Name: probing myosin ensemble mechanics in actin filament bundles using optical tweezers
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers at JoVE.com

这项工作得到了密西西比大学研究生会研究奖学金（OA），密西西比大学Sally McDonnell-Barksdale荣誉学院（JCW，JER），密西西比州太空资助联盟（资助号NNX15AH78H）（JCW，DNR）和美国心脏协会（资助号848586（DNR）的部分支持。

1. 蚀刻盖玻片
<ol><li>将 100 g KOH 溶解在 1，000 mL 烧杯中的 300 mL 100% 乙醇中。用搅拌棒搅拌，直到大部分 KOH 溶解。 注意：浓缩的KOH溶液会导致灼伤和衣服损坏。戴上手套、护目镜和实验室外套。</li>
	<li>将盖玻片单独放入盖玻片清洁架中。 注意：机架设计有狭缝，可将单个盖玻片隔开，以便在盖玻片的每个面、底部的排水孔上进行蚀刻和冲洗，并由可以承受恶劣蚀刻条件的材料...

使用光镊结合荧光成像进行体 外 研究，以研究肌球蛋白集合与肌动蛋白丝相互作用的动力学。肌动蛋白-肌球蛋白-肌动蛋白束使用肌球蛋白II，罗丹明肌动蛋白在束底部和盖玻片表面组装，488标记的生物素化肌动蛋白丝在束的顶部组装。来自兔肌肉的肌动蛋白使用通用肌动蛋白缓冲液（GAB）和肌动蛋白聚合缓冲液（APB）聚合和稳定。GAB 和 APB 必须每天在实验室中使用 ATP、FC 缓冲液和 TC 缓?...

运动蛋白对生命至关重要，将化学能转化为机械功1，2，3。肌球蛋白马达通过沿着类似于轨道的细丝采取步骤与肌动蛋白丝相互作用，肌动蛋白-肌球蛋白网络的动力学执行肌肉收缩、细胞运动、细胞分裂过程中的收缩环以及细胞内货物的运动，以及其他基本任务3，4，5，6，7，8.由于肌球蛋白具有如此多的重要作用，肌球蛋白-肌动蛋白网络功能衰竭可导致疾病发展，例如肌球蛋白重链突变导致肥厚型心肌病（HCM）的心脏过度收缩9，10，11，12，13，14.在肌肉收缩中，单个肌球蛋白马达通过作为一个整体相互合作，以提供所需的机械能，执行AFs4，15，16，17，18的相对滑动。肌球蛋白马达在AF之间形成交叉桥，并利用由于其机械化学循环引起的构象变化共同向对齐的细丝17，18，19，20，21的倒刺端移动。
使用光学捕获等技术在SM水平上开发定量体外运动测定有助于收集有关单个肌球蛋白马达如何工作的前所未有的细节，包括测量SM力的产生和步长 22，23，24，25，26，27，28，29，30.Finer等人开发了“三珠”或“哑铃”光学捕获测定法，以探测单个肌球蛋白II电机的力产生机制23，31。由于肌肉肌球蛋白II在团队中工作以收缩AF，但在SM水平上是非过程性的，因此必须从经典的电机结合珠方法32重新排列光学捕获测定方向。为了形成哑铃测定，使用两个光学陷阱将AF固定在与盖玻片连接的珠子上的肌球蛋白马达上，并通过陷阱23内的AF运动测量单个电机输出的力。
然而，SM力和使用单电机/单丝测定方向并不能给出系统级力产生的完整图像，因为许多运动蛋白（包括肌球蛋白II）不能单独工作，并且通常不能作为其各部分的总和起作用15，16，17，32，33，34，35，36.更复杂的结构，包括一个以上的电机与不止一根细丝相互作用，对于更好地了解肌球蛋白和肌动蛋白丝网络的协同作用是必要的15，32。哑铃测定方向已被利用来研究小集合力的产生，方法是将多个肌球蛋白附着在珠子上或使用肌球蛋白厚的细丝连接到表面并允许电机与悬浮的AF4，23，34，37，38，39，40相互作用。
其他小型集合测定包括体外细丝滑动测定，其中肌球蛋白马达被涂覆在盖玻片表面上，并且使用与AF结合的珠子来探测电机组产生的力4，35，36，38，39，40，41，42，43.在这两种情况下，肌球蛋白都与刚性表面（珠子或盖玻片）结合并利用一个AF。在这些情况下，电机不能自由移动或相互通信，肌球蛋白刚性结合也不能反映电机在肌节中一起工作的顺从的分层环境32。先前的研究表明，肌球蛋白II可以通过改变力产生和占空比41，44，45等特性来感知其环境并相应地适应不断变化的粘弹性或运动浓度条件。因此，需要开发一种光学捕获测定法，以促进和捕获运动通信和系统顺应性，以更真实地描绘肌球蛋白II集合力生成的机制基础。
在这里，我们开发了一种通过形成由两个肌动蛋白丝之间相互作用的多个肌球蛋白马达组成的肌球蛋白束或三明治来将体外分层结构与光学捕获偶联的方法。这种模块化检测几何形状能够直接探测分子和环境因素如何影响集合肌球蛋白力的产生。此外，通过这些肌动蛋白 - 肌球蛋白集合研究力产生机制有可能帮助建模和理解大规模细胞任务（如肌肉收缩）如何从分子水平9，10，13向上传播。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actin protein (biotin): skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AB07-A</td>
			<td>Biotinylated actin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein, rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99-A</td>
			<td>Actin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Actin stabilizer and Alexa Fluor 488 stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP413-25</td>
			<td>Required for actin assembly and myosin motility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-D-glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>MP218069110</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting Grade Blocker (casein)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Used to block surface from non-specific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>C79500</td>
			<td>Calcium chloride, provides the necessary control over the dynamics of actin myosin network</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>ICN10040280</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12544C</td>
			<td>Used to make flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AC327190010</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td>Regent used for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>34-538-610KU</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>Used to etch coverslips and adjust buffer pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td>Used to make flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin II protein: rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MY02</td>
			<td>Full length myosin motor protein isolated from rabbit skeletal muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotracker2</td>
			<td>Bruker/JPK</td>
			<td>NT2</td>
			<td>Optical trapping instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Facilities adhesion of actin filaments onto glass surface of the coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>PHDR1</td>
			<td>Actin stabilizer and rhodamine fluorescent stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads, 1 &#956;m</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-10-5</td>
			<td>Optical trapping handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>PR H5121</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing myosin ensemble mechanics in actin filament bundles using optical tweezers

肌球蛋白是水解ATP以沿着肌动蛋白丝（AF）轨道行走的运动蛋白，在运动和肌肉收缩等细胞过程中至关重要。为了了解它们的力产生机制，肌球蛋白II已经在单分子（SM）水平和使用生物物理方法（如光学捕获）在 体外作为 电机团队进行了研究。
这些研究表明，当从三珠排列中的单分子水平移动到滑动排列中的刚性珠或盖玻片表面上一起工作的电机组时，肌球蛋白力的产生行为可能会有很大差异。然而，这些测定结构不允许像在细胞内那样评估粘弹性结构层次结构中肌球蛋白的组动力学。我们开发了一种使用光学镊子的方法，以研究肌球蛋白系综与多个肌动蛋白丝相互作用的力产生机制。
这些肌动肌肽束有助于在分层和顺应的环境中进行研究，从而捕获运动通信和集合力输出。该测定的可定制性质允许改变实验条件，以了解对肌球蛋白集合、肌动蛋白丝束或周围环境的修饰如何导致不同的力输出。

含有肌动球蛋白束系统的流通池采用标准设计，由显微镜载玻片和蚀刻盖玻片组成，由双面胶带制成的通道隔开（图1）。然后使用协议中所述的分阶段引入从盖玻片开始构建测定。最终测定由模板罗丹明标记的肌动蛋白丝组成;所需的肌球蛋白浓度（图 2 和 图3中的代表性结果使用1μM）;生物素化，Alexa Fluor 488标记的肌动蛋白丝;1μ...

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Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

介绍并讨论了 体外 肌动球蛋白束的形成和使用光学镊子测量肌球蛋白集合力的产生。

使用光学镊子探测肌动蛋白丝束中的肌球蛋白系综力学

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle ...

使用该协议研究肌动蛋白行为非常重要，因为它允许用户使用光学捕获的精度来探测运动蛋白集合动力学。该技术的主要优点是能够在肌动蛋白结构层次结构中测量肌球蛋白力学，而不是许多光学捕获实验中使用的传统单电机单丝取向。该协议的另一个优点是其模块化性质，允许用户根据他们选择的分层细胞骨架系统定制测定。首先，将两片双面胶带贴在显微镜载玻片的中间，彼此相距三到四毫米。然后撕下或切断悬挂在载玻片边缘的多余胶带。接下来，将PLL涂层的盖玻片添加到垂直于显微镜载玻片长轴的胶带顶部，以形成通道。使用小管将盖玻片压缩到胶带和显微镜上，彻底滑动直到胶带透明，确保胶带中没有气泡，因为这会导致流道泄漏。向PLL流通池中加入15微升稀释的罗丹明肌动蛋白，并通过流通池吸出多余的溶液，但不要让流道变干。然后，在湿度室中孵育10分钟。接下来，在肌动蛋白聚合缓冲液中制备每毫升1毫克酪蛋白溶液，并加入15微升溶液以防止后续组分的非特异性结合。然后，在湿度室中孵育五分钟。然后，将所需浓度的肌球蛋白添加到制备的生物素化肌动蛋白和珠悬浮液中，并用移液器吸头轻轻搅拌。然后，立即向流通池中加入15微升悬浮液以及所需的肌球蛋白浓度并孵育20分钟。接下来，用指甲油密封流通池的开口端，以防止在成像和光学捕获实验期间蒸发。系统准备就绪后，使用屏幕左下角的激光电源按钮将激光器打开至 50 毫瓦，并使其稳定 30 分钟。依次单击软件中的照明、相机、物镜和载物台移动按钮，以调出这些窗口，以便在实验过程中进行查看和操作。通过单击开/关按钮打开显微镜照明，并通过单击并一直向右拖动条将其设置为最大功率。打开样品区域并从显微镜载物台上取下样品架。然后添加流通池并用金属样品架固定，确保盖玻片位于底部。然后，在底部物镜的中心加入30微升RO水并重新插入样品台。然后使用遥控器上的L2升高下部物镜，直到水珠接触盖玻片。接下来，使用遥控器上的R2降低顶部物镜，直到达到到流通池距离的一半左右。然后，将170微升RO水添加到流通池顶部的顶部，直接在顶部物镜下方，并降低顶部物镜，直到它破坏水的表面张力并形成弯月面。随后，使用遥控器上的箭头垫移动显微镜载物台，直到到达靠近流道的胶带边缘，然后关闭样品门。使用屏幕中的物镜窗口，通过单击上方箭头向上显示名为“激光物镜”的底部物镜，并使用屏幕控制单击底部箭头，使顶部物镜上方物镜。找到一个漂浮的珠子并通过单击陷阱快门按钮来捕获它，这将打开快门并允许捕获激光击中样品。然后，单击屏幕上的陷阱光标并拖动它以移动捕获激光的位置。捕获后，通过单击校准按钮校准磁珠。然后，单击设置并输入软件窗口左下角的珠子直径和载物台温度。接下来，单击陷阱 1，然后单击 X 信号并通过单击运行来执行角频率拟合。然后在窗口中单击并拖动以优化功能拟合度。然后，单击将其用于灵敏度和刚度值，然后接受值。接下来，关闭窗口。通过搜索与盖玻片表面上的 AF 结合的磁珠并查找共定位的两个荧光 AF，找到肌动球蛋白束。打开白色光源，并使用适当的滤光片立方体通过转动转塔对每个肌动蛋白丝进行成像。验证后，通过单击陷阱快门按钮捕获附着在束顶部细丝上的珠子。然后，通过使用屏幕上的控件单击示波器按钮来记录数据。要在不记录数据的情况下可视化测量，请单击“开始”，然后单击“自动保存”以保存所有数据。要记录测量值，请单击“开始记录”，然后通过从下拉菜单中选择“X 信号”或“Y 信号”来选择要实时可视化的数据。骨骼肌球蛋白马达在构建的体外肌动蛋白结构层次结构内产生力的力迹线表现出稳定的力斜坡，直到在两到五分钟内达到平台期。然而，还观察到一些不产生任何净力的肌动肌肽束，并且力迹线显示为基线噪声，或者由于电机浓度低或灯丝的平行方向不利，在90秒内没有表现出实质性的力净增加。该协议的开发将为构建更复杂的体外细胞骨架测定铺平道路，这将进一步帮助模拟大规模的细胞任务，例如自下而上的细胞分裂和肌肉收缩。

Research

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