Name: establishing organoids from human tooth as a powerful tool toward mechanistic research and regenerative therapy
Uploaded: 2022-04-13T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy at JoVE.com

We zijn alle medewerkers van de Orale en Maxillofaciale Chirurgie (MKA) van UZ Leuven, alsook de patiënten, dankbaar voor hun onschatbare hulp bij het verzamelen van vers geëxtraheerde derde kiezen. We willen ook Dr. Reinhilde Jacobs en Dr. Elisabeth Tijskens bedanken voor hun hulp bij de monsterverzameling. Dit werk werd ondersteund door subsidies van KU Leuven (BOF) en FWO-Vlaanderen (G061819N). L.H. is een FWO Ph.D. Fellow (1S84718N).

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie Onderzoek UZ/KU Leuven (13/0104U). Geëxtraheerde derde kiezen (verstandskiezen) werden verkregen na geïnformeerde toestemming van de patiënten.
1. Voorbereidingen
<ol><li>Prewarm een 48-well kweekplaat gedurende 15-20 uur in een 1,9% CO2-incubator bij 37 °C.</li>
	<li>Vloeibaar maken van een Matrigel aliquot (groeifactor-gereduceerd; fenol roodvrij; verder aangeduid als keldermembraanmat...

<ol>
	<li>Yu, T., Klein, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+tooth+development,+homeostasis+and+repair.">Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair.</a> Development (Cambridge). 147 (2), (2020).</li><li>Arrow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+enamel+defects,+caries+experience+and+oral+health-related+quality+of+life:+a+cohort+study.">Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study.</a> Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).</li><li>Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L., Zavan, B., Bressan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+Stem+Cells+for+Tooth+Regeneration.">Dental Stem Cells for Tooth Regeneration.</a> Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. , (2016).</li><li>Mitsiadis, T. A., Orsini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+a+new+era+in+dentistry:+stem+cell-based+approaches+for+tooth+and+periodontal+tissue+regeneration.">Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration.</a> Frontiers in Physiology. 7, 357 (2016).</li><li>Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+dental+stem+cell-based+research+approaches:+the+future+of+dentistry.">Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry.</a> Stem Cells International. 2016, 7231038 (2016).</li><li>Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+epithelial+cell+rests+of+malassez+can+differentiate+into+ameloblast-like+cells.">Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).</li><li>Davis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+epithelial+cell+rests+of+Malassez+on+the+bicentennial+of+their+description.">A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description.</a> Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).</li><li>Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+adult+epithelial+stem+cells+from+the+periodontal+ligament.">Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament.</a> Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).</li><li>Kim, G. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+establishment+of+dental+epithelial-like+stem+cells+derived+from+human+ESCs+and+iPSCs.">Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).</li><li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Hertwig's+epithelial+root+sheath/+epithelial+rests+of+malassez+cell+line+from+human+periodontium.">Establishment of Hertwig's epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium.</a> Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).</li><li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+of+the+stem+cell+markers+in+human+hertwig's+epithelial+root+sheath/Epithelial+rests+of+Malassez+cells.">Expression profile of the stem cell markers in human hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells.</a> Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).</li><li>Tsunematsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+odontogenic+epithelial+cells+derived+from+epithelial+rests+of+Malassez+possess+stem+cell+properties.">Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).</li><li>Artegiani, B., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+and+application+of+3D-organoid+technology.">Use and application of 3D-organoid technology.</a> Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).</li><li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+from+endometrial+disease+capture+clinical+heterogeneity+and+are+amenable+to+drug+screening.">Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).</li><li>Cox, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+pituitary+as+a+novel+research+model+toward+pituitary+stem+cell+exploration.">Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration.</a> Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability.">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).</li><li>Schutgens, F., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+tools+for+understanding+biology+and+treating+diseases).">Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases).</a> Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).</li><li>Hemeryck, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+human+tooth+showing+epithelial+stemness+phenotype+and+differentiation+potential.">Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153 (2022).</li><li>Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+organoids:+progress+and+challenges.">Oral organoids: progress and challenges.</a> Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation.">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 4963 (2020).</li><li>Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+rests+of+malassez+contain+unique+stem+cell+populations+capable+of+undergoing+epithelial-mesenchymal+transition.">Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition.</a> Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).</li><li>Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+development+of+Hertwig's+epithelial+root+sheath.">Evolution and development of Hertwig's epithelial root sheath.</a> Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).</li><li>Fukumoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+functions+of+enamel+matrices+in+calcified+tissues.">New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues.</a> Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).</li><li>Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERM+functions,+EGF+and+orthodontic+movement+or+Why+doesn't+orthodontic+movement+cause+alveolodental+ankylosis.">ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn't orthodontic movement cause alveolodental ankylosis.</a> Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).</li><li>Guajardo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+epidermal+growth+factor+in+cat+paradental+tissues+during+tooth+movement.">Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement.</a> American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Gon&#231;alves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+quantitative+reduction+of+rests+of+Malassez+according+to+age.">Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age.</a> Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).</li><li>Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+Model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: Model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADULT+(acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth)+syndrome:+a+case+report+from+India.">ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India.</a> Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194 (2018).</li><li>. Future Health Biobank Available from: <a target="_blank" href="https://futurehealthbiobank.com/ch-en/">https://futurehealthbiobank.com/ch-en/</a> (2022)</li><li>Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+co-culture+of+human+intestinal+organoids+and+lamina+propria-derived+CD4++T+cells.">In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100519 (2021).</li><li>Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+cell+communication+in+cancer+with+organoids:+Making+the+complex+simple.">Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166 (2020).</li><li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture.">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyisocyanide+hydrogels+as+a+tunable+platform+for+mammary+gland+organoid+formation.">Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation.</a> Advanced Science. 7 (18), 2001797 (2020).</li><li>Mollaki, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+challenges+in+organoid+use.">Ethical challenges in organoid use.</a> BioTech. 10 (3), 12 (2021).</li></ol>

Dit protocol beschrijft de efficiënte en reproduceerbare generatie van organoïden vanaf de menselijke tand. Voor zover wij weten, is dit de eerste methodologie voor het vaststellen van de huidige (epitheliale) organoïden, uitgaande van menselijk tandweefsel. De organoïden zijn langdurig uitbreidbaar en vertonen een tandepitheelstamfenotype, waarbij DESC's worden gedupliceerd die eerder in het ERM-compartiment van de DF7 zijn gemeld. Bovendien repliceren de organoïden functionele DESC/ERM-kenm...

Tanden hebben een essentiële rol bij voedselmasticatie, spraak en psychologisch welzijn (zelfbeeld). De menselijke tand bestaat uit sterk gemineraliseerde weefsels met verschillende dichtheid en hardheid1. Tandglazuur, het hoofdbestanddeel van de tandkroon, is het hoogste gemineraliseerde weefsel in het menselijk lichaam. Tijdens de vorming van glazuur (amelogenese), wanneer tanden zich ontwikkelen, differentiëren tandheelkundige epitheelstamcellen (DESC's) in glazuurvormende cellen (ameloblasten). Eenmaal gevormd, wordt het glazuur zelden gerepareerd of vernieuwd vanwege het apoptotische verlies van de ameloblasten bij het begin van tanduitbarsting1. Herstel van beschadigd glazuurweefsel, zoals veroorzaakt door trauma of bacteriële ziekte, wordt momenteel bereikt met behulp van synthetische materialen; deze hebben echter te kampen met belangrijke tekortkomingen zoals microlekage, inferieure osseo-integratie en verankering, eindige levensduur en gebrek aan volledig functionele reparatie2. Vandaar dat een robuuste en betrouwbare kweek van menselijke DESC's met de capaciteit om ameloblasten te genereren en het potentieel om gemineraliseerd weefsel te produceren een belangrijke stap voorwaarts zou zijn op het gebied van tandheelkundige regeneratieve aard.
Kennis over humaan DESC-fenotype en biologische functie is schaars 3,4,5. Interessant is dat DESC's van menselijke tanden zijn voorgesteld om te bestaan in de epitheelcelresten van Malassez (ERM), celclusters aanwezig in de tandheelkundige follikel (DF), die niet-gescheurde tanden omringt, en aanwezig blijft in het parodontale ligament rond de wortel zodra de tand uitbarst1. ERM-cellen die samen met tandpulp zijn gekweekt, blijken te differentiëren tot ameloblastachtige cellen en glazuurachtig weefsel te genereren6. Diepgaande studies naar de specifieke rol van ERM-cellen in glazuur (re-) generatie zijn echter beperkt vanwege het ontbreken van betrouwbare studiemodellen7. De huidige ERM in vitro kweeksystemen worden belemmerd door een beperkte levensduur en snel verlies van fenotype in de 2D-omstandigheden die standaard worden gebruikt 8,9,10,11,12. Daarom is een handelbaar in vitro systeem om menselijke DESC's getrouw uit te breiden, te bestuderen en te differentiëren sterk nodig.
In het afgelopen decennium is een krachtige techniek om epitheelstamcellen in vitro te laten groeien met succes toegepast op verschillende soorten (menselijke) epitheelweefsels om hun biologie en ziekte 13,14,15,16 te bestuderen. Deze technologie stelt de weefselepitheelstamcellen in staat om zichzelf te ontwikkelen tot 3D-celconstructies (d.w.z. organoïden) wanneer ze worden gezaaid in een extracellulaire matrix (ECM) -nabootsende steiger (meestal Matrigel) en gekweekt in een gedefinieerd medium dat de stamcelnichesignalering en / of embryogenese van het weefsel repliceert. Typische groeifactoren die nodig zijn voor organoïde ontwikkeling zijn epidermale groeifactor (EGF) en vleugelloze MMTV-integratieplaats (WNT) activators 14,15,16. De resulterende organoïden worden gekenmerkt door blijvende trouw bij het nabootsen van de oorspronkelijke epitheelstamcellen van het weefsel, evenals een hoge uitbreidbaarheid met behoud van hun fenotype en functionele eigenschappen, waardoor de vaak beperkte beschikbaarheid van primair menselijk weefsel zoals verkregen uit de kliniek wordt overwonnen. Om organoïden vast te stellen, is isolatie van de epitheelstamcellen uit het heterogene weefsel (d.w.z. bestaande uit andere celtypen zoals mesenchymale cellen) voorafgaand aan het kweken niet vereist, omdat mesenchymale cellen zich niet hechten aan of gedijen in de ECM, wat uiteindelijk resulteert in zuiver epitheliale organoïden 13,16,17,18,19 . Deze veelbelovende en veelzijdige technologie heeft geleid tot de ontwikkeling van vele organoïde modellen uit verschillende menselijke epitheelweefsels. Menselijke tand-afgeleide organoïden, waardevol voor diepgaande studie van tandontwikkeling, regeneratie en ziekte, waren echter nog niet vastgesteld20,21. We zijn er onlangs in geslaagd om zo'n nieuw organoïde model te ontwikkelen op basis van DF-weefsel uit derde kiezen (verstandskiezen) die zijn geëxtraheerd bij adolescente patiënten19.
Hier beschrijven we het protocol om epitheliale organoïde culturen te ontwikkelen uit de volwassen menselijke tand (d.w.z. uit de DF van derde kiezen) (figuur 1A). De resulterende organoïden drukken ERM-geassocieerde stengelheidsmarkers uit terwijl ze op lange termijn uitbreidbaar zijn. Intrigerend genoeg is, in tegenstelling tot de meeste andere organoïde modellen, het typisch benodigde EFG overbodig voor robuuste organoïde ontwikkeling en groei. Interessant is dat de stamheidsorganoïden ameloblastdifferentiatie-eigenschappen vertonen, waardoor ERM / DESC-kenmerken en -processen in vivo worden nagebootst. Het nieuwe en unieke organoïde model dat hier wordt beschreven, maakt het mogelijk om DESC-biologie, plasticiteit en differentiatiecapaciteit te verkennen en opent de deur voor het zetten van de eerste stappen in de richting van tandregeneratieve benaderingen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well flat bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Bovine (cell culture grade)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47330.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMELX antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-365284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15200018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (without vitamin A)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7202191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD44 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK14 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MA5-11599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>6310146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryobox</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>375353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1:1 F12 without Fe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>074-90715A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM powder high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52100039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663 - 10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding workstation, 220 to 240 Vac</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute, &#8805;99.8% (EtOH)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2 (= basic FGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>234-FSE-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF8</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RTN350-1KT</td>
			<td>Includes 1% &#946;-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Niko Mechanisms</td>
			<td>170-40050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101194M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>688001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITGA6 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA012696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15505739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium eagle (&#945;MEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P63 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab124762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap Pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>Marking pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA), 16%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (P20, P200, P1000)</td>
			<td>Eppendorf or others</td>
			<td>2231300006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette (3.5&#160;mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSPO1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (p38i)</td>
			<td>Biotechne (Tocris)</td>
			<td>1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel (surgical blade)</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHH</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>464-SH-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone molds (Heating block)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>102415K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-pyruvate (C3H3NaO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Real-Time PCR System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup-GP, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1000 &#956;L pipette tips with filter</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>740288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 20 &#956;L pipette tips with filter</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>774288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 200 &#956;L pipette tips with and without filter</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>739288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile H2O</td>
			<td>Fresenius</td>
			<td>B230531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III first-strand synthesis supermix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11752-050</td>
			<td>Reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12505356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Serva</td>
			<td>36760.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium+DAPI</td>
			<td>Labconsult NV</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Antifade mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT3a</td>
			<td>Biotechne (Tocris)</td>
			<td>5036-WN-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes, 99%, for biochemistry and histology</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2,89,75,325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing organoids from human tooth as a powerful tool toward mechanistic research and regenerative therapy

Tanden zijn van cruciaal belang in het leven, niet alleen voor voedselmasticatie en spraak, maar ook voor psychologisch welzijn. Kennis over de ontwikkeling en biologie van menselijke tanden is schaars. In het bijzonder is er niet veel bekend over de epitheelstamcellen van de tand en hun functie. We zijn erin geslaagd om een nieuw organoïde model te ontwikkelen dat vertrekt van menselijk tandweefsel (d.w.z. tandheelkundige follikel, geïsoleerd uit geëxtraheerde verstandskiezen). De organoïden zijn robuust en langdurig uitbreidbaar en recapituleren het voorgestelde menselijke tandepitheelstamcelcompartiment in termen van markerexpressie en functionele activiteit. In het bijzonder zijn de organoïden in staat om een ameloblastdifferentiatieproces te ontvouwen zoals dat in vivo optreedt tijdens amelogenese. Dit unieke organoïde model biedt een krachtig hulpmiddel om niet alleen de ontwikkeling van menselijke tanden te bestuderen, maar ook tandheelkundige pathologie, en kan de weg vrijmaken voor tandregeneratieve therapie. Het vervangen van verloren tanden door een biologische tand op basis van dit nieuwe organoïde model zou een aantrekkelijk alternatief kunnen zijn voor de huidige standaard implantatie van synthetische materialen.

Ontwikkeling van tandorganoïden We bieden een gedetailleerd protocol om organoïde culturen vast te stellen uit menselijk DF-weefsel dat is verkregen na extractie van verstandskiezen (figuur 1A). Geïsoleerde DF wordt enzymatisch en mechanisch gedissocieerd. De verkregen cellen worden gekweekt binnen BMM in media die empirisch zijn gedefinieerd voor optimale organoïde ontwikkeling en groei (tandorganoïde medium; TOM)19.
<p class="jove_conten...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy at JoVE.com

Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy

We presenteren een protocol om epitheliale organoïde culturen te ontwikkelen, uitgaande van menselijke tand. De organoïden zijn robuust uitbreidbaar en recapituleren de epitheelstamcellen van de tand, inclusief hun ameloblastdifferentiatiecapaciteit. Het unieke organoïde model biedt een veelbelovend hulpmiddel om de menselijke tandheelkundige (stamcel) biologie te bestuderen met perspectieven voor tandregeneratieve benaderingen.

Organoïden van menselijke tand vestigen als een krachtig hulpmiddel voor mechanistisch onderzoek en regeneratieve therapie

Teeth are of key importance in life not only for food mastication and speech but also for psychological well-being. Knowledge on human tooth development ...

Dit nieuwe van menselijke tanden afgeleide organoïde model biedt het eerste krachtige hulpmiddel om de menselijke tandheelkundige stamcelbiologie te ontcijferen met perspectieven op tandregeneratieve toepassingen. Op dit moment is dit tandorganoïde model het enige beschikbare hulpmiddel om op betrouwbare en robuuste wijze menselijke tandepitheelstamcellen te laten groeien en uit te breiden. Dit organoïde protocol kan worden toegepast om onderzoeksmodellen vast te stellen, niet alleen van gezonde, maar ook zieke tanden zoals tandheelkundige tumoren en bacteriële impact.Onderzoek van dergelijke ziektemodellen kan nieuwe therapeutische doelen aan het licht brengen. Dit organoïde model is zeer instrumenteel bij het ontcijferen van het glazuurvormingsproces in de menselijke tand en kan de constructie van tanddelen zoals glazuur voor generatieve doeleinden mogelijk maken. De procedure wordt gedemonstreerd door Lara Hemeryck, promovenda in mijn onderzoeksgroep.Verzamel om te beginnen de derde kiezen met bijbehorende tandheelkundige follikels in het verzamelmedium dat op ijs is geplaatst en breng de inhoud van de buizen over naar een petrischaal. Houd de tand vast met een pincet en isoleer de tandheelkundige follikels zorgvuldig met behulp van een chirurgisch mes. Was het resterende bloed van de tandfollikels door de tandfollikelweefsels gedurende 20 seconden kort in het eerste putje van 70% ethanol te plaatsen, breng het vervolgens gedurende 20 seconden over naar de volgende doodsethanolplaat en verder naar de derde ethanolput.Blijf het drie keer spoelen in fosfaat-gebufferde zoutputten, gevolgd door het spoelen van de tandheelkundige follikels in de drie resterende tandheelkundige follikels verzamelen medium putjes gedurende maximaal 20 minuten in totaal. Breng de gespoelde tandheelkundige follikels over in een nieuwe petrischaal. Snijd een klein stukje van een van de tandheelkundige follikels voor een paraformaldehydefixatie en bewaar het in een microcentrifugebuis met 500 microliter verzamelmedium gedurende maximaal zes uur.Gehakt de rest van de tandheelkundige follikels in kleine stukjes en breng ze over in een buis van 15 milliliter met vier milliliter voorgewarmd dissociatiemedium en incubeer de buis vervolgens bij 37 graden Celsius gedurende twee uur in het waterbad. Pipetteer elke 15 minuten het dissociatiemedium van de tandfollikels en meng op en neer met een glazen pipet om de weefseldesintegratie te versnellen. Wanneer stukjes tandheelkundige follikels niet langer worden waargenomen, gaat u verder met de dissociatie met behulp van een vernauwde, vuur gepolijste Pasteur-pipet.Bereid ondertussen 10 milliliter medium A met 100 microliter DNase en voeg vijf milliliter van dit medium toe aan elke buis met gedissocieerde tandheelkundige follikels. Incubeer gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Spoel het filter met één milliliter medium A.Combineer de verschillende buisjes gedissocieerde tandfollikels van één patiënt in deze stap en centrifugeer de gefilterde celsuspensie op 200 maal g gedurende 10 minuten bij 4 graden Celsius.Verwijder het supernatant. Resuspenseer de pellet in één milliliter serumvrij gedefinieerd medium en breng de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Bereken de celconcentratie met behulp van een geautomatiseerde celteller en bereken het aantal putten dat kan worden gezaaid.De uiteindelijke mix bestaat uit celsuspensie en keldermembraanmatrix in een verhouding van 30 tot 70. Verwijder de juiste hoeveelheid supernatant en resuspendeer het langzaam om een 70-tot-30-verhouding van ijskoude keldermembraanmatrix tot celsuspensie voor beplating te verkrijgen. Eenmaal geresuspendeerd in de keldermembraanmatrix, houdt u de microcentrifugebuis op ijs om keldermembraanmatrixstolling te voorkomen.Pipetteer de 20 microliter keldermembraanmatrixdruppels in het midden van de voorverwarmde 48-well kweekplaat. Draai de plaat ondersteboven en plaats deze om te stollen in een 1,9% kooldioxide-incubator bij 37 graden Celsius gedurende 20 minuten. Voeg rho-geassocieerde kinaseremmer en amfotericine B toe aan tandorganoïde medium en prewarm het medium in een waterbad van 37 graden Celsius.Neem de 48-well plaat uit de incubator. Plaats het rechtop en voeg 250 microliter van het voorbereide voorgewarmde medium toe aan elke put met een keldermembraanmatrixdruppel met de cellen en breng de plaat terug naar de kooldioxide-incubator. Als u het medium wilt verversen, kantelt u de plaat in een hoek van 45 graden.Verwijder voorzichtig het vorige medium, terwijl u vermijdt dat u de matrixdruppel van het keldermembraan aanraakt en voeg elke twee tot drie dagen 250 microliter nieuw voorgewarmd tandorganoïde medium toe. Om de passage van de organoïden uit te voeren, verwijdert u het medium uit de putten met organoïden en poolt u maximaal vier confluente putten. Om de organoïden te verzamelen, voegt u 400 microliter ijskoud serumvrij gedefinieerd medium per put rechtstreeks toe aan de membraanmatrixdruppel en pipetteert u het medium herhaaldelijk op en neer totdat de hele druppel is losgemaakt.Als putten worden samengevoegd, breng dan de 400 microliter over van de eerste put naar de volgende om de organoïde bevattende druppels los te maken. Breng de losgeraakte organoïde assemblage over in een microcentrifugebuis van 1,5 microliter en herhaal de toevoeging van serumvrij gedefinieerd medium totdat alle organoïde structuren uit de putten zijn verzameld. Centrifugeer het op 200 maal g gedurende vijf minuten bij 4 graden Celsius.Verwijder het supernatant uit de centrifugebuis en resuspenseer de pellet in een voorgewarmd aliquot trypLE Express. Voeg 400 microliter ijskoud serumvrij gedefinieerd medium toe om het enzym te inactiveren en centrifugeer het bij 200 keer g gedurende vijf minuten bij 4 graden Celsius. Verwijder het supernatant.Bedek een punt met een ijskoud serumvrij gedefinieerd medium en suspensie de organoïde pellet opnieuw in steriele toestand. Suspensie de pellet opnieuw in 200 microliter ijskoud serumvrij gedefinieerd medium voor de lage passagemethode. Duw de volledig geleegde pipetpunt tegen de onderkant van de microcentrifugebuis om de diameter te verkleinen.Pipetteer vijf minuten op en neer om de organoïden mechanisch te verstoren. Voor de hogere passagemethode resuspenseert u de pellet in 700 microliter ijskoud serumvrij gedefinieerd medium met een P1000-tip. Voeg een P200-tip toe aan deze P1000-tip en bekleed deze voor met ijskoud serumvrij gedefinieerd medium.Voorkom luchtbelvorming door de volume-instelling van de pipet aan te passen. Streef ernaar om ten minste 90% van het gemiddelde volume met organoïden en pipet gedurende vijf minuten op en neer te zetten om de organoïden mechanisch te verstoren. De organoïden ontwikkelen zich meestal twee weken na het zaaien van tandheelkundige follikelcellen.De organoïden zijn langdurig uitbreidbaar tot 11 passages. Het zaaien van ongeveer 20.000 cellen per keldermembraanmatrixdruppel levert een optimale dichtheid van organoïden op, terwijl het zaaien van hogere celaantallen leidt tot suboptimale organoïde-uitgroei met vergelijkbare organoïden met een te hoge dichtheid vanwege onvoldoende ruimte om te groeien. De ontwikkelde organoïden vertonen een dicht uiterlijk en bevatten cellen met een hoge nucleocytoplasmatische verhouding.Bovendien drukken de organoïden de ERM-marker cytokeratine 14 uit die hun epitheliale oorsprong en andere voorgestelde ERM-markers, zoals P63, CD44 en integrine alfa-6, bevestigen. Organoïden drukken SOX2 uit, een bekende DESC-marker bij muizen. Interessant is dat het hoofdbestanddeel van de glazuurmatrix, amelogenine, ook tot expressie komt in de organoïden.De organoïden behouden hun ERMM-stengelheidsfenotype tijdens het passeren, zoals blijkt uit de stabiele expressie van markers. Voor een optimale groei van organoïden op lange termijn is het essentieel om de aanbevolen passagemethoden te gebruiken, wat betekent dat de lage passage of de hogere passagemethoden. Eenmaal gevormd, kunnen de organoïden worden gebruikt om het amelogeneseproces verder te onderzoeken en de afzetting van de glazuurmatrix die momenteel niet wordt bereikt in tandheelkundig onderzoek.Deze techniek maakt de verkenning van tandheelkundige epitheliale stamcelbiologie, het proces van glazuurvorming en de interactie met het tandmenthenchym mogelijk, een samenspel dat essentieel is voor een correcte tandvorming.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

Adenovirale Gentherapie voor Diabetische keratopathie: Effecten op wondgenezing en Stem Cell Marker Expressie in Human Organ-gekweekte Corneas en Limbale epitheelcellen

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Verwerking van menselijke cardiale weefsels richting de extracellulaire Matrix zelf monteren Hydrogel voor In Vitro en In Vivo toepassingen

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van gestandaardiseerde en reproduceerbaar reukkolf-type cerebrale Organoids van mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Steiger-vrije, driedimensionale insuline uitdrukken Pancreatoids van muis alvleesklier voorlopercellen In Vitro generatie

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Generatie van geïnduceerde neurale stamcellen uit perifere mononucleaire cellen en differentiatie naar precursoren voor Dopaminerge neuron voor transplantatie studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films

Vorming van menselijke parodontitis ligament Cell Sferoïden op Chitosan films

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Beoordeling van oxidatieve schade in de primaire muis oculaire oppervlaktecellen / stamcellen in reactie op Ultraviolet-C (UV-C) Schade

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Een statische zelfsturende methode voor het genereren van hersenorganoïden uit menselijke embryonale stamcellen

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Voorbereiding van kleine RNA-bibliotheken voor sequencing van vroege muisembryo's

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...