Name: establishing organoids from human tooth as a powerful tool toward mechanistic research and regenerative therapy
Uploaded: 2022-04-13T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy at JoVE.com

UZ Leuven'in Ağız Diş ve Çene Cerrahisi (MKA) personeline ve hastalara, taze çıkarılmış üçüncü azı dişlerinin toplanmasındaki paha biçilmez yardımları için minnettarız. Ayrıca örnek toplama konusundaki yardımları için Dr. Reinhilde Jacobs ve Dr. Elisabeth Tijskens'e teşekkür ederiz. Bu çalışma KU Leuven (BOF) ve FWO-Flanders (G061819N) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir. L.H. FWO Ph.D. Fellow'dur (1S84718N).

Burada açıklanan tüm yöntemler Etik Kurul Araştırma UZ/KU Leuven (13/0104U) tarafından onaylanmıştır. Çekilen üçüncü azı dişleri (yirmilik dişler) hastaların bilgilendirilmiş onamından sonra elde edildi.
1. Hazırlıklar
<ol><li>48 delikli bir kültür plakasını, 37 ° C'de% 1.9'luk bir CO2 inkübatöründe 15-20 saat boyunca önceden ısıtın.</li>
	<li>Bir Matrigel aliquot'u sıvılaştırın (büyüme faktörü azaltılmış; fenol kırm...

<ol>
	<li>Yu, T., Klein, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+tooth+development,+homeostasis+and+repair.">Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair.</a> Development (Cambridge). 147 (2), (2020).</li><li>Arrow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+enamel+defects,+caries+experience+and+oral+health-related+quality+of+life:+a+cohort+study.">Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study.</a> Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).</li><li>Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L., Zavan, B., Bressan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+Stem+Cells+for+Tooth+Regeneration.">Dental Stem Cells for Tooth Regeneration.</a> Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. , (2016).</li><li>Mitsiadis, T. A., Orsini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+a+new+era+in+dentistry:+stem+cell-based+approaches+for+tooth+and+periodontal+tissue+regeneration.">Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration.</a> Frontiers in Physiology. 7, 357 (2016).</li><li>Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+dental+stem+cell-based+research+approaches:+the+future+of+dentistry.">Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry.</a> Stem Cells International. 2016, 7231038 (2016).</li><li>Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+epithelial+cell+rests+of+malassez+can+differentiate+into+ameloblast-like+cells.">Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).</li><li>Davis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+epithelial+cell+rests+of+Malassez+on+the+bicentennial+of+their+description.">A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description.</a> Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).</li><li>Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+adult+epithelial+stem+cells+from+the+periodontal+ligament.">Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament.</a> Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).</li><li>Kim, G. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+establishment+of+dental+epithelial-like+stem+cells+derived+from+human+ESCs+and+iPSCs.">Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).</li><li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Hertwig's+epithelial+root+sheath/+epithelial+rests+of+malassez+cell+line+from+human+periodontium.">Establishment of Hertwig's epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium.</a> Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).</li><li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+of+the+stem+cell+markers+in+human+hertwig's+epithelial+root+sheath/Epithelial+rests+of+Malassez+cells.">Expression profile of the stem cell markers in human hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells.</a> Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).</li><li>Tsunematsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+odontogenic+epithelial+cells+derived+from+epithelial+rests+of+Malassez+possess+stem+cell+properties.">Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).</li><li>Artegiani, B., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+and+application+of+3D-organoid+technology.">Use and application of 3D-organoid technology.</a> Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).</li><li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+from+endometrial+disease+capture+clinical+heterogeneity+and+are+amenable+to+drug+screening.">Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).</li><li>Cox, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+pituitary+as+a+novel+research+model+toward+pituitary+stem+cell+exploration.">Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration.</a> Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability.">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).</li><li>Schutgens, F., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+tools+for+understanding+biology+and+treating+diseases).">Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases).</a> Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).</li><li>Hemeryck, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+human+tooth+showing+epithelial+stemness+phenotype+and+differentiation+potential.">Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153 (2022).</li><li>Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+organoids:+progress+and+challenges.">Oral organoids: progress and challenges.</a> Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).</li><li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation.">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 4963 (2020).</li><li>Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+rests+of+malassez+contain+unique+stem+cell+populations+capable+of+undergoing+epithelial-mesenchymal+transition.">Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition.</a> Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).</li><li>Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+development+of+Hertwig's+epithelial+root+sheath.">Evolution and development of Hertwig's epithelial root sheath.</a> Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).</li><li>Fukumoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+functions+of+enamel+matrices+in+calcified+tissues.">New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues.</a> Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).</li><li>Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERM+functions,+EGF+and+orthodontic+movement+or+Why+doesn't+orthodontic+movement+cause+alveolodental+ankylosis.">ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn't orthodontic movement cause alveolodental ankylosis.</a> Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).</li><li>Guajardo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+epidermal+growth+factor+in+cat+paradental+tissues+during+tooth+movement.">Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement.</a> American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Gon&#231;alves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+quantitative+reduction+of+rests+of+Malassez+according+to+age.">Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age.</a> Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).</li><li>Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+Model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: Model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADULT+(acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth)+syndrome:+a+case+report+from+India.">ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India.</a> Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194 (2018).</li><li>. Future Health Biobank Available from: <a target="_blank" href="https://futurehealthbiobank.com/ch-en/">https://futurehealthbiobank.com/ch-en/</a> (2022)</li><li>Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+co-culture+of+human+intestinal+organoids+and+lamina+propria-derived+CD4++T+cells.">In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100519 (2021).</li><li>Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+cell+communication+in+cancer+with+organoids:+Making+the+complex+simple.">Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166 (2020).</li><li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture.">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyisocyanide+hydrogels+as+a+tunable+platform+for+mammary+gland+organoid+formation.">Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation.</a> Advanced Science. 7 (18), 2001797 (2020).</li><li>Mollaki, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+challenges+in+organoid+use.">Ethical challenges in organoid use.</a> BioTech. 10 (3), 12 (2021).</li></ol>

Bu protokol, insan dişinden başlayarak organoidlerin verimli ve tekrarlanabilir oluşumunu tanımlar. Bildiğimiz kadarıyla bu, insan diş dokusundan başlayarak akım kavramı (epitelyal) organoidlerin kurulması için ilk metodolojidir. Organoidler uzun süreli genişletilebilir ve daha önce DF7'nin ERM bölmesinde bildirilen DESC'leri çoğaltan bir diş epitelyal sap fenotipi gösterir. Ayrıca, organoidler, bir ameloblast farklılaşma sürecinin ortaya çıkması da dahil olmak üzere fo...

Dişlerin gıda çiğneme, konuşma ve psikolojik iyi oluşta (benlik imajı) önemli rolleri vardır. İnsan dişi, değişen yoğunluk ve sertlikte yüksek mineralize dokulardan oluşur1. Diş kronunun ana bileşeni olan diş minesi, insan vücudundaki en yüksek mineralize dokudur. Emaye oluşumu sırasında (amelogenez), dişler geliştiğinde, diş epitel kök hücreleri (DESC'ler) emaye oluşturan hücrelere (ameloblastlar) farklılaşır. Bir kez oluştuktan sonra, diş erüpsiyonunun başlangıcında ameloblastların apoptotik kaybı nedeniyle emaye nadiren onarılır veya yenilenir1. Travma veya bakteriyel hastalığın neden olduğu hasarlı emaye dokusunun restorasyonu şu anda sentetik malzemeler kullanılarak gerçekleştirilmektedir; ancak bunlar mikrokaçak, inferior osseointegrasyon ve ankraj, sonlu ömür ve tam fonksiyonel onarım eksikliği gibi önemli eksikliklerle uğraşmaktadır2. Bu nedenle, ameloblast üretme kapasitesine ve mineralize doku üretme potansiyeline sahip sağlam ve güvenilir bir insan DESC kültürü, dental rejeneratif alanda ileriye doğru atılmış önemli bir adım olacaktır.
İnsan DESC fenotipi ve biyolojik fonksiyonu hakkında bilgi azdır 3,4,5. İlginçtir ki, insan dişlerinin DESC'lerinin, Malassez'in Epitel Hücre Dayanaklarında (ERM), diş folikülünde (DF) bulunan ve diş patladığında kök çevresindeki periodontal ligamentte mevcut olan hücre kümelerinde var olduğu öne sürülmüştür1. Diş pulpası ile birlikte kültürlenmiş ERM hücrelerinin ameloblast benzeri hücrelere farklılaştığı ve mine benzeri doku ürettiği bulunmuştur6. Bununla birlikte, ERM hücrelerinin emaye (yeniden) üretimindeki spesifik rolüne ilişkin derin çalışmalar, güvenilir çalışma modellerinin eksikliği nedeniyle sınırlandırılmıştır7. Mevcut ERM in vitro kültür sistemleri, standart olarak kullanılan 8,9,10,11,12 2D koşullarında sınırlı kullanım ömrü ve hızlı fenotip kaybı nedeniyle engellenmektedir. Bu nedenle, insan DESC'lerini sadık bir şekilde genişletmek, incelemek ve ayırt etmek için izlenebilir bir in vitro sisteme şiddetle ihtiyaç vardır.
Son on yılda, in vitro epitel kök hücrelerini büyütmek için güçlü bir teknik, biyolojilerini ve hastalık13,14,15,16'yı incelemek için çeşitli (insan) epitel dokularına başarıyla uygulanmıştır. Bu teknoloji, doku epitel kök hücrelerinin, hücre dışı bir matrise (ECM) tohumlandığında, hücre dışı bir matrise (ECM) tohumlandığında (tipik olarak, Matrigel) ve dokunun kök hücre niş sinyalini ve / veya embriyogenezini kopyalayan tanımlanmış bir ortamda kültürlendiğinde 3D hücre yapılarına (yani organoidlere) kendi kendine gelişmesini sağlar. Organoid gelişim için gerekli tipik büyüme faktörleri epidermal büyüme faktörü (EGF) ve kanatsız tip MMTV entegrasyon bölgesi (WNT) aktivatörleri 14,15,16'dır. Ortaya çıkan organoidler, dokunun orijinal epitel kök hücrelerini taklit etmede kalıcı sadakatin yanı sıra, fenotip ve fonksiyonel özelliklerini korurken yüksek genişletilebilirlik ile karakterize edilir, böylece klinikten elde edilen sıklıkla sınırlı birincil insan dokusu mevcudiyetinin üstesinden gelir. Organoidleri oluşturmak için, epitel kök hücrelerinin kültürlemeden önce heterojen dokudan (yani, mezenkimal hücreler gibi diğer hücre tiplerini içeren) izolasyonu gerekli değildir, çünkü mezenkimal hücreler ECM'ye bağlanmaz veya gelişmez, sonuçta tamamen epitel organoidleriile sonuçlanır 13,16,17,18,19 . Bu umut verici ve çok yönlü teknoloji, çeşitli insan epitel dokularından manifold organoid modellerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Bununla birlikte, diş gelişimi, rejenerasyonu ve hastalığının derinlemesine incelenmesi için değerli olan insan dişi kaynaklı organoidler henüz kurulmamıştır20,21. Son zamanlarda, ergen hastalardan çıkarılan üçüncü azı dişlerinden (bilgelik dişleri) DF dokusundan başlayarak böyle yeni bir organoid model geliştirmeyi başardık19.
Burada, yetişkin insan dişinden (yani, üçüncü azı dişlerinin DF'sinden) epitel organoid kültürleri geliştirme protokolünü açıklıyoruz (Şekil 1A). Ortaya çıkan organoidler, ERM ile ilişkili sap belirteçlerini eksprese ederken, uzun süreli genişletilebilir. İlginçtir ki, diğer organoid modellerin çoğunun aksine, tipik olarak ihtiyaç duyulan EGF, sağlam organoid gelişimi ve büyümesi için gereksizdir. İlginç bir şekilde, saplılık organoidleri ameloblast farklılaşma özellikleri gösterir, böylece ERM / DESC özelliklerini ve in vivo olarak meydana gelen süreçleri taklit eder. Burada açıklanan yeni ve benzersiz organoid model, DESC biyolojisini, plastisitesini ve farklılaşma kapasitesini keşfetmeye izin verir ve diş rejeneratif yaklaşımlara doğru ilk adımları atmak için kapıyı açar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well flat bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Bovine (cell culture grade)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47330.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMELX antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-365284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15200018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (without vitamin A)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7202191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD44 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK14 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MA5-11599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>6310146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryobox</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>375353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1:1 F12 without Fe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>074-90715A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM powder high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52100039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663 - 10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding workstation, 220 to 240 Vac</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute, &#8805;99.8% (EtOH)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2 (= basic FGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>234-FSE-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF8</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RTN350-1KT</td>
			<td>Includes 1% &#946;-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Niko Mechanisms</td>
			<td>170-40050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101194M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>688001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITGA6 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA012696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15505739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium eagle (&#945;MEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P63 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab124762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap Pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>Marking pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA), 16%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (P20, P200, P1000)</td>
			<td>Eppendorf or others</td>
			<td>2231300006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette (3.5&#160;mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSPO1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (p38i)</td>
			<td>Biotechne (Tocris)</td>
			<td>1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel (surgical blade)</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHH</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>464-SH-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone molds (Heating block)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>102415K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-pyruvate (C3H3NaO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Real-Time PCR System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup-GP, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1000 &#956;L pipette tips with filter</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>740288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 20 &#956;L pipette tips with filter</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>774288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 200 &#956;L pipette tips with and without filter</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>739288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile H2O</td>
			<td>Fresenius</td>
			<td>B230531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III first-strand synthesis supermix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11752-050</td>
			<td>Reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12505356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Serva</td>
			<td>36760.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium+DAPI</td>
			<td>Labconsult NV</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Antifade mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT3a</td>
			<td>Biotechne (Tocris)</td>
			<td>5036-WN-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes, 99%, for biochemistry and histology</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2,89,75,325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing organoids from human tooth as a powerful tool toward mechanistic research and regenerative therapy

Dişler hayatta sadece gıda çiğnemesi ve konuşma için değil, aynı zamanda psikolojik iyi oluş için de kilit öneme sahiptir. İnsan diş gelişimi ve biyolojisi hakkında bilgi azdır. Özellikle, dişin epitel kök hücreleri ve işlevleri hakkında fazla bir şey bilinmemektedir. İnsan diş dokusundan (yani, çıkarılan bilgelik dişlerinden izole edilmiş diş folikülü) başlayan yeni bir organoid model geliştirmeyi başardık. Organoidler sağlam ve uzun süreli genişletilebilir olup, önerilen insan dişi epitel kök hücre bölmesini belirteç ekspresyonu ve fonksiyonel aktivite açısından özetler. Özellikle, organoidler, amelogenez sırasında in vivo olarak meydana gelen bir ameloblast farklılaşma sürecini ortaya çıkarabilir. Bu eşsiz organoid model, sadece insan diş gelişimini değil, aynı zamanda diş patolojisini de incelemek için güçlü bir araç sağlayacak ve diş rejeneratif tedavisine giden yolu açabilir. Kayıp dişlerin bu yeni organoid modele dayanan biyolojik bir dişle değiştirilmesi, sentetik malzemelerin mevcut standart implantasyonuna çekici bir alternatif olabilir.

Diş organoid gelişimi Bilgelik diş çekimini takiben edinilen insan DF dokusundan organoid kültürler oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz (Şekil 1A). İzole DF enzimatik ve mekanik olarak ayrışır. Elde edilen hücreler, optimal organoid gelişim ve büyüme için ampirik olarak tanımlanmış ortamlarda BMM içinde kültürlenir (diş organoid ortamı; TOM)19.
Organoidler tipik olarak DF hücre ...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy at JoVE.com

Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy

İnsan dişinden başlayarak epitelyal organoid kültürlerin geliştirilmesi için bir protokol sunuyoruz. Organoidler sağlam bir şekilde genişletilebilir ve ameloblast farklılaşma kapasiteleri de dahil olmak üzere dişin epitel kök hücrelerini özetler. Eşsiz organoid model, insan diş (kök hücre) biyolojisini diş rejeneratif yaklaşımlar için perspektiflerle incelemek için umut verici bir araç sağlar.

İnsan Dişinden Organoidlerin Mekanik Araştırma ve Rejeneratif Terapiye Doğru Güçlü Bir Araç Olarak Kurulması

Teeth are of key importance in life not only for food mastication and speech but also for psychological well-being. Knowledge on human tooth development ...

Bu yeni insan dişi kaynaklı organoid model, insan diş kök hücre biyolojisini diş rejeneratif uygulamalarına yönelik perspektiflerle deşifre etmek için ilk güçlü aracı sağlar. Şu anda, bu diş organoid modeli, insan dişi epitel kök hücrelerini güvenilir ve sağlam bir şekilde büyütmek ve genişletmek için mevcut tek araçtır. Bu organoid protokol, sadece sağlıklı değil, aynı zamanda diş tümörleri ve bakteriyel etki gibi hastalıklı dişlerden de araştırma modelleri oluşturmak için uygulanabilir.Bu tür hastalık modellerinin araştırılması yeni terapötik hedefleri ortaya çıkarabilir. Bu organoid model, insan dişindeki emaye oluşum sürecini deşifre etmede oldukça etkilidir ve üretici amaçlar için emaye gibi diş parçalarının yapımını sağlayabilir. Prosedürü gösteren, araştırma grubumdaki doktora öğrencisi Lara Hemeryck olacak.Başlamak için, buz üzerine yerleştirilen toplama ortamında ilişkili diş folikülleri olan üçüncü azı dişlerini toplayın ve tüplerin içeriğini bir Petri kabına aktarın. Dişi cımbızla tutun ve cerrahi bir bıçak kullanarak diş foliküllerini dikkatlice izole edin. Kalan kanı diş foliküllerinden 20 saniye boyunca %70 etanolün ilk kuyucuğuna kısaca yerleştirerek yıkayın, ardından 20 saniye boyunca bir sonraki ölüm etanol plağına ve üçüncü etanol kuyucusuna aktarın.Fosfat tamponlu salin kuyucuklarında üç kez durulamaya devam edin, ardından kalan üç diş folikülü toplama ortamı kuyucuklarındaki diş foliküllerini toplamda en fazla 20 dakika boyunca durulayın. Durulanmış diş foliküllerini yeni bir Petri kabına aktarın. Paraformaldehit fiksasyonu için diş foliküllerinden birinin küçük bir parçasını kesin ve en fazla altı saat boyunca 500 mikrolitre toplama ortamı içeren bir mikrosantrifüj tüpünde saklayın.Diş köklerinin geri kalanını küçük parçalara ayırın ve dört mililitre önceden ısıtılmış ayrışma ortamı içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın, ardından tüpü su banyosunda iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Her 15 dakikada bir, diş folikülleri ayrışma ortamını pipetleyin ve doku parçalanmasını hızlandırmak için bir cam pipet kullanarak yukarı ve aşağı karıştırın. Diş folikülü parçaları artık gözlenmediğinde, daralmış, ateşle parlatılmış bir Pasteur pipet kullanarak ayrışmaya devam edin.Bu arada, 100 mikrolitre DNaz içeren 10 mililitre orta A hazırlayın ve ayrışmış diş köklerine sahip her tüpe bu ortamın beş mililitresini ekleyin. Oda sıcaklığında bir dakika kuluçkaya yatırın. Filtreyi bir mililitre orta A. Bu adımda bir hastadan ayrışmış diş köklerinin birkaç tüpünü birleştirin ve filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj edin.Süper natantı çıkarın. Peleti bir mililitre serumsuz tanımlanmış ortamda yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu hesaplayın ve tohumlanabilecek kuyu sayısını hesaplayın.Son karışım, 30 ila 70 oranında hücre süspansiyonu ve bazal membran matrisinden oluşur. Uygun miktarda süpernatantı çıkarın ve 70 ila 30 oranında buz gibi soğuk bazal membran matrisinin kaplama için hücre süspansiyonuna oranını elde etmek için yavaşça yeniden askıya alın. Bodrum membran matrisinde yeniden askıya alındıktan sonra, bazal membran matrisinin katılaşmasını önlemek için mikrosantrifüj tüpünü buz üzerinde tutun.Pipet, 20 mikrolitrelik bazal membran matris damlacıklarının ortasındaki önceden ısıtılmış 48 delikli kültür plakasıdır. Plakayı baş aşağı çevirin ve 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede% 1.9'luk bir karbondioksit inkübatöründe katılaşacak şekilde yerleştirin. Diş organoid ortamına ro-ilişkili kinaz inhibitörü ve amfoterisin B ekleyin ve ortamı 37 santigrat derecelik bir su banyosunda önceden ısıtın.48 kuyucuklu plakayı inkübatörden alın. Dik yerleştirin ve hazırlanan önceden ısıtılmış ortamın 250 mikrolitresini, hücreleri içeren bir bazal membran matris damlacığı ile her bir kuyucuğa ekleyin ve plakayı karbondioksit inkübatörüne geri gönderin. Ortamı yenilemek için plakayı 45 derecelik bir açıyla eğin.Bodrum zarı matris damlacığına dokunmaktan kaçınırken önceki ortamı nazikçe çıkarın ve her iki ila üç günde bir 250 mikrolitre yeni önceden ısıtılmış diş organoid ortamı ekleyin. Organoidlerin geçişini gerçekleştirmek için, ortamı organoidlerle kuyucuklardan çıkarın ve dört adede kadar akıcılık kuyusuna kadar havuzlayın. Organoidleri toplamak için, kuyu başına 400 mikrolitre buz gibi soğuk serumsuz tanımlanmış ortamı doğrudan membran matris damlacığı üzerine ekleyin ve tüm damlacık yerinden çıkana kadar ortamı tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleyin.Kuyular havuzlanırsa, damlacıkları içeren organoidi yerinden çıkarmak için 400 mikrolitreyi ilk kuyucuktan diğerine aktarın. Yerinden çıkmış organoid tertibatı 1.5 mikrolitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüm organoid yapılar kuyucuklardan toplanana kadar serumsuz tanımlanmış ortamın eklenmesini tekrarlayın. 4 santigrat derecede beş dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj yapın.Süpernatantı santrifüj tüpünden çıkarın ve peleti önceden ısıtılmış bir TrypLE Express aliquot'unda yeniden askıya alın. Enzimi inaktive etmek için 400 mikrolitre buz gibi soğuk serum içermeyen tanımlanmış ortam ekleyin ve 4 santigrat derecede beş dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj edin. Süper natantı çıkarın.Bir ucu buz gibi soğuk serumsuz tanımlanmış bir ortamla önceden kaplayın ve organoid peleti steril durumda tekrar askıya alın. Düşük geçişli yöntem için peleti 200 mikrolitre buz gibi soğuk serum serbest tanımlı ortamda tekrar askıya alın. Tamamen boşaltılmış pipet ucunu, çapını azaltmak için mikro santrifüj tüpünün tabanına doğru itin.Organoidleri mekanik olarak bozmak için beş dakika boyunca yukarı ve aşağı pipet uygulayın. Daha yüksek geçiş yöntemi için, peleti P1000 uçlu 700 mikrolitre buz gibi soğuk serum içermeyen tanımlı ortamda yeniden askıya alın. Bu P1000 ucuna bir P200 uç ekleyin ve buz gibi soğuk serum içermeyen tanımlı ortamla ön kat yapın.Pipetin ses seviyesi ayarını yaparak hava kabarcığı oluşumunu önleyin. Organoidleri mekanik olarak bozmak için orta hacmin en az %90'ını organoidler ve pipetlerle beş dakika boyunca yukarı ve aşağı doğru hedefleyin. Organoidler tipik olarak diş folikül hücresi tohumlamasından iki hafta sonra gelişir.Organoidler uzun süreli 11 pasaja kadar genişletilebilir. Bodrum membran matris damlacığı başına yaklaşık 20.000 hücrenin tohumlanması, optimal bir organoid yoğunluğu sağlarken, daha yüksek hücre sayılarının tohumlanması, büyümek için yetersiz alan nedeniyle çok yüksek yoğunlukta benzer organoidlerle optimal olmayan organoid büyümesine yol açar. Geliştirilen organoidler yoğun bir görünüm sergiler ve yüksek nükleositoplazmik oran gösteren hücreler içerir.Ayrıca, organoidler epitel kökenlerini ve P63, CD44 ve integrin alfa-6 gibi diğer önerilen ERM belirteçlerini doğrulayan ERM belirteci sitokeratin 14'ü eksprese eder. Organoidler, farelerde iyi bilinen bir DESC belirteci olan SOX2'yi eksprese eder. İlginç bir şekilde, emaye matrisinin ana bileşeni olan amelogenin, organoidlerde de ifade edilir.Organoidler, belirteçlerin kararlı ekspresyonu ile gösterildiği gibi, pasaj sırasında ERMM sap fenotiplerini korurlar. Optimal uzun süreli organoid büyümesi için, önerilen geçiş yöntemlerinin anlamı veya düşük pasaj veya yüksek pasaj yöntemlerinin kullanılması esastır. Bir kez oluşturulduktan sonra, organoidler amelogenez sürecini daha fazla incelemek ve diş hekimliği araştırmalarında şu anda elde edilemeyen emaye matriks birikimini incelemek için kullanılabilir.Bu teknik, dental epitel kök hücre biyolojisinin, mine oluşum sürecinin ve doğru diş oluşumu için gerekli bir etkileşim olan diş mezenkimi ile etkileşimin araştırılmasını sağlar.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

Diyabetik Keratopatide için adenoviral Gen Tedavisi: İnsan Organ-kültürlü kornealar ve Limbal Epitel Hücreleri Yara İyileşmesi Üzerine Etkileri ve Hücre Marker İfade Kök

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

İnsan kalp dokusu hücre dışı matriks hidrojel Vitro ve In Vivo uygulamaları için kendi kendine montaj doğru işlenmesi

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Periferik mononükleer hücrelerden Indüklenen nöral kök hücrelerin üretimi ve transplantasyon çalışmaları için Dopaminergic neuron precursors doğru farklılaşma

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films

Kitosan filmlerde ınsan periodontal ligament hücre kürleri oluşumu

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Ultraviyole-C (UV-C) Hasarına Yanıt Olarak Birincil Fare Oküler Yüzey Hücrelerinde/Kök Hücrelerinde Oksidatif Hasarın Değerlendirilmesi

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Beyin Organoidleri Üretmek için Statik Kendi Kendini Yöneten Bir Yöntem

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Erken Fare Embriyolarından Sıralama için Küçük RNA Kütüphanelerinin Hazırlanması

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...