Name: probing myosin ensemble mechanics in actin filament bundles using optical tweezers
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers at JoVE.com

Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door de University of Mississippi Graduate Student Council Research Fellowship (OA), University of Mississippi Sally McDonnell-Barksdale Honors College (JCW, JER), het Mississippi Space Grant Consortium onder subsidienummer NNX15AH78H (JCW, DNR) en de American Heart Association onder subsidienummer 848586 (DNR).

1. Etsen coverslips
<ol><li>Los 100 g KOH op in 300 ml 100% ethanol in een bekerglas van 1.000 ml. Roer met een roerstaaf tot het grootste deel van de KOH is opgelost. LET OP: Geconcentreerde KOH-oplossing kan brandwonden en schade aan kleding veroorzaken. Draag handschoenen, oogbescherming en een laboratoriumjas.</li>
	<li>Plaats coverslips afzonderlijk in coverslip reinigingsrekken. OPMERKING: Racks zijn ontworpen met spleten die enkele coverslips uit elkaar houden om te kunnen etsen en spoelen...

Een in vitro studie met behulp van een optisch pincet in combinatie met fluorescentie beeldvorming werd uitgevoerd om de dynamiek van myosine ensembles interactie met actine filamenten te onderzoeken. Actine-myosine-actinebundels werden geassembleerd met behulp van spiermyosine II, rhodamine-actine aan de onderkant van de bundel en op het coverslipoppervlak en 488-gelabelde, gebiotinyleerde actinefilamenten aan de bovenkant van de bundel. Actine-eiwit uit konijnenspier werd gepolymeriseerd en gestabiliseerd met ...

Motoreiwitten zijn essentieel voor het leven en zetten chemische energie om in mechanisch werk 1,2,3. Myosinemotoren interageren met actinefilamenten door stappen te zetten langs de filamenten die vergelijkbaar zijn met een spoor, en de dynamiek van actine-myosinenetwerken voert spiercontractie, celmotiliteit, de contractiele ring tijdens cytokinese en beweging van lading in de cel uit, naast andere essentiële taken 3,4,5,6,7,8 . Omdat myosines zoveel essentiële rollen hebben, kan falen in de functionaliteit van het myosine-actinenetwerk leiden tot ziekteontwikkeling, zoals mutaties in de myosine-zware keten die harthypercontractiliteit veroorzaken bij hypertrofische cardiomyopathie (HCM)9,10,11,12,13,14 . Bij spiercontractie werken individuele myosinemotoren met elkaar samen door als een ensemble te werken om de vereiste mechanische energie te leveren die het relatieve glijden van AFs 4,15,16,17,18 uitvoert. Myosinemotoren vormen dwarsbruggen tussen AFs en gebruiken conformatieveranderingen als gevolg van de mechanochemische cyclus om collectief naar het prikkeldraadeinde van de uitgelijnde filamenten te bewegen 17,18,19,20,21.
De ontwikkeling van kwantitatieve in vitro motiliteitstests op SM-niveau met behulp van technieken zoals optische vallen heeft het verzamelen van ongekende details over hoe individuele myosinemotoren functioneren vergemakkelijkt, inclusief het meten van SM-krachtgeneratie en stapgroottes 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al. ontwikkelden de "three-bead" of "dumbbell" optische trapping assay om de krachtgeneratiemechanica van enkele myosine II-motorente onderzoeken 23,31. Omdat spiermyosine II in teams werkt om AFs te contracteren, maar niet-processief is op SM-niveau, moest de optische vangtestoriëntatie worden herschikt van de klassieke motorgebonden kraalbenadering32. Om de dumbbell-assay te vormen, werden twee optische vallen gebruikt om een AF over een myosinemotor te houden die gebonden was aan een aan coverslip bevestigde kraal, en de krachtafgifte door de enkele motor werd gemeten door bewegingen van de AF binnen de val23.
SM-krachten en het gebruik van een enkele motor / single filament assay oriëntatie geven echter geen volledig beeld over het genereren van kracht op systeemniveau, omdat veel motoreiwitten, waaronder myosine II, niet geïsoleerd werken en vaak niet functioneren als een som van hun delen 15,16,17,32,33,34,35,36 . Complexere structuren die meer dan één motor omvatten die interageert met meer dan één filament zijn nodig om de synergie van de netwerken van myosine- en actinefilamenten beter te begrijpen15,32. De dumbbell assay oriëntatie is gebruikt om kleine ensemblekrachtgeneratie te onderzoeken door meerdere myosines aan een kraal te bevestigen of een myosine-dik filament aan een oppervlak te bevestigen en de motoren in staat te stellen te interageren met de gesuspendeerde AF 4,23,34,37,38,39,40.
Andere kleine ensemble-assays omvatten een in vitro filamentglijdende assay waarbij myosinemotoren op een coverslipoppervlak worden gecoat en een kraal gebonden aan een AF wordt gebruikt om de kracht te onderzoeken die wordt gegenereerd door het team van motoren 4,35,36,38,39,40,41,42,43 . In beide gevallen zijn de myosinen gebonden aan een stijf oppervlak - kraal of coverslip - en gebruiken ze één AF. In deze gevallen zijn de motoren niet in staat om vrij te bewegen of met elkaar te communiceren, noch weerspiegelt het rigide gebonden hebben van myosinen de conforme, hiërarchische omgeving waarin de motoren zouden samenwerken in het sarcomeer32. Eerdere studies hebben gesuggereerd dat myosine II zijn omgeving kan voelen en zich dienovereenkomstig kan aanpassen aan veranderende visco-elastische of motorische concentratieomstandigheden door kenmerken zoals krachtgeneratie en duty ratio 41,44,45 te veranderen. Er is dus behoefte aan het ontwikkelen van een optische vangtest die motorische communicatie en systeemcompliancy bevordert en vastlegt om een realistischer beeld te schetsen van de mechanistische onderbouwing van myosine II ensemblekrachtgeneratie.
Hier ontwikkelden we een methode om hiërarchische structuur in vitro te koppelen aan optische vangst door actomyosinebundels of sandwiches te vormen die bestaan uit meerdere myosinemotoren die interageren tussen twee actinefilamenten. Deze modulaire testgeometrie heeft de mogelijkheid om direct te onderzoeken hoe moleculaire en omgevingsfactoren de generatie van myosinekrachten beïnvloeden. Verder heeft het onderzoeken van krachtgeneratiemechanismen via deze actine-myosine-ensembles het potentieel om te helpen bij het modelleren en begrijpen hoe grootschalige cellulaire taken, zoals spiercontractie, zich voortplanten vanaf het moleculaire niveau 9,10,13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actin protein (biotin): skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AB07-A</td>
			<td>Biotinylated actin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein, rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99-A</td>
			<td>Actin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Actin stabilizer and Alexa Fluor 488 stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP413-25</td>
			<td>Required for actin assembly and myosin motility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-D-glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>MP218069110</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting Grade Blocker (casein)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Used to block surface from non-specific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>C79500</td>
			<td>Calcium chloride, provides the necessary control over the dynamics of actin myosin network</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>ICN10040280</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12544C</td>
			<td>Used to make flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AC327190010</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td>Regent used for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>34-538-610KU</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>Used to etch coverslips and adjust buffer pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td>Used to make flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin II protein: rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MY02</td>
			<td>Full length myosin motor protein isolated from rabbit skeletal muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotracker2</td>
			<td>Bruker/JPK</td>
			<td>NT2</td>
			<td>Optical trapping instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Facilities adhesion of actin filaments onto glass surface of the coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>PHDR1</td>
			<td>Actin stabilizer and rhodamine fluorescent stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads, 1 &#956;m</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-10-5</td>
			<td>Optical trapping handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>PR H5121</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing myosin ensemble mechanics in actin filament bundles using optical tweezers

Myosines zijn motoreiwitten die ATP hydrolyseren om langs actinefilament (AF) tracks te stappen en zijn essentieel in cellulaire processen zoals motiliteit en spiercontractie. Om hun krachtgenererende mechanismen te begrijpen, is myosine II zowel op het niveau van één molecuul (SM) als als teams van motoren in vitro onderzocht met behulp van biofysische methoden zoals optische vangmethoden.
Deze studies toonden aan dat myosinekrachtgenererend gedrag sterk kan verschillen bij het verplaatsen van het niveau van één molecuul in een opstelling met drie kralen naar groepen motoren die samenwerken op een stijve kraal of een bedekkend oppervlak in een glijdende opstelling. Deze testconstructies laten echter niet toe om de groepsdynamiek van myosine binnen de visco-elastische structurele hiërarchie te evalueren zoals ze dat binnen een cel zouden doen. We hebben een methode ontwikkeld met behulp van optische pincetten om de mechanica van krachtgeneratie door myosine-ensembles te onderzoeken die interageren met meerdere actinefilamenten.
Deze actomyosinebundels vergemakkelijken onderzoek in een hiërarchische en conforme omgeving die motorische communicatie en ensemblekrachtoutput vastlegt. De aanpasbare aard van de test maakt het mogelijk om experimentele omstandigheden te wijzigen om te begrijpen hoe wijzigingen in het myosine-ensemble, de actinefilamentbundel of de omgeving resulteren in verschillende krachtoutputs.

Stromingscellen die de actomyosinebundelsystemen bevatten, hebben een standaardontwerp, bestaande uit een microscoopglaasje en een geëtste coverslip gescheiden door een kanaal gemaakt van dubbelzijdig plakband (figuur 1). De test wordt vervolgens opgebouwd uit de coverslip-up met behulp van gefaseerde introducties zoals beschreven in het protocol. De laatste test bestaat uit sjabloon rhodamine-gelabelde actinefilamenten; de gewenste myosineconcentratie (1 μM werd gebruikt voor de represent...

Watch this Scientific Journal Video about Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers at JoVE.com

Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

Vorming van actomyosinebundels in vitro en het meten van myosine ensemblekrachtgeneratie met behulp van een optisch pincet wordt gepresenteerd en besproken.

Myosine Ensemble Mechanics onderzoeken in Actin Filament Bundles met behulp van optische pincetten

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle ...

Het onderzoeken van actinegedrag met behulp van dit protocol is belangrijk omdat het de gebruiker in staat stelt om de dynamiek van het motoreiwitensemble te onderzoeken met behulp van de precisie van optische vallen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om myosinemechanica te meten binnen de actine structurele hiërarchie, in tegenstelling tot de traditionele single-motor single-filament oriëntatie die wordt gebruikt in veel optische vangexperimenten. Een ander voordeel van dit protocol is het modulaire karakter, waarmee de gebruiker de test kan aanpassen aan het hiërarchische cytoskeletsysteem van zijn keuze.Breng om te beginnen twee stukjes dubbelzijdig plakband aan op het midden van een microscoopglaasje dat drie tot vier millimeter van elkaar verwijderd is. Scheur of knip vervolgens de overtollige tape af die aan de rand van de dia hangt. Voeg vervolgens de PLL-gecoate afdekslip toe bovenop de tape loodrecht op de lange as van de microscoopglaasje om een kanaal te vormen.Gebruik een kleine buis om de afdekselglijder op de tape en microscoop te comprimeren, schuif grondig totdat de tape transparant is en zorg ervoor dat er geen bellen in de tape zitten, omdat dit lekkage uit het stroomkanaal kan veroorzaken. Voeg 15 microliter van de verdunde rhodamine-actine toe aan de PLL-stroomcel en laat de overtollige oplossing door de stroomcel stromen, maar laat het stroomkanaal niet droog worden. Incubeer vervolgens gedurende 10 minuten in een vochtigheidskamer.Bereid vervolgens een caseïneoplossing van één milligram per milliliter in actinepolymerisatiebuffer en voeg 15 microliter van de oplossing toe om niet-specifieke binding van de volgende componenten te voorkomen. Incubeer vervolgens gedurende vijf minuten in een vochtigheidskamer. Voeg daarna de gewenste concentratie myosine toe aan de bereide gebiotinyleerde actine en kralensuspensie en roer voorzichtig met een pipetpunt.Voeg vervolgens onmiddellijk 15 microliter van de suspensie samen met de gewenste myosineconcentratie toe aan de stroomcel en incubeer gedurende 20 minuten. Sluit vervolgens de open uiteinden van de stroomcel af met nagellak om verdamping tijdens beeldvormings- en optische vangexperimenten te voorkomen. Zodra het systeem klaar is, schakelt u de laser in met behulp van de aan / uit-laserknop in de linkerbenedenhoek van het scherm tot 50 milliwatt en laat u deze gedurende 30 minuten stabiliseren.Klik achtereenvolgens op de knoppen verlichting, camera, objectief en podiumbeweging in de software om die vensters te openen voor weergave en manipulatie tijdens het experiment. Schakel de microscoopverlichting in door op de aan/ uit-knop te klikken en deze in te stellen op maximaal vermogen door op de balk helemaal naar rechts te klikken en te slepen. Open het monstergebied en verwijder de monsterhouder uit het microscoopstadium.Voeg vervolgens de stroomcel toe en bevestig deze met de metalen monsterhouders, zodat de afdekslip zich aan de onderkant bevindt. Voeg daarna 30 microliter RO-water toe aan het midden van het onderste objectief en plaats het monsterstadium opnieuw. Verhoog vervolgens het onderste doel met behulp van de L2 op de afstandsbediening totdat de kraal water de afdekslip raakt.Verlaag vervolgens het bovenste doel totdat ongeveer de helft van de afstand tot de stroomcel is bereikt met behulp van de R2 op de afstandsbediening. Voeg vervolgens 170 microliter RO-water toe aan de bovenkant van de stroomcel direct onder het bovenste objectief en verlaag het bovenste objectief totdat het de oppervlaktespanning van het water breekt en een meniscus vormt. Verplaats vervolgens het microscoopstadium met behulp van het pijlpunt op de afstandsbediening totdat de rand van de tape naast het stroomkanaal is bereikt en sluit vervolgens de monsterdeur.Gebruik het doelvenster in het scherm om de rand van de tape te brengen en scherp te stellen door het onderste objectief met de naam Laser Objective omhoog te brengen door op de bovenste pijl te klikken en het bovenste objectief door op de onderste pijl te klikken met behulp van de bedieningselementen op het scherm. Zoek een zwevende kraal en vang deze door op de sluiterknop te klikken, waardoor de sluiter wordt geopend en de vanglaser het monster kan raken. Klik vervolgens op de trapcursor op het scherm en sleep deze om de locatie van de vanglaser te verplaatsen.Eenmaal gevangen, kalibreer de kraal door op de kalibratieknop te klikken. Klik vervolgens op Instellingen en typ de diameter van de kraal en de temperatuur van het podium linksonder in het softwarevenster. Klik vervolgens op Trap 1, vervolgens op X Signal en voer de hoekfrequentie uit door op Uitvoeren te klikken.Klik en sleep vervolgens in het venster om de functie te optimaliseren. Klik daarna op Gebruik het voor gevoeligheids- en stijfheidswaarden en accepteer vervolgens waarden. Sluit hierna het venster.Vind een actomyosinebundel door te zoeken naar kralen gebonden aan AFs op het oppervlak van de cover slip en door te zoeken naar beide fluorescerende AFs co-gelokaliseerd. Schakel de witte lichtbron in en gebruik de juiste filterkubus om elk actinefilament in beeld te brengen door aan het torentje te draaien. Eenmaal geverifieerd, vang de kraal die aan de bovenste gloeidraad van de bundel is bevestigd door op de sluiterknop te klikken.Leg vervolgens de gegevens vast door op de oscilloscoopknop te klikken met behulp van de bedieningselementen op het scherm. Om metingen te visualiseren zonder de gegevens te registreren, klikt u op Start en vervolgens op Automatisch opslaan om alle gegevens op te slaan. Om metingen op te nemen, klikt u op Record starten en kiest u welke gegevens in realtime moeten worden gevisualiseerd door te kiezen uit het vervolgkeuzemenu X Signal of Y Signal.Het krachtspoor van skeletmyosinemotoren die kracht genereren binnen de geconstrueerde in vitro actine structurele hiërarchie vertonen een gestage opmars in kracht totdat een plateau gedurende twee tot vijf minuten wordt bereikt. Er wordt echter ook opgemerkt dat sommige actomyosinebundels die geen nettokracht en de krachtsporen genereren, verschijnen als basisgeluid of geen substantiële netto toename van de kracht vertonen gedurende 90 seconden als gevolg van een lage concentratie motor of een ongunstige parallelle oriëntatie van de filamenten. Deze protocolontwikkeling zal de weg vrijmaken voor het bouwen van complexere in vitro cytoskeletale assays die verder zullen helpen bij het modelleren van grootschalige cellulaire taken, zoals celdeling en spiercontractie van onderop.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Drie-dimensionale Optische resolutie Fotoakoestisch Microscopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Multiparametrische Optische kaart brengen van de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Optische kaart brengen van actiepotentialen en Calcium Transiënten in de muis Hart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Stretching korte sequenties van DNA met Constant Force Axiale optisch pincet

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexed Single-molecule force Proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Monitoring van de Muur Mechanics Tijdens stent in een bloedvat

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro synthese van Native, Stapel Lange Afstand en Segmentale Lange Afstand Collageen

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Magnetische pincet voor het meten van Twist en Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Nanomanipulatie van Single RNA-moleculen door een optisch pincet

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Label-free Single Molecule Detectie Met behulp microtoroıde optische resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...