötronun dedektör dizisi üzerinde tespit edilen konumundan elde edilir ve enerji transferi E1- E0 farkından elde edilir. PST tarafından üretilen nötron darbesi için beklenen uçuş süresi, doğrudan dedektör tüplerine doğru dağılmış nötronlardan gelen sinyali atmak için kullanılır. Kısaltma: PST = faz uzayı dönüşümü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63664/63664fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Geri saçılma spektroskopisi için, proteinler gibi hidrojen proton bakımından zengin numunelerden gelen sinyale ana katkı, Sinc (q, ω) saçılma yoğunluğunun Eq (1) 12 ile gösterildiği tutarsız saçılmadan gelir
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)
σinc, düşünülen elemanın tutarsız kesiti olduğunda, k' dağınık dalga vektörünün normu, k gelen dalga vektörünün normu, q (= k - k') momentum transferi, rj (t) atomunun t zamanındaki konum vektörü ve ω gelen nötron ile sistem arasındaki enerji transferine karşılık gelen frekanstır. Açısal parantezler topluluk ortalamasını gösterir. Bu nedenle, tutarsız saçılma, atom konumlarının zamanla topluluk ortalamalı tek parçacık kendi kendine korelasyonunu araştırır ve sistemdeki tüm atomlar ve farklı zaman kökenleri (topluluk ortalaması) üzerinde ortalamalı öz-dinamikleri verir. Saçılma fonksiyonu, Eq (2) tarafından gösterilen van Hove korelasyon fonksiyonunun uzaydaki Fourier dönüşümü olarak görülebilen ara saçılma fonksiyonu I(q, t)'nin zamanındaki Fourier dönüşümüdür:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
Burada ρ(r,t), r pozisyonunda ve t 13 zamanında bir atom bulmanın olasılık yoğunluğudur.
Bir Fickian difüzyon işlemi için, kendiliğinden difüzyon fonksiyonu, γ = Dq2 tarafından verilen çizgi genişliğindeki bir Lorentzian'dan oluşan bir saçılma fonksiyonunda çift Fourier dönüşümünden sonra sonuçlanır (bakınız Eq (3)).
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq10.jpg" style="margin: auto;"> (3)
Singwi ve Sjölander'in ps-ns iç protein dinamiği14 için atlama difüzyon modeli veya Sears'ın hidrasyon suyu15,16,17 için dönme modeli gibi daha sofistike modeller geliştirildi ve yararlı bulundu.
ILL, Grenoble, Fransa'daki nötron geri saçılma (NBS) cihazı IN16B 8,9'da (Ek Şekil S1), proteinlerle yaygın olarak kullanılan bir kurulum, gelen dalga boyunu ayarlamak için Doppler tahrikli analizörler için Si 111 kristallerinden oluşur (Ek Şekil S2A), böylece momentum transfer aralığına erişim sağlar ~0.2 Å-1 < q < ~2 Å-1 ve -30 μeV enerji transfer aralığı < <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> < 30 μeV-birkaç ps ile birkaç ns arasında değişen zaman ölçeklerine ve birkaç şmesafeye karşılık gelir. Ek olarak, IN16B, sabit bir enerji aktarımında veri toplamayı içeren elastik ve elastik olmayan sabit pencere taramaları (E/IFWS)10 gerçekleştirme imkanı sunar. Nötronlarla çalışırken akı sınırlı olduğundan, E / IFWS, bir enerji transferi için akının maksimize edilmesine izin verir, böylece tatmin edici bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için gereken edinme süresini azaltır. Daha yeni bir seçenek, Doppler tahrikinden daha yüksek bir akı ile, ancak daha düşük bir enerji çözünürlüğü pahasına (Ek Şekil S2B) çok çeşitli enerji transferlerinin (örneğin, -150 μeV < < <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> 150 μeV) ölçülmesine izin veren geri saçılma ve uçuş süresi spektrometresi (BATS) mod11'dir.
Nötron saçılmasının önemli bir özelliği, tutarsız kesit σinc'in hidrojen için döteryumdan 40 kat daha yüksek bir değere sahip olması ve biyolojik örneklerde yaygın olarak bulunan diğer elementler için ihmal edilebilir olmasıdır. Bu nedenle, sıvı bir ortamdaki proteinlerin dinamikleri, deuterated bir tampon kullanılarak incelenebilir ve toz durumu, D2O ile hidratlanmış hidrojene protein tozu ile protein iç dinamiklerinin incelenmesine veyaH2O ile hidratlanmış perdeuterated protein tozu için hidrasyon suyunun incelenmesine izin verir. Sıvı halde, nötron geri saçılması tipik olarak proteinlerin kütle merkezi kendi kendine difüzyonuna (Fickian tipi difüzyon) ve iç dinamiklerine aynı anda erişilmesini sağlar. İkincisi, genellikle atlama difüzyon modeli veya diğerleri 3,18 tarafından tanımlanan omurga ve yan zincir hareketleridir. Hidrojene protein tozlarında, protein difüzyonu yoktur ve sadece iç dinamiklerin modellenmesi gerekir. Hidrasyon suyu için, su moleküllerinin translasyonel ve rotasyonel hareketlerinin katkıları, veri analizi sürecinde ayrım yapmalarını sağlayan momentum transferi q'ya farklı bir bağımlılık sunar17.
Bu makale, nötron geri saçılma yöntemini, açılabildiği, çapraz β paterni19,20 olarak adlandırılan β iplikçik yığınlarından oluşan kanonik bir formda toplanabildiği ve uzun lifler oluşturduğu tespit edilen proteinlerin incelenmesiyle göstermektedir. Bu, Alzheimer veya Parkinson hastalıkları gibi nörodejeneratif bozukluklardaki merkezi rolü nedeniyle kapsamlı bir şekilde çalışılan amiloid agregasyonudur21,22. Amiloid proteinlerinin incelenmesi, 23,24 oynayabilecekleri fonksiyonel rol veya yeni biyomateryallerin geliştirilmesi için yüksek potansiyelleri ile de motive edilmektedir25. Amiloid agregasyonunun fizikokimyasal belirleyicileri belirsizliğini korumaktadır ve son yıllarda muazzam ilerlemelere rağmen amiloid agregasyonunun genel bir teorisi mevcut değildir21,26.
Amiloid agregasyonu, protein yapısında ve stabilitesinde zamanla değişiklikler anlamına gelir; bunun çalışması, doğal olarak, protein konformasyon stabilitesi, protein fonksiyonu ve protein enerjisi manzarası ile bağlantılı dinamikleri ima eder27. Dinamik, en hızlı hareketler28 için entropik katkı yoluyla belirli bir durumun kararlılığı ile doğrudan bağlantılıdır ve protein fonksiyonu, ışığa duyarlı proteinler29 için sub-ps'den alan hareketleri için ms'ye kadar çeşitli zaman ölçeklerinde hareketlerle sürdürülebilir, bu da pikosaniye-nanosaniye dinamikleri30 ile kolaylaştırılabilir.
Amiloid proteinlerini incelemek için nötron geri saçılma spektroskopisini kullanmanın iki örneği, biri protein dinamiklerini incelemek için sıvı halde ve diğeri hidrasyon su dinamiklerini incelemek için hidratlanmış toz halinde. İlk örnek, lizozimin μm boyutlu kürelere (partiküller olarak adlandırılır) gerçek zamanlı olarak toplanması ile ilgilidir 5 veikincisi, insan proteini tau31'in doğal ve toplanmış durumlarında su dinamiklerinin karşılaştırılmasıdır.
Lizozim, bağışıklık savunmasında rol oynayan bir enzimdir ve 129 amino asit kalıntısından oluşur. Lizozim, deuterated tamponda 10.5 pD'de ve 90 ° C'lik bir sıcaklıkta partiküller oluşturabilir. Nötron saçılması ile, lizozimin kütle merkezi difüzyon katsayısının zaman evriminin, tiyoflavin T floresansının tek üstel kinetiğinin (amiloid çapraz β paternlerinin oluşumunu izlemek için kullanılan bir floresan probu32) izlediğini gösterdik, bu da oluşum partikül üst yapılarının ve çapraz β desenlerinin aynı oranda tek bir adımda gerçekleştiğini gösterir. Dahası, iç dinamikler toplama süreci boyunca sabit kalmıştır, bu da NBS enstrümanlarında gözlemlenemeyen hızlı bir konformasyonel değişim veya agregasyon sırasında protein iç enerjisinde önemli bir değişikliğin olmaması ile açıklanabilir.
İnsan proteini tau, Alzheimer hastalığı33'te özellikle rol oynayan 2N4R izoformu için 441 amino asitten oluşan içsel olarak düzensiz bir proteindir (IDP). Perdeuterated protein tau tozları üzerinde nötron geri saçılması kullanarak, hidrasyon suyu dinamiklerinin lif durumunda arttığını, translasyonel hareketlere maruz kalan daha yüksek bir su molekülü popülasyonu olduğunu gösterdik. Sonuç, hidrasyon suyu entropisindeki bir artışın tau'nun amiloid fibrilasyonunu tetikleyebileceğini düşündürmektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum sample holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, &#8805;99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td> 
			543047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D, 99.9%)</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>DLM-4DR-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning high-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.5901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 75871-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator plate, 140 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>00470.G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nPDyn</td>
			<td></td>
			<td>v3.x</td>
			<td>see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>92641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 0.5-10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 100-1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette ErgoOne 20-200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 1,000 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 10 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip TipOne 200 &#956;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-0206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>372072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution neutron spectroscopy to study picosecond-nanosecond dynamics of proteins and hydration water

Nötron saçılması, numunelerdeki dinamikleri çok çeşitli enerjiler için tahribatsız bir şekilde ve döteryum dışında etiketlemeden inceleme imkanı sunar. Özellikle, nötron geri saçılma spektroskopisi, saçılma sinyallerini aynı anda birden fazla saçılma açısında kaydeder ve ps-ns zaman ölçeğinde biyolojik sistemlerin dinamiklerini incelemek için çok uygundur. D2O ve muhtemelen deuterated tampon bileşenlerini kullanarak yöntem, sıvı haldeki proteinlerin hem kütle merkezi difüzyonunun hem de omurga ve yan zincir hareketlerinin (iç dinamikleri) izlenmesini sağlar.
Ek olarak, hidrasyon suyu dinamikleri,H2O ile hidratlanmış perdeuterated proteinlerin tozları kullanılarak incelenebilir. Bu makale, protein ve hidrasyon suyu dinamiklerini araştırmak için Institut Laue-Langevin (ILL) IN16B cihazında kullanılan iş akışını sunmaktadır. Çözelti numunelerinin ve hidratlanmış protein tozu numunelerinin buhar değişimi kullanılarak hazırlanması açıklanmaktadır. Hem protein hem de hidrasyon su dinamikleri için veri analizi prosedürü, bir nötron geri saçılma spektrometresinde elde edilebilecek farklı veri kümesi türleri (yarı elastik spektrumlar veya sabit pencere taramaları) için açıklanmaktadır.
Yöntem, amiloid proteinlerini içeren iki çalışma ile gösterilmiştir. Lizozimin μm boyutlu küresel agregalara (partiküllerle belirtilen) toplanmasının, IN16B üzerinde incelenen uzay ve zaman aralığında tek adımlı bir süreçte meydana geldiği gösterilirken, iç dinamikler değişmeden kalır. Ayrıca, tau'nun hidrasyon suyunun dinamikleri, perdeuterated proteinin hidratlanmış tozları üzerinde çalışılmıştır. Amiloid liflerinin oluşumu üzerine suyun translasyonel hareketlerinin aktive olduğu gösterilmiştir. Son olarak, protokoldeki kritik adımlar, nötron saçılmasının diğer deneysel biyofiziksel yöntemlere göre dinamiklerin incelenmesi ile ilgili olarak nasıl konumlandırıldığı tartışılmaktadır.

Lizozimin partiküllere toplanması, 90 ° C'de, deuterated bir tamponda 50 mg / mL'lik bir protein konsantrasyonu ile gerçekleştirildi (pD 10.5'te 0.1 M NaCl). Partiküllerin oluşumu, sıcaklığın 90 ° C'ye yükselmesiyle tetiklenir ve 6 saat içinde gerçekleşir (Ek Şekil S8). Veri toplama, yukarıdaki protokolde açıklandığı gibi IN16B üzerinde gerçekleştirilmiştir (veriler ILL tarafından kalıcı olarak küratörlüğünü yapmaktadır ve http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811 a...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water at JoVE.com

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Nötron geri saçılma spektroskopisi, proteinlerin ps-ns dinamiklerine ve hidrasyon suyuna tahribatsız ve etiketsiz bir erişim sunar. İş akışı, amiloid proteinleri üzerine iki çalışma ile sunulmaktadır: agregasyon sırasında lizozimin zamanla çözülmüş dinamikleri ve tau'nun lif oluşumu üzerine hidrasyon suyu dinamikleri üzerine.

Proteinlerin ve hidrasyon suyunun pikosaniye-nanosaniye dinamiklerini incelemek için yüksek çözünürlüklü nötron spektroskopisi

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Nötron geri saçılımları, radyasyon hasarı olmadan proteinlerin ve hidrasyon suyunun küresel difüzyonunu ve iç dinamiklerini ölçer. Nötron spektroskopisi aynı anda moleküler düzeyde uzaysal ve zaman korelasyonlarına erişir. Yumuşak madde ve biyolojik materyallerde, bu uzun menzilli bozukluk sistemlerinde yerel düzen hakkında dolaylı bilgi edinmek özellikle ilginçtir.Böylece nötron geri saçılması, biyoloji, kimya veya maddi anlamda dinamikleri incelemek için kullanılabilir. Bir diğer güçlü alan, örneğin piller ve yakıt hücreleri üzerinde yapılan çalışmalarla enerjidir. Nötron geri saçılması, Alzheimer ve Parkinson gibi nörodejeneratif hastalıklarda yer alan proteinlerin moleküler dinamiklerini incelemek için başarıyla kullanılmıştır.Elde edilen sonuçlar, bu patolojilerin moleküler özelliklerini daha iyi anlamamıza yardımcı olur ve daha iyi tanı geliştirmenin yolunu açabilir. Numune tutucuyu hazırlamak için, düz bir alüminyum numune tutucuyu ve indiyum tel contasını ve vidalarını suyla iyice temizleyerek başlayın, ardından etanol ile devam edin ve kurumasını bekleyin. Alt, kapak ve indiyum tel dahil olmak üzere numune tutucunun farklı kısımlarını hassas bir terazide ayrı ayrı tartın.Bir milimetrelik indiyum tel contayı numune tutucunun alt kısmının oluğuna yerleştirin ve iki ucun birleştiği yerde küçük bir örtüşme bırakın. Numune tutucunun alt kısmının iç yüzeyini dolduracak şekilde yaklaşık 100 miligram liyofilize protein ekleyin. Daha sonra, protein tozunu tamamen kurutmak için numune tutucuyu 24 saat boyunca fosfor pentoksit tozu içeren bir Petri kabına sahip bir kurutucuya yerleştirin.Kurutulmuş numunenin kütlesini elde etmek için indiyum contayı ve kurutulmuş tozu içeren numune tutucunun kurutulmuş alt kısmını tartın. Fosfor pentoksiti kurutucudan çıkarın ve tozu nemlendirmek için içine döteryum oksit içeren bir Petri kabı ve numuneyi koyun. Tam hidrojenden döteryum değişimine kadar kurutma ve nemlendirmeyi üç kez tekrarlayın.Hidrasyon seviyesini kontrol etmek için toz kütlesini düzenli olarak ölçün ve hidrasyon istenen seviyenin biraz üzerinde olduğunda, kütlenin yavaşça azalmasını bekleyin. İstenilen hidrasyon elde edildikten sonra, kapağı hızlı bir şekilde alt kısma yerleştirin ve buhar değişimini durdurmak için numune tutucuyu önce dört vidayla kapatın. Alt kısım ile kapak arasında boşluk görünmeyene kadar kalan tüm vidaları yerleştirin ve sıkın.Nötron deneyinden sonra sızıntılar yoluyla olası hidrasyon kaybı olup olmadığını kontrol etmek için kapalı numune tutucuyu tartın. Sıvı hal numunesini hazırlamak için, proteini deuterated tamponda çözün. Su kullanarak, numune tutucuya konulacak uygun sıvı hacmini belirleyin.Herhangi bir malzemeyi kullanmadan önce, iyonlaştırıcı radyasyon dozunun saatte 100 mikrosievertten az olduğundan emin olun. Ardından, numune çubuğunu iyice kurutun ve önceki numuneleri çıkarın. Numuneyi numune çubuğuna yerleştirin, ışın merkezine göre doğru merkezleme olup olmadığını kontrol edin ve numune çubuğunu kriyo fırınına yerleştirin.Nomad'da veri almak için, yürütme sekmesine gidin ve bir fırın kriyostat denetleyicisini fırlatma çubuğuna sürükleyip bırakın. Sıcaklığı 200 Kelvin'e ayarlayın. Hızlı modu ve 30 dakikalık bir zaman aşımını kullanın, böylece sıcaklığın dengelenmesi için zaman olur.Sıcaklık düşüşü sırasında veri toplama amacıyla sıcaklık rampasını arka planda çalıştırmak için tazeleyici simgesine tıklayın. IN16 Doppler ayarları denetleyicisini başlatma çubuğuna sürükleyip bırakın. Elastik bir sabit pencere tarama yapılandırması elde etmek için hız profilini doğru hıza, maksimum delta E'ye ayarlanmış, enerji ofsetini 0,00 mikro elektronvolta ve kanal sayısını 128'e ayarlayın.Bir sayım denetleyicisini başlatma çubuğuna sürükleyip bırakın, altyazı alanını verilerin kolayca tanımlanmasını sağlayan bir adla doldurun ve 60 tekrarla 30 saniyelik taramalar ayarlayın. Ardından, IN16 Doppler ayarları denetleyicisini sürükleyip başlatma çubuğuna bırakın. Yarı elastik nötron saçılma konfigürasyonu elde etmek için hız profilini işaretleyecek, ayarlanacak hızı saniyede 4,5 metre değeriyle ve kanal sayısını 2048'e ayarlayın.Bir sayım denetleyicisini sürükleyip bırakın ve altyazı alanını verilerin kolayca tanımlanmasını sağlayan bir adla doldurun. Dört tekrarla 30 dakikalık taramalar ayarlayın. Sıcaklık rampası için, bir fırın kriyostat kontrolörünü sürükleyip bırakın, sıcaklığı 310 Kelvin'e ayarlayın ve rampayı altı saniye boyunca 0,05 Kelvin'lik bir delta ile ayar noktasına ayarlayın.200 dakikalık bir zaman aşımı kullanın. 65 tekrarlı bir for döngüsü kullanın. İçeride, bir IN16 doppler ayar denetleyicisini, ardından sayım denetleyicisini takın ve 30 saniyelik tek bir tarama ayarlayın.Daha sonra, daha önce açıklandığı gibi IN16 Doppler ayarlarını ekleyin, ancak 1.5 mikro elektronvolt ve 1024 kanallı bir enerji ofseti kullanın. Ardından, sayım denetleyicisini takın ve üç dakikalık tek bir tarama ayarlayın. 312 Kelvin'in son yarı elastik nötron saçılımını elde etmek için, daha önce gösterildiği gibi yapılandırılmış IN16 Doppler ayarlarını ve sayım denetleyicilerini sürükleyip bırakın.Ardından, komut dosyasını çalıştırmak için başlat düğmesine basın. Lizozom elastik ve elastik olmayan sabit pencere taramaları, düşük momentum transferinde ve düşük enerji transferinde sinyalde bir artış gösterirken, yüksek enerji transferinde ve düşük momentum transferinde sinyal azaldı. Kütle difüzyon katsayısının ilk merkezi, nanosaniye başına 15 angstrom karesi idi ve daha sonra zamanla katlanarak azaldı.220 Kelvin'den daha yüksek sıcaklıklarda, tau liflerinin etrafındaki hidrasyon suyu, tau monomerlerinin etrafından önemli ölçüde daha hareketliydi. Translasyonel harekete geçen su moleküllerinin fraksiyonu ve su moleküllerinin hem translasyonel hem de rotasyon difüzyon katsayıları liflerin etrafında artmıştır. Protein konsantrasyonu, nötron akısı veya numune tutucu tampon arka planından kaynaklanan nötron geri saçılma sınırlamaları nedeniyle proteinli proteinler için ml başına 2000 miligram veya ml başına en az 20 miligram olmalıdır.Nötron geri saçılması, örneğin, doğal çevresel proteinler olan suyun, örneğin ilaç dağıtımı gibi biyoteknolojik uygulamalar için sentetik bir polimerle nasıl tamamen değiştirilebileceğini anlamak için yakın zamanda uygulanmıştır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) ve Microscale Thermophoresis (MST) tarafından küresel ve ipliksi protein etkileşimleri ölçme

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Tek Hücreli İlaç Alımı, Metabolizması ve Etkileri Üzerine Entegre Raman Spektroskopisi ve Kütle Spektrometresi Platformu

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Olgun Pirincin Enine Kesiti (Oryza sativa L.) Hareketsizleştirme Desteği Olarak Pipet İpuçlarını Kullanarak Elektron Mikroskopi Görüntülemesini Taramak için Çekirdekler

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...