Name: probing myosin ensemble mechanics in actin filament bundles using optical tweezers
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers at JoVE.com

Dette arbejde støttes delvist af University of Mississippi Graduate Student Council Research Fellowship (OA), University of Mississippi Sally McDonnell-Barksdale Honors College (JCW, JER), Mississippi Space Grant Consortium under tilskudsnummer NNX15AH78H (JCW, DNR) og American Heart Association under tilskudsnummer 848586 (DNR).

1. Ætsning af dæksler
<ol><li>100 g KOH opløses i 300 ml 100 % ethanol i et 1.000 ml bægerglas. Rør med en rørestang, indtil størstedelen af KOH er opløst. FORSIGTIG: Koncentreret KOH-opløsning kan forårsage forbrændinger og skader på tøj. Brug handsker, øjenbeskyttelse og en kittel.</li>
	<li>Placer dæksler individuelt i dækslip-rengøringsstativer. BEMÆRK: Racks er designet med slidser, der holder enkelte dækslips adskilt for at muliggøre ætsning og skylning på hver side af...

En in vitro-undersøgelse ved hjælp af optisk pincet kombineret med fluorescensbilleddannelse blev udført for at undersøge dynamikken i myosinensembler, der interagerer med actinfilamenter. Actin-myosin-actin-bundter blev samlet ved hjælp af muskelmyosin II, rhodamin actin i bunden af bundtet og på dækslipoverfladen og 488-mærkede, biotinylerede actinfilamenter på toppen af bundtet. Actinprotein fra kaninmuskel blev polymeriseret og stabiliseret ved anvendelse af generelle actinbuffere (GAB) og actinpoly...

Motorproteiner er afgørende for livet og omdanner kemisk energi til mekanisk arbejde 1,2,3. Myosinmotorer interagerer med actinfilamenter ved at tage trin langs filamenterne svarende til et spor, og dynamikken i actin-myosin-netværk udfører muskelkontraktion, cellemotilitet, den kontraktile ring under cytokinese og bevægelse af last inde i cellen, blandt andre væsentlige opgaver 3,4,5,6,7,8 . Da myosiner har så mange væsentlige roller, kan svigt i funktionaliteten af myosin-actin-netværket føre til sygdomsudvikling, såsom mutationer i myosin-tungkæden, der forårsager hjertehyperkontraktilitet i hypertrofisk kardiomyopati (HCM)9,10,11,12,13,14 . I muskelkontraktion samarbejder individuelle myosinmotorer med hinanden ved at arbejde som et ensemble for at give den nødvendige mekaniske energi, der udfører den relative glidning af AFs 4,15,16,17,18. Myosinmotorer danner tværbroer mellem AF'er og bruger konformationsændringer på grund af dets mekanokemiske cyklus til kollektivt at bevæge sig mod den piggede ende af de justerede filamenter 17,18,19,20,21.
Udvikling af kvantitative in vitro-motilitetsassays på SM-niveau ved hjælp af teknikker som optisk fangst har gjort det lettere at indsamle hidtil usete detaljer om, hvordan individuelle myosinmotorer fungerer, herunder måling af SM-kraftgenerering og trinstørrelser 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al. udviklede "tre-perle" eller "håndvægt" optisk fangstanalyse for at undersøge kraftgenereringsmekanikken i enkelt myosin II-motorer23,31. Da muskelmyosin II arbejder i hold for at indgå AF'er, men er ikke-processiv på SM-niveau, måtte den optiske fangstassayorientering omarrangeres fra den klassiske motorbundne perletilgang32. For at danne håndvægtsanalysen blev to optiske fælder brugt til at holde en AF over en myosinmotor bundet til en dækslip-fastgjort perle, og kraftudgangen fra den enkelte motor blev målt gennem bevægelser af AF inden for fælden23.
SM-kræfter og brug af en enkelt motor / enkelt filament assay orientering giver imidlertid ikke et fuldt billede af kraftgenerering på systemniveau, da mange motorproteiner, herunder myosin II, ikke fungerer isoleret og ofte ikke fungerer som en sum af deres dele 15,16,17,32,33,34,35,36 . Mere komplekse strukturer, der omfatter mere end en motor, der interagerer med mere end et filament, er nødvendige for bedre at forstå synergien mellem myosin- og actinfilamenternes netværk 15,32. Håndvægtsanalyseorienteringen er blevet udnyttet til at undersøge generering af små ensemblekræfter ved at have flere myosiner fastgjort til en perle eller ved hjælp af et myosintykt filament fastgjort til en overflade og lade motorerne interagere med den suspenderede AF 4,23,34,37,38,39,40.
Andre små ensembleassays omfatter et in vitro-filament-glidende assay, hvor myosinmotorer er belagt på en dækslipoverflade, og en perle bundet til en AF bruges til at undersøge den kraft, der genereres af teamet af motorer4,35,36,38,39,40,41,42,43 . I begge disse tilfælde er myosinerne bundet til en stiv overflade - perle eller dækslip - og bruger en AF. I disse tilfælde er motorerne ikke i stand til at bevæge sig frit eller kommunikere med hinanden, og det afspejler heller ikke det at have myosiner stift bundet det kompatible, hierarkiske miljø, hvor motorerne ville arbejde sammen i sarkomeren32. Tidligere undersøgelser har antydet, at myosin II kan mærke sit miljø og tilpasse sig i overensstemmelse hermed til skiftende viskoelastiske eller motoriske koncentrationsforhold ved at ændre egenskaber som kraftgenerering og toldforhold41,44,45. Der er således behov for at udvikle et optisk fangstassay, der fremmer og fanger motorkommunikation og systemkompatibilitet for at tegne et mere realistisk billede af det mekaniske grundlag for myosin II ensemblekraftgenerering.
Her udviklede vi en metode til at koble hierarkisk struktur in vitro med optisk fangst ved at danne actomyosinbundter eller sandwich bestående af flere myosinmotorer, der interagerer mellem to actinfilamenter. Denne modulære assay geometri har evnen til direkte at undersøge, hvordan molekylære og miljømæssige faktorer påvirker ensemble myosin kraft generation. Endvidere har undersøgelse af kraftgenereringsmekanismer gennem disse actin-myosin-ensembler potentialet til at hjælpe med modellering og forståelse af, hvordan store cellulære opgaver, såsom muskelkontraktion, formerer sig fra det molekylære niveau 9,10,13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actin protein (biotin): skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AB07-A</td>
			<td>Biotinylated actin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein, rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99-A</td>
			<td>Actin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Actin stabilizer and Alexa Fluor 488 stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP413-25</td>
			<td>Required for actin assembly and myosin motility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-D-glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>MP218069110</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting Grade Blocker (casein)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Used to block surface from non-specific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>C79500</td>
			<td>Calcium chloride, provides the necessary control over the dynamics of actin myosin network</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>ICN10040280</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12544C</td>
			<td>Used to make flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AC327190010</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td>Regent used for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>34-538-610KU</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>Used to etch coverslips and adjust buffer pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td>Used to make flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin II protein: rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MY02</td>
			<td>Full length myosin motor protein isolated from rabbit skeletal muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotracker2</td>
			<td>Bruker/JPK</td>
			<td>NT2</td>
			<td>Optical trapping instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Facilities adhesion of actin filaments onto glass surface of the coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>PHDR1</td>
			<td>Actin stabilizer and rhodamine fluorescent stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads, 1 &#956;m</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-10-5</td>
			<td>Optical trapping handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>PR H5121</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing myosin ensemble mechanics in actin filament bundles using optical tweezers

Myosiner er motorproteiner, der hydrolyserer ATP for at træde langs actinfilament (AF) spor og er afgørende i cellulære processer såsom motilitet og muskelkontraktion. For at forstå deres kraftgenererende mekanismer er myosin II blevet undersøgt både på enkeltmolekyle (SM) niveau og som hold af motorer in vitro ved hjælp af biofysiske metoder såsom optisk fangst.
Disse undersøgelser viste, at myosinkraftgenererende adfærd kan variere meget, når man bevæger sig fra enkeltmolekyleniveauet i et tre-perlearrangement til grupper af motorer, der arbejder sammen på en stiv perle eller dækslipoverflade i et glidende arrangement. Imidlertid tillader disse analysekonstruktioner ikke at evaluere myosins gruppedynamik inden for viskoelastisk strukturelt hierarki, som de ville inden for en celle. Vi har udviklet en metode ved hjælp af optisk pincet til at undersøge mekanikken i kraftgenerering af myosinensembler, der interagerer med flere actinfilamenter.
Disse actomyosin-bundter letter efterforskningen i et hierarkisk og kompatibelt miljø, der fanger motorkommunikation og ensemblekraftoutput. Analysens tilpassede karakter gør det muligt at ændre eksperimentelle forhold for at forstå, hvordan ændringer af myosinensemblet, actinfilamentbundtet eller det omgivende miljø resulterer i forskellige kraftudgange.

Flowceller, der indeholder actomyosinbundtsystemerne, er af standarddesign, der består af et mikroskopglas og en ætset dækslip adskilt af en kanal lavet af dobbeltsidet klæbebånd (figur 1). Analysen bygges derefter fra coverslip op ved hjælp af iscenesatte introduktioner som beskrevet i protokollen. Det endelige assay består af skabelon rhodamin-mærkede actinfilamenter; den ønskede myosinkoncentration (1 μM blev anvendt til de repræsentative resultater i figur <strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers at JoVE.com

Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

Dannelse af actomyosinbundter in vitro og måling af myosinensemblekraftgenerering ved hjælp af optisk pincet præsenteres og diskuteres.

Sondering af myosinensemblemekanik i Actin-filamentbundter ved hjælp af optisk pincet

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle ...

Undersøgelse af actinadfærd ved hjælp af denne protokol er signifikant, fordi det giver brugeren mulighed for at undersøge motorisk proteinensembledynamik ved hjælp af præcisionen af optisk fangst. Den største fordel ved denne teknik er evnen til at måle myosinmekanik inden for actin strukturelt hierarki, i modsætning til den traditionelle enkeltmotoriske enkeltfilamentorientering, der anvendes i mange optiske fangsteksperimenter. En anden fordel ved denne protokol er dens modulære karakter, som giver brugeren mulighed for at tilpasse analysen til det hierarkiske cytoskeletsystem efter eget valg.Til at begynde med skal du anvende to stykker dobbeltsidet klæbebånd på midten af et mikroskop, der glider tre til fire millimeter fra hinanden. Riv eller skær derefter det overskydende tape af, der hænger ud over kanten af diaset. Tilføj derefter den PLL-belagte dækselslip oven på båndet vinkelret på mikroskopets lange akse for at danne en kanal.Brug et lille rør til at komprimere dækslet på båndet og mikroskopet til at glide grundigt, indtil båndet er gennemsigtigt, hvilket sikrer, at der ikke er bobler i båndet, da dette kan forårsage lækage fra flowkanalen. Tilsæt 15 mikroliter af det fortyndede rhodamin actin til PLL-flowcellen og væg den overskydende opløsning gennem flowcellen, men lad ikke strømningskanalen blive tør. Derefter inkuberes i 10 minutter i et fugtighedskammer.Derefter fremstilles en 1 milligram pr. milliliter kaseinopløsning i actinpolymerisationsbuffer og tilsættes 15 mikroliter af opløsningen for at forhindre ikke-specifik binding af de efterfølgende komponenter. Derefter inkuberes i fem minutter i et fugtighedskammer. Derefter tilsættes den ønskede koncentration af myosin til den tilberedte biotinylerede actin og perlesuspension og omrøres forsigtigt med en pipettespids.Derefter tilsættes straks 15 mikroliter suspension sammen med den ønskede myosinkoncentration til strømningscellen og inkuberes i 20 minutter. Forsegl derefter de åbne ender af flowcellen med neglelak for at forhindre fordampning under billeddannelse og optiske fangsteksperimenter. Når systemet er klar, skal du tænde laseren ved hjælp af lasertænd / sluk-knappen i nederste venstre hjørne af skærmen til 50 milliwatt og lade den stabilisere sig i 30 minutter.Klik sekventielt på belysnings-, kamera-, mål- og scenebevægelsesknapperne i softwaren for at åbne disse vinduer til visning og manipulation under eksperimentet. Tænd for mikroskopbelysningen ved at klikke på tænd / sluk-knappen og indstille den til maksimal effekt ved at klikke og trække bjælken helt til højre. Åbn prøveområdet, og fjern prøveholderen fra mikroskopstadiet.Tilføj derefter flowcellen og fastgør den med metalprøveholderne, hvilket sikrer, at dækselslippet er på bunden. Derefter tilsættes 30 mikroliter RO-vand til midten af bundmålet, og prøvetrinnet indsættes igen. Hæv derefter det nederste mål ved hjælp af L2 på fjernbetjeningen, indtil vandperlen rører dækslet.Sænk derefter det øverste mål, indtil ca. halvdelen af afstanden til flowcellen er nået ved hjælp af R2 på fjernbetjeningen. Derefter tilsættes 170 mikroliter RO-vand til toppen af strømningscellen direkte under det øverste mål og sænker det øverste mål, indtil det bryder vandets overfladespænding og danner en menisk. Flyt derefter mikroskoptrinnet ved hjælp af pilepuden på fjernbetjeningen, indtil kanten af båndet ved siden af flowkanalen er nået, og luk derefter prøvedøren.Brug målvinduet på skærmen til at bringe kanten af båndet og fokusere ved at bringe det nederste mål med navnet Lasermål op ved at klikke på den øverste pil og det øverste mål ved at klikke på den nederste pil ved hjælp af kontrolelementerne på skærmen. Find en flydende perle, og fang den ved at klikke på udløserknappen, som åbner lukkeren og tillader fældelaseren at ramme prøven. Klik derefter på fældemarkøren på skærmen, og træk den for at flytte placeringen af diffuseringslaseren.Når den er fanget, skal du kalibrere perlen ved at klikke på kalibreringsknappen. Klik derefter på Indstillinger og indtast diameteren af perlen og temperaturen på scenen, der findes nederst til venstre i softwarevinduet. Klik derefter på Trap 1, derefter på X Signal og udfør hjørnefrekvenstilpasningen ved at klikke på Kør.Klik og træk derefter i vinduet for at optimere funktionstilpasningen. Klik derefter på Brug det til følsomheds- og stivhedsværdier, og accepter derefter værdier. Luk vinduet derefter.Find et actomyosin-bundt ved at søge efter perler, der er bundet til AF'er på overfladen af dækslip, og ved at lede efter begge fluorescerende AF'er, der er lokaliseret i fællesskab. Tænd for den hvide lyskilde, og brug den relevante filterterning til at afbilde hvert actinfilament ved at dreje tårnet. Når den er verificeret, skal du fange perlen, der er fastgjort til bundtets øverste filament, ved at klikke på udløserknappen til fælden.Optag derefter dataene ved at klikke på oscilloskopknappen ved hjælp af kontrollerne på skærmen. For at visualisere målinger uden at registrere dataene skal du klikke på Start og derefter klikke på Autosave for at gemme alle dataene. For at registrere målinger skal du klikke på Start record og vælge, hvilke data der skal visualiseres i realtid ved at vælge fra rullemenuen X Signal eller Y Signal.Kraftsporet af skeletmyosinmotorer, der genererer kraft inden for det konstruerede in vitro actinstrukturelle hierarki, udviser konstant rampe i kraft, indtil et plateau nås over to til fem minutter. Det observeres imidlertid også, at nogle actomyosinbundter, der ikke genererer nogen nettokraft, og kraftsporene fremstår som basisstøj eller ikke udviser nogen væsentlig nettoforøgelse i kraft over 90 sekunder på grund af en lav koncentration af motor eller en ugunstig parallel orientering af filamenterne. Denne protokoludvikling vil bane vejen for at opbygge mere komplekse in vitro cytoskeletale assays, der yderligere vil hjælpe med at modellere store cellulære opgaver, såsom celledeling og muskelkontraktion nedefra og op.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexed enkelt-molekyle Tving proteolyse målinger ved hjælp Magnetiske Pincetter

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Overvågning af Wall Mekanik Under Stent Deployment i en beholder

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Syntese af Native, Fibrøst Long Mellemrum og Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Magnetiske pincet til måling af Twist og Moment

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Nanomanipulation af Single RNA-molekyler af Optisk Pincet

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Label-fri Single Molecule Detection Brug Microtoroid Optiske Resonatorer

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...