Name: establishing organoids from human tooth as a powerful tool toward mechanistic research and regenerative therapy
Uploaded: 2022-04-13T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy at JoVE.com

نحن ممتنون لجميع موظفي جراحة الفم والوجه والفكين (MKA) في UZ Leuven ، وكذلك المرضى ، لمساعدتهم التي لا تقدر بثمن في جمع الأضراس الثالثة المستخرجة حديثا. نود أيضا أن نشكر الدكتورة رينهيلد جاكوبس والدكتورة إليزابيث تيجسكينز على مساعدتهما في جمع العينات. تم دعم هذا العمل من خلال منح من KU Leuven (BOF) و FWO-Flanders (G061819N). L.H. هو زميل دكتوراه FWO (1S84718N).

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل لجنة الأخلاقيات للأبحاث UZ / KU Leuven (13/0104U). تم الحصول على الأضراس الثالثة المستخرجة (ضرس العقل) بعد موافقة المرضى المستنيرة.
1. التحضيرات
<ol><li>قم بتسخين صفيحة استزراع 48 بئرا لمدة 15-20 ساعة في حاضنة CO2 بنسبة 1.9٪ عند 37 درج?...

<ol>
	<li>Yu, T., Klein, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+tooth+development,+homeostasis+and+repair.">Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair.</a> Development (Cambridge). 147 (2), (2020).</li><li>Arrow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+enamel+defects,+caries+experience+and+oral+health-related+quality+of+life:+a+cohort+study.">Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study.</a> Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).</li><li>Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L., Zavan, B., Bressan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+Stem+Cells+for+Tooth+Regeneration.">Dental Stem Cells for Tooth Regeneration.</a> Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. , (2016).</li><li>Mitsiadis, T. A., Orsini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+a+new+era+in+dentistry:+stem+cell-based+approaches+for+tooth+and+periodontal+tissue+regeneration.">Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration.</a> Frontiers in Physiology. 7, 357 (2016).</li><li>Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+dental+stem+cell-based+research+approaches:+the+future+of+dentistry.">Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry.</a> Stem Cells International. 2016, 7231038 (2016).</li><li>Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+epithelial+cell+rests+of+malassez+can+differentiate+into+ameloblast-like+cells.">Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).</li><li>Davis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+epithelial+cell+rests+of+Malassez+on+the+bicentennial+of+their+description.">A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description.</a> Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).</li><li>Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+adult+epithelial+stem+cells+from+the+periodontal+ligament.">Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament.</a> Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).</li><li>Kim, G. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+establishment+of+dental+epithelial-like+stem+cells+derived+from+human+ESCs+and+iPSCs.">Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).</li><li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Hertwig's+epithelial+root+sheath/+epithelial+rests+of+malassez+cell+line+from+human+periodontium.">Establishment of Hertwig's epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium.</a> Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).</li><li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+of+the+stem+cell+markers+in+human+hertwig's+epithelial+root+sheath/Epithelial+rests+of+Malassez+cells.">Expression profile of the stem cell markers in human hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells.</a> Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).</li><li>Tsunematsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+odontogenic+epithelial+cells+derived+from+epithelial+rests+of+Malassez+possess+stem+cell+properties.">Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).</li><li>Artegiani, B., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+and+application+of+3D-organoid+technology.">Use and application of 3D-organoid technology.</a> Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).</li><li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+from+endometrial+disease+capture+clinical+heterogeneity+and+are+amenable+to+drug+screening.">Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).</li><li>Cox, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+pituitary+as+a+novel+research+model+toward+pituitary+stem+cell+exploration.">Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration.</a> Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability.">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).</li><li>Schutgens, F., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+tools+for+understanding+biology+and+treating+diseases).">Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases).</a> Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).</li><li>Hemeryck, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+human+tooth+showing+epithelial+stemness+phenotype+and+differentiation+potential.">Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153 (2022).</li><li>Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+organoids:+progress+and+challenges.">Oral organoids: progress and challenges.</a> Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation.">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 4963 (2020).</li><li>Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+rests+of+malassez+contain+unique+stem+cell+populations+capable+of+undergoing+epithelial-mesenchymal+transition.">Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition.</a> Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).</li><li>Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+development+of+Hertwig's+epithelial+root+sheath.">Evolution and development of Hertwig's epithelial root sheath.</a> Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).</li><li>Fukumoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+functions+of+enamel+matrices+in+calcified+tissues.">New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues.</a> Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).</li><li>Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERM+functions,+EGF+and+orthodontic+movement+or+Why+doesn't+orthodontic+movement+cause+alveolodental+ankylosis.">ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn't orthodontic movement cause alveolodental ankylosis.</a> Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).</li><li>Guajardo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+epidermal+growth+factor+in+cat+paradental+tissues+during+tooth+movement.">Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement.</a> American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Gon&#231;alves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+quantitative+reduction+of+rests+of+Malassez+according+to+age.">Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age.</a> Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).</li><li>Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+Model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: Model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADULT+(acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth)+syndrome:+a+case+report+from+India.">ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India.</a> Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194 (2018).</li><li>. Future Health Biobank Available from: <a target="_blank" href="https://futurehealthbiobank.com/ch-en/">https://futurehealthbiobank.com/ch-en/</a> (2022)</li><li>Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+co-culture+of+human+intestinal+organoids+and+lamina+propria-derived+CD4++T+cells.">In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100519 (2021).</li><li>Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+cell+communication+in+cancer+with+organoids:+Making+the+complex+simple.">Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166 (2020).</li><li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture.">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyisocyanide+hydrogels+as+a+tunable+platform+for+mammary+gland+organoid+formation.">Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation.</a> Advanced Science. 7 (18), 2001797 (2020).</li><li>Mollaki, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+challenges+in+organoid+use.">Ethical challenges in organoid use.</a> BioTech. 10 (3), 12 (2021).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول الجيل الفعال والقابل للتكرار من المواد العضوية بدءا من الأسنان البشرية. على حد علمنا ، هذه هي المنهجية الأولى لإنشاء العضوية ذات المفهوم الحالي (الظهارية) بدءا من أنسجة الأسنان البشرية. المواد العضوية قابلة للتوسيع على المدى الطويل وتعرض النمط الظاهري الظاهري للجذع ال?...

الأسنان لها أدوار أساسية في المضغ الغذائي والكلام والرفاهية النفسية (الصورة الذاتية). يتكون السن البشري من أنسجة معدنية عالية الكثافة والصلابة متفاوتة1. مينا الأسنان ، المكون الرئيسي لتاج الأسنان ، هو أعلى الأنسجة المعدنية في جسم الإنسان. أثناء تكوين المينا (تكوين المينا) ، عندما تتطور الأسنان ، تتمايز الخلايا الجذعية الظهارية للأسنان (DESCs) إلى خلايا مكونة للمينا (الخلايا المينائية). بمجرد تشكيله ، نادرا ما يتم إصلاح المينا أو تجديدها بسبب فقدان الاستماتة للخلايا النخلية في بداية ثوران الأسنان1. يتم حاليا استعادة أنسجة المينا التالفة ، كما هو ناجم عن الصدمة أو الأمراض البكتيرية ، باستخدام مواد اصطناعية ؛ ومع ذلك ، فإن هؤلاء منزعجون من أوجه القصور المهمة مثل التسرب الدقيق ، والتكامل العظمي السفلي والمرساة ، والعمر الافتراضي المحدود ، وعدم وجود إصلاح يعمل بكامل طاقته2. وبالتالي ، فإن وجود ثقافة قوية وموثوقة من DESCs البشرية مع القدرة على توليد الخلايا النخلية والقدرة على إنتاج الأنسجة المعدنية سيكون خطوة كبيرة إلى الأمام في مجال تجديد الأسنان.
المعرفة حول النمط الظاهري البشري DESC والوظيفة البيولوجية نادرة3،4،5. ومن المثير للاهتمام ، تم اقتراح وجود DESCs من الأسنان البشرية في مساند الخلايا الظهارية في Malassez (ERM) ، وهي مجموعات الخلايا الموجودة داخل بصيلات الأسنان (DF) ، والتي تحيط بالأسنان غير المنفجرة ، وتظل موجودة في الرباط اللثوي حول الجذر بمجرد أن تندلع السن1. تم العثور على خلايا ERM المستزرعة بالاشتراك مع لب الأسنان للتمييز إلى خلايا تشبه الأرومة النخلية وتوليد أنسجة تشبه المينا6. ومع ذلك ، كانت الدراسات العميقة للدور المحدد لخلايا ERM في توليد المينا (إعادة) محدودة بسبب عدم وجود نماذج دراسة موثوقة7. يتم إعاقة أنظمة ERM الحالية في المختبر بسبب العمر الافتراضي المحدود والخسارة السريعة للنمط الظاهري في ظروف 2D المستخدمة بشكل قياسي 8,9,10,11,12. وبالتالي ، هناك حاجة ماسة إلى نظام قابل للسحب في المختبر لتوسيع ودراسة وتمييز DESCs البشرية بأمانة.
خلال العقد الماضي ، تم تطبيق تقنية قوية لزراعة الخلايا الجذعية الظهارية في المختبر بنجاح على عدة أنواع من الأنسجة الظهارية (البشرية) لدراسة بيولوجيتها وكذلك المرض13،14،15،16. تمكن هذه التقنية الخلايا الجذعية الظهارية للأنسجة من التطور الذاتي إلى إنشاءات خلايا 3D (أي عضويات) عند زرعها في مصفوفة خارج الخلية (ECM) - تحاكي السقالة (عادة ، Matrigel) وتزرع في وسط محدد يكرر إشارات الخلايا الجذعية المتخصصة في الأنسجة و / أو تكوين الجنين. تشمل عوامل النمو النموذجية اللازمة لتطوير العضوية عامل نمو البشرة (EGF) ومنشطات موقع تكامل MMTV بدون أجنحة (WNT)14،15،16. تتميز المواد العضوية الناتجة عن ذلك بالإخلاص الدائم في محاكاة الخلايا الجذعية الظهارية الأصلية للأنسجة ، بالإضافة إلى قابلية عالية للتوسع مع الحفاظ على نمطها الظاهري وخصائصها الوظيفية ، وبالتالي التغلب على توافر الأنسجة البشرية الأولية المحدودة في كثير من الأحيان كما تم الحصول عليها من العيادة. لإنشاء المواد العضوية ، لا يلزم عزل الخلايا الجذعية الظهارية عن الأنسجة غير المتجانسة (أي التي تضم أنواعا أخرى من الخلايا مثل الخلايا الوسيطة) قبل الزراعة لأن الخلايا الوسيطة لا تلتصق ب ECM أو تزدهر فيه ، مما يؤدي في النهاية إلى عضويات ظهارية بحتة13،16،17،18،19 . وقد أدت هذه التكنولوجيا الواعدة ومتعددة الاستخدامات إلى تطوير نماذج عضوية متعددة من مختلف الأنسجة الظهارية البشرية. ومع ذلك ، فإن المواد العضوية المشتقة من الأسنان البشرية ، ذات القيمة للدراسة العميقة لتطور الأسنان وتجديدها ومرضها ، لم يتم إنشاؤها بعد20,21. لقد نجحنا مؤخرا في تطوير مثل هذا النموذج العضوي الجديد بدءا من أنسجة DF من الأضراس الثالثة (ضرس العقل) المستخرجة من المرضى المراهقين19.
هنا ، نصف بروتوكول تطوير الثقافات العضوية الظهارية من الأسنان البشرية البالغة (أي من DF للأضراس الثالثة) (الشكل 1A). تعبر المواد العضوية الناتجة عن علامات الجذع المرتبطة ب ERM بينما تكون قابلة للتوسع على المدى الطويل. ومن المثير للاهتمام ، على عكس معظم النماذج العضوية الأخرى ، أن EGF المطلوب عادة زائد عن الحاجة لتطوير ونمو عضوي قوي. ومن المثير للاهتمام ، أن المواد العضوية الجذعية تظهر خصائص تمايز الأرومة النمائية ، وبالتالي تحاكي ميزات وعمليات ERM / DESC التي تحدث في الجسم الحي. يسمح النموذج العضوي الجديد والفريد من نوعه الموصوف هنا باستكشاف بيولوجيا DESC واللدونة والقدرة على التمايز ويفتح الباب لاتخاذ الخطوات الأولى نحو نهج تجديد الأسنان.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well flat bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Bovine (cell culture grade)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47330.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMELX antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-365284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15200018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (without vitamin A)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7202191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD44 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK14 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MA5-11599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>6310146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryobox</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>375353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1:1 F12 without Fe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>074-90715A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM powder high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52100039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663 - 10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding workstation, 220 to 240 Vac</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute, &#8805;99.8% (EtOH)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2 (= basic FGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>234-FSE-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF8</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RTN350-1KT</td>
			<td>Includes 1% &#946;-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Niko Mechanisms</td>
			<td>170-40050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101194M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>688001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITGA6 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA012696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15505739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium eagle (&#945;MEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P63 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab124762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap Pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>Marking pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA), 16%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (P20, P200, P1000)</td>
			<td>Eppendorf or others</td>
			<td>2231300006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette (3.5&#160;mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSPO1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (p38i)</td>
			<td>Biotechne (Tocris)</td>
			<td>1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel (surgical blade)</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHH</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>464-SH-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone molds (Heating block)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>102415K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-pyruvate (C3H3NaO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Real-Time PCR System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup-GP, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1000 &#956;L pipette tips with filter</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>740288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 20 &#956;L pipette tips with filter</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>774288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 200 &#956;L pipette tips with and without filter</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>739288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile H2O</td>
			<td>Fresenius</td>
			<td>B230531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III first-strand synthesis supermix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11752-050</td>
			<td>Reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12505356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Serva</td>
			<td>36760.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium+DAPI</td>
			<td>Labconsult NV</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Antifade mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT3a</td>
			<td>Biotechne (Tocris)</td>
			<td>5036-WN-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes, 99%, for biochemistry and histology</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2,89,75,325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing organoids from human tooth as a powerful tool toward mechanistic research and regenerative therapy

الأسنان ذات أهمية رئيسية في الحياة ليس فقط للمضغ الغذائي والكلام ولكن أيضا للرفاهية النفسية. المعرفة حول تطور الأسنان البشرية والبيولوجيا نادرة. على وجه الخصوص ، لا يعرف الكثير عن الخلايا الجذعية الظهارية للسن ووظيفتها. نجحنا في تطوير نموذج عضوي جديد يبدأ من أنسجة الأسنان البشرية (أي جريب الأسنان ، المعزول عن أسنان العقل المستخرجة). المواد العضوية قابلة للتوسع بقوة وعلى المدى الطويل وتلخص حجرة الخلايا الجذعية الظهارية للأسنان البشرية المقترحة من حيث التعبير عن العلامة وكذلك النشاط الوظيفي. على وجه الخصوص ، فإن المواد العضوية قادرة على الكشف عن عملية تمايز الأرومة النخلية كما تحدث في الجسم الحي أثناء تكوين الأميلوجينيا. سيوفر هذا النموذج العضوي الفريد أداة قوية لدراسة ليس فقط تطور الأسنان البشرية ولكن أيضا أمراض الأسنان ، وقد يمهد الطريق نحو العلاج التجديدي للأسنان. يمكن أن يكون استبدال الأسنان المفقودة بسن بيولوجي يعتمد على هذا النموذج العضوي الجديد بديلا جذابا للزرع القياسي الحالي للمواد الاصطناعية.

تطور الأسنان العضوية نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لإنشاء ثقافات عضوية من أنسجة DF البشرية المكتسبة بعد استخراج ضرس العقل (الشكل 1A). يتم فصل DF المعزول إنزيميا وميكانيكيا. يتم استزراع الخلايا التي تم الحصول عليها داخل BMM في الوسائط التي تم تعريفها تجريبيا من أجل التطور ...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy at JoVE.com

Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy

نقدم بروتوكولا لتطوير الثقافات العضوية الظهارية بدءا من الأسنان البشرية. المواد العضوية قابلة للتوسع بقوة وتلخص الخلايا الجذعية الظهارية للسن ، بما في ذلك قدرتها على تمايز الأرومة المينيلولوجية. يوفر النموذج العضوي الفريد أداة واعدة لدراسة بيولوجيا الأسنان البشرية (الخلايا الجذعية) مع وجهات نظر لنهج تجديد الأسنان.

إنشاء المواد العضوية من الأسنان البشرية كأداة قوية نحو البحث الميكانيكي والعلاج التجديدي

Teeth are of key importance in life not only for food mastication and speech but also for psychological well-being. Knowledge on human tooth development ...

يوفر هذا النموذج العضوي الجديد المشتق من الأسنان البشرية أول أداة قوية لفك رموز بيولوجيا الخلايا الجذعية للأسنان البشرية مع وجهات نظر نحو التطبيقات التجديدية للأسنان. في الوقت الحاضر ، يعد نموذج الأسنان العضوي هذا الأداة الوحيدة المتاحة لنمو وتوسيع الخلايا الجذعية الظهارية للأسنان البشرية بشكل موثوق وقوي. يمكن تطبيق هذا البروتوكول العضوي لإنشاء نماذج بحثية ، ليس فقط من الأسنان الصحية ، ولكن أيضا من الأسنان المريضة مثل أورام الأسنان والتأثير البكتيري.قد يكشف استكشاف نماذج الأمراض هذه عن أهداف علاجية جديدة. هذا النموذج العضوي مفيد للغاية في فك رموز عملية تكوين المينا في الأسنان البشرية ، وقد يمكن من بناء أجزاء الأسنان مثل المينا لأغراض توليدية. ستوضح الإجراء لارا هيمريك ، طالبة الدكتوراه في مجموعتي البحثية.للبدء ، اجمع الأضراس الثالثة مع بصيلات الأسنان المرتبطة بها في وسط التجميع الموضوع على الجليد وانقل محتوى الأنابيب إلى طبق بتري. امسك السن باستخدام ملاقط واعزل بصيلات الأسنان بعناية باستخدام شفرة جراحية. اغسل الدم المتبقي من بصيلات الأسنان عن طريق وضع أنسجة بصيلات الأسنان لفترة وجيزة في البئر الأول من الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة 20 ثانية ، ثم انقله إلى صفيحة الإيثانول التالية لمدة 20 ثانية ثم إلى بئر الإيثانول الثالث.استمر في شطفه في الآبار المالحة العازلة بالفوسفات ثلاث مرات متبوعة بشطف بصيلات الأسنان في بصيلات الأسنان الثلاثة المتبقية التي تجمع آبارا متوسطة لمدة أقصاها 20 دقيقة في المجموع. انقل بصيلات الأسنان المغسولة إلى طبق بتري جديد. قطع قطعة صغيرة من واحدة من بصيلات الأسنان لتثبيت بارافورمالديهايد وتخزينها في أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على 500 ميكرولتر من وسط التجميع لمدة أقصاها ست ساعات.افرم بقية بصيلات الأسنان إلى قطع صغيرة وانقلها إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر يحتوي على أربعة ملليلترات من وسط التفكك المحمى مسبقا ، ثم احتضن الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين في حمام مائي. كل 15 دقيقة ، ماصة وسط تفكك بصيلات الأسنان وخلطها لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة زجاجية لتسريع تفكك الأنسجة. عندما لا يتم ملاحظة قطع من بصيلات الأسنان ، تابع التفكك باستخدام ماصة باستور ضيقة ومصقولة بالنار.في غضون ذلك ، قم بإعداد 10 ملليلتر من الوسط A يحتوي على 100 ميكرولتر من DNase وأضف خمسة ملليلتر من هذا الوسط إلى كل أنبوب مع بصيلات الأسنان المنفصلة. احتضان لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. شطف الفلتر مع ملليلتر واحد من A.الجمع بين عدة أنابيب من بصيلات الأسنان المنفصلة من مريض واحد في هذه الخطوة والطرد المركزي تعليق الخلية المصفاة في 200 مرات غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.إزالة supernatant. أعد تعليق الكريات في ملليلتر واحد من الوسط المحدد الخالي من المصل وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 ملليلتر. حساب تركيز الخلية باستخدام عداد خلية آلي وحساب عدد الآبار التي يمكن زرعها.يتكون المزيج النهائي من تعليق الخلية ومصفوفة الغشاء السفلي بنسبة 30 إلى 70. قم بإزالة الكمية المناسبة من supernatant وأعد تعليقها ببطء للحصول على نسبة 70 إلى 30 من مصفوفة الغشاء السفلي البارد إلى تعليق الخلية للطلاء. بمجرد إعادة تعليقه في مصفوفة الغشاء السفلي ، احتفظ بأنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد لتجنب تصلب مصفوفة الغشاء السفلي.ماصة 20 ميكرولتر من قطرات مصفوفة الغشاء السفلي في وسط لوحة الاستزراع المسخنة مسبقا 48 بئرا. اقلب الصفيحة رأسا على عقب وضعها لتتصلب في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 1.9٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. أضف مثبط كيناز المرتبط بالرو والأمفوتريسين B إلى وسط الأسنان العضوي وقم بتسخين الوسط مسبقا في حمام مائي 37 درجة مئوية.خذ لوحة 48 بئرا من الحاضنة. ضعه في وضع مستقيم وأضف 250 ميكرولتر من الوسط المسرف المحضر مسبقا إلى كل بئر مع قطرة مصفوفة غشاء سفلي تحتوي على الخلايا وأعد اللوحة إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون. لتحديث الوسط ، قم بإمالة اللوحة بزاوية 45 درجة.قم بإزالة الوسط السابق بلطف ، مع تجنب لمس قطرة مصفوفة الغشاء السفلي وإضافة 250 ميكرولتر من الوسط العضوي الجديد للأسنان المسخن مسبقا كل يومين إلى ثلاثة أيام. لتنفيذ مرور المواد العضوية ، قم بإزالة الوسط من الآبار مع المواد العضوية وتجمع ما يصل إلى أربعة آبار ملتقية. لجمع المواد العضوية ، أضف 400 ميكرولتر من الوسط المحدد الخالي من المصل البارد المثلج لكل بئر مباشرة على قطرة مصفوفة الغشاء وقم بماصة الوسط مرارا وتكرارا لأعلى ولأسفل حتى يتم إزاحة القطرة بأكملها.إذا تم تجميع الآبار ، فقم بنقل 400 ميكرولتر من البئر الأول إلى البئر التالي لإزاحة القطرات العضوية التي تحتوي عليها. انقل مجموعة الطرد العضوي الذي تم إزاحته إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ميكرولتر وكرر إضافة وسط محدد خال من المصل حتى يتم جمع جميع الهياكل العضوية من الآبار. الطرد المركزي في 200 مرة غرام لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية.قم بإزالة المادة الفائقة من أنبوب جهاز الطرد المركزي وأعد تعليق الكريات في أليكوت مسخن مسبقا من TrypLE Express. أضف 400 ميكرولتر من الوسط المحدد الخالي من المصل البارد المثلج لتعطيل الإنزيم وطرده مركزيا عند 200 مرة جم لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية. إزالة supernatant.قم بتغطية طرف مسبقا بوسط محدد خال من المصل البارد وأعد تعليق الكريات العضوية في حالة معقمة. أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من الوسط المحدد الخالي من المصل البارد المثلج لطريقة المرور المنخفض. ادفع طرف الماصة المفرغ بالكامل على الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الصغير لتقليل قطره.ماصة لأعلى ولأسفل لمدة خمس دقائق لتعطيل المواد العضوية ميكانيكيا. بالنسبة لطريقة المرور الأعلى ، أعد تعليق الكريات في 700 ميكرولتر من الوسط المحدد الخالي من المصل البارد مع طرف P1000. أضف طرف P200 إلى طرف P1000 هذا وقم بتغطيته مسبقا بوسط محدد خال من المصل البارد المثلج.منع تكوين فقاعة الهواء عن طريق ضبط إعداد حجم الماصة. تطمح إلى ما لا يقل عن 90٪ من الحجم المتوسط مع المواد العضوية والماصة صعودا وهبوطا لمدة خمس دقائق لتعطيل المواد العضوية ميكانيكيا. عادة ما تتطور المواد العضوية بعد أسبوعين من بذر خلايا جريب الأسنان.المواد العضوية قابلة للتوسيع على المدى الطويل حتى 11 مقطعا. إن بذر حوالي 20،000 خلية لكل قطرة مصفوفة غشاء سفلي ينتج كثافة مثالية من المواد العضوية ، في حين أن بذر أعداد خلايا أعلى يؤدي إلى نمو عضوي دون المستوى الأمثل مع عضويات مماثلة بكثافة عالية جدا بسبب عدم كفاية المساحة للنمو. تظهر المواد العضوية المطورة مظهرا كثيفا وتحتوي على خلايا تعرض نسبة عالية من النواة الصبغية.علاوة على ذلك ، تعبر المواد العضوية عن علامة ERM cytokeratin 14 التي تؤكد أصلها الظهاري وعلامات ERM المقترحة الأخرى ، مثل P63 و CD44 و integrin alpha-6. تعبر Organoids عن SOX2 ، وهي علامة DESC معروفة في الفئران. ومن المثير للاهتمام ، أن المكون الرئيسي لمصفوفة المينا ، الأميلوجينين ، يتم التعبير عنه أيضا في المواد العضوية.تحتفظ المواد العضوية بالنمط الظاهري لجذع ERMM أثناء المرور كما هو موضح في التعبير المستقر للعلامات. من أجل النمو الأمثل للعضويات على المدى الطويل ، من الضروري استخدام طرق المرور الموصى بها أو طرق المرور المنخفضة أو طرق المرور الأعلى. بمجرد تشكيلها ، يمكن استخدام المواد العضوية للتدقيق في عملية تكوين الأميلو بشكل أكبر وترسب مصفوفة المينا الذي لم يتحقق حاليا في أبحاث طب الأسنان.تمكن هذه التقنية من استكشاف بيولوجيا الخلايا الجذعية الظهارية للأسنان ، وعملية تكوين المينا ، والتفاعل مع اللحمة المتوسطة للأسنان ، وهو تفاعل ضروري لتشكيل الأسنان الصحيح.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

العلاج الجيني الفيروسة الغدانية لمرضى السكري اعتلال القرنية: التأثيرات على شفاء الجروح ووقف علامة الخلية التعبير في الإنسان القرنيات الجهاز مثقف والخلايا الظهارية الحوفي

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

جيل من التكامل خالية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من الخلايا الطرفية الإنسان الدم وحيدات النوى عن طريق Episomal المتجهات

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

التجهيز لانسجة القلب البشري تجاه المصفوفة خارج الخلية التي ذاتية تجميع المائية في المختبر و في فيفو التطبيقات

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

جيل أورجانويدس الدماغي موحدة واستنساخه من نوع فوريبرين من الإنسان فعل الخلايا الجذعية Pluripotent

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

جيل بانكريتويدس التعبير عن الأنسولين خالية من السقالة، ثلاثي الأبعاد من الماوس المتكفل البنكرياس في المختبر

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

توليد الخلايا الجذعية العصبية المستحثة من الخلايا أحادية النووية الطرفية والتمايز نحو سلائف الخلايا العصبية الدوبامين لدراسات زرع

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films

تشكيل الخلايا الخلايا المعتمية الإنسان على أفلام الشيتوسان

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

تقييم الضرر التأكسدي في الخلايا السطحية الرئيسية للفأرة /الخلايا الجذعية استجابة للأضرار فوق البنفسجية-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

طريقة ثابتة ذاتية التوجيه لتوليد الأعضاء الدماغية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

إعداد مكتبات RNA الصغيرة لتسلسل من أجنة الماوس المبكر

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...