Name: probing myosin ensemble mechanics in actin filament bundles using optical tweezers
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers at JoVE.com

Ce travail est soutenu en partie par le Graduate Student Council Research Fellowship (OA) de l’Université du Mississippi, le Sally McDonnell-Barksdale Honors College de l’Université du Mississippi (JCW, JER), le Mississippi Space Grant Consortium sous le numéro de subvention NNX15AH78H (JCW, DNR) et l’American Heart Association sous le numéro de subvention 848586 (DNR).

1. Graver les lamelles de couverture
<ol><li>Dissoudre 100 g de KOH dans 300 mL d’éthanol à 100 % dans un bécher de 1 000 mL. Remuer avec une barre d’agitation jusqu’à ce que la majorité du KOH soit dissoute. ATTENTION: La solution concentrée de KOH peut causer des brûlures et endommager les vêtements. Portez des gants, une protection oculaire et une blouse de laboratoire.</li>
	<li>Placez les lamelles de couverture individuellement dans des supports de nettoyage de lames de couverture...

Une étude in vitro utilisant des pincettes optiques combinées à l’imagerie par fluorescence a été réalisée pour étudier la dynamique des ensembles de myosine interagissant avec les filaments d’actine. Les faisceaux d’actine-myosine-actine ont été assemblés à l’aide de myosine musculaire II, d’actine rhodamine au bas du faisceau et sur la surface de la lame, et de filaments d’actine biotinylés marqués 488 sur le dessus du paquet. La protéine d’actine du muscle de lapin a été polymé...

Les protéines motrices sont essentielles à la vie, convertissant l’énergie chimique en travail mécanique 1,2,3. Les moteurs de myosine interagissent avec les filaments d’actine en faisant des pas le long des filaments comme une piste, et la dynamique des réseaux actine-myosine effectue la contraction musculaire, la motilité cellulaire, l’anneau contractile pendant la cytocinèse et le mouvement de la cargaison à l’intérieur de la cellule, entre autres tâches essentielles 3,4,5,6,7,8 . Étant donné que les myosines ont tant de rôles essentiels, une défaillance de la fonctionnalité du réseau myosine-actine peut entraîner le développement de maladies, telles que des mutations dans la chaîne lourde de myosine qui provoquent une hypercontractilité cardiaque dans la cardiomyopathie hypertrophique (CMH)9,10,11,12,13,14 . Dans la contraction musculaire, les moteurs individuels de la myosine coopèrent les uns avec les autres en travaillant comme un ensemble pour fournir l’énergie mécanique requise qui effectue le glissement relatif des AF 4,15,16,17,18. Les moteurs de myosine forment des ponts croisés entre les FA et utilisent les changements conformationnels dus à son cycle mécanochimique pour se déplacer collectivement vers l’extrémité barbelée des filaments alignés 17,18,19,20,21.
La mise au point d’essais quantitatifs de motilité in vitro au niveau SM à l’aide de techniques telles que le piégeage optique a facilité la collecte de détails sans précédent sur le fonctionnement des moteurs individuels de la myosine, y compris la mesure de la génération de force SM et de la taille des pas 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al. ont mis au point le test de piégeage optique « à trois billes » ou « haltères » pour sonder la mécanique de génération de force des moteurs à myosine II simples23,31. Comme la myosine musculaire II fonctionne en équipe pour contracter les FA mais n’est pas processive au niveau SM, l’orientation du test de piégeage optique a dû être réorganisée à partir de l’approche classique des perles liées au moteur32. Pour former le test d’haltères, deux pièges optiques ont été utilisés pour maintenir une mise au point automatique au-dessus d’un moteur de myosine lié à une perle fixée par un couvercle, et la force de sortie par le moteur unique a été mesurée par les mouvements de la mise au point automatique à l’intérieur du piège23.
Cependant, les forces SM et l’utilisation d’une orientation d’essai à un seul moteur/filament unique ne donnent pas une image complète de la génération de force au niveau du système, car de nombreuses protéines motrices, y compris la myosine II, ne fonctionnent pas isolément et ne fonctionnent souvent pas comme une somme de leurs parties 15,16,17,32,33,34,35,36 . Des structures plus complexes comprenant plus d’un moteur interagissant avec plus d’un filament sont nécessaires pour mieux comprendre la synergie des réseaux de myosine et d’actine 15,32. L’orientation du test d’haltères a été exploitée pour étudier la génération de force de petit ensemble en ayant plusieurs myosines attachées à une bille ou en utilisant un filament épais de myosine attaché à une surface et en permettant aux moteurs d’interagir avec la suspension AF 4,23,34,37,38,39,40.
D’autres essais de petit ensemble comprennent un essai de glissement filamentaire in vitro dans lequel les moteurs de myosine sont recouverts sur une surface de glissement de couverture, et une perle liée à une AF est utilisée pour sonder la force générée par l’équipe de moteurs 4,35,36,38,39,40,41,42,43 . Dans ces deux cas, les myosines sont liées à une surface rigide – perle ou lamelle de couverture – et utilisent une AF. Dans ces cas, les moteurs ne sont pas capables de se déplacer librement ou de communiquer entre eux, et le fait d’avoir des myosines rigidement liées ne reflète pas l’environnement hiérarchique conforme dans lequel les moteurs travailleraient ensemble dans le sarcomère32. Des études antérieures ont suggéré que la myosine II peut détecter son environnement et s’adapter en conséquence aux conditions changeantes de concentration viscoélastique ou motrice en modifiant des caractéristiques telles que la génération de force et le rapport de service41,44,45. Il est donc nécessaire de mettre au point un test de piégeage optique qui favorise et capture la communication motrice et la conformité du système afin de brosser un tableau plus réaliste des fondements mécanistes de la génération de force d’ensemble de la myosine II.
Ici, nous avons développé une méthode pour coupler la structure hiérarchique in vitro avec le piégeage optique en formant des faisceaux d’actomyosine ou des sandwichs constitués de plusieurs moteurs de myosine interagissant entre deux filaments d’actine. Cette géométrie de dosage modulaire a la capacité de sonder directement comment les facteurs moléculaires et environnementaux influencent la génération de la force de myosine d’ensemble. De plus, l’étude des mécanismes de génération de force à travers ces ensembles actine-myosine a le potentiel d’aider à modéliser et à comprendre comment les tâches cellulaires à grande échelle, telles que la contraction musculaire, se propagent à partir du niveau moléculaire 9,10,13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actin protein (biotin): skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AB07-A</td>
			<td>Biotinylated actin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein, rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99-A</td>
			<td>Actin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Actin stabilizer and Alexa Fluor 488 stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP413-25</td>
			<td>Required for actin assembly and myosin motility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-D-glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>MP218069110</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting Grade Blocker (casein)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Used to block surface from non-specific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>C79500</td>
			<td>Calcium chloride, provides the necessary control over the dynamics of actin myosin network</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>ICN10040280</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12544C</td>
			<td>Used to make flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AC327190010</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td>Regent used for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>34-538-610KU</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>Used to etch coverslips and adjust buffer pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td>Used to make flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin II protein: rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MY02</td>
			<td>Full length myosin motor protein isolated from rabbit skeletal muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotracker2</td>
			<td>Bruker/JPK</td>
			<td>NT2</td>
			<td>Optical trapping instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Facilities adhesion of actin filaments onto glass surface of the coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>PHDR1</td>
			<td>Actin stabilizer and rhodamine fluorescent stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads, 1 &#956;m</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-10-5</td>
			<td>Optical trapping handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>PR H5121</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing myosin ensemble mechanics in actin filament bundles using optical tweezers

Les myosines sont des protéines motrices qui hydrolysent l’ATP pour marcher le long des traces de filament d’actine (FA) et sont essentielles dans les processus cellulaires tels que la motilité et la contraction musculaire. Pour comprendre leurs mécanismes générateurs de force, la myosine II a été étudiée à la fois au niveau de la molécule unique (SM) et en tant qu’équipes de moteurs in vitro en utilisant des méthodes biophysiques telles que le piégeage optique.
Ces études ont montré que le comportement générateur de force de myosine peut différer considérablement lorsqu’il passe du niveau d’une seule molécule dans un arrangement à trois billes à des groupes de moteurs travaillant ensemble sur une surface rigide de bille ou de glissement de couverture dans un arrangement de glissement. Cependant, ces constructions de dosage ne permettent pas d’évaluer la dynamique de groupe de la myosine dans la hiérarchie structurelle viscoélastique comme elles le feraient dans une cellule. Nous avons développé une méthode utilisant des pincettes optiques pour étudier la mécanique de la génération de force par les ensembles de myosine interagissant avec plusieurs filaments d’actine.
Ces faisceaux d’actomyosine facilitent l’investigation dans un environnement hiérarchique et conforme qui capture la communication motrice et la sortie de force d’ensemble. La nature personnalisable du test permet de modifier les conditions expérimentales pour comprendre comment les modifications apportées à l’ensemble de myosine, au faisceau de filaments d’actine ou à l’environnement environnant entraînent des sorties de force différentes.

Les cellules d’écoulement contenant les systèmes de faisceaux d’actomyosine sont de conception standard, constituées d’une lame de microscope et d’une lamelle de couverture gravée séparée par un canal constitué de ruban adhésif double face (Figure 1). Le test est ensuite construit à partir de la fiche de couverture en utilisant des introductions par étapes comme décrit dans le protocole. Le test final consiste en des filaments d’actine marqués à la rhodamine ; la conce...

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Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

La formation de faisceaux d’actomyosine in vitro et la mesure de la génération de force d’ensemble de myosine à l’aide de pinces optiques sont présentées et discutées.

Criblage de la mécanique d’ensemble de la myosine dans des faisceaux de filaments d’actine à l’aide de pincettes optiques

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle ...

L’étude du comportement de l’actine à l’aide de ce protocole est importante car elle permet à l’utilisateur de sonder la dynamique de l’ensemble des protéines motrices en utilisant la précision du piégeage optique. Le principal avantage de cette technique est la capacité de mesurer la mécanique de la myosine dans la hiérarchie structurelle de l’actine, par opposition à l’orientation traditionnelle à filament unique à moteur utilisée dans de nombreuses expériences de piégeage optique. Un autre avantage de ce protocole est sa nature modulaire, qui permet à l’utilisateur de personnaliser le test au système cytosquelette hiérarchique de son choix.Pour commencer, appliquez deux morceaux de ruban adhésif double face au milieu d’une lame de microscope à trois à quatre millimètres l’un de l’autre. Ensuite, déchirez ou coupez l’excès de ruban adhésif qui pend du bord de la glissière. Ensuite, ajoutez le couvercle enduit de PLL sur le dessus de la bande perpendiculaire au grand axe de la lame de microscope pour former un canal.À l’aide d’un petit tube pour comprimer le couvercle sur la bande et le microscope, faites glisser soigneusement jusqu’à ce que la bande soit transparente, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles dans la bande car cela peut provoquer une fuite du canal d’écoulement. Ajouter 15 microlitres d’actine de rhodamine diluée à la cellule d’écoulement PLL et évacuer l’excès de solution à travers la cellule d’écoulement, mais ne laissez pas le canal d’écoulement s’assécher. Ensuite, incuber pendant 10 minutes dans une chambre d’humidité.Ensuite, préparez une solution de caséine d’un milligramme par millilitre dans un tampon de polymérisation d’actine et ajoutez 15 microlitres de la solution pour éviter la liaison non spécifique des composants suivants. Ensuite, incuber pendant cinq minutes dans une chambre d’humidité. Ensuite, ajoutez la concentration désirée de myosine à la suspension d’actine et de billes biotinylée préparée et remuez doucement avec un embout de pipette.Ensuite, ajoutez immédiatement 15 microlitres de la suspension avec la concentration de myosine souhaitée dans la cellule d’écoulement et incuber pendant 20 minutes. Ensuite, scellez les extrémités ouvertes de la cellule d’écoulement avec du vernis à ongles pour empêcher l’évaporation pendant les expériences d’imagerie et de piégeage optique. Une fois que le système est prêt, allumez le laser à l’aide du bouton d’alimentation laser situé dans le coin inférieur gauche de l’écran à 50 milliwatts et laissez-le se stabiliser pendant 30 minutes.Cliquez séquentiellement sur les boutons d’éclairage, de caméra, d’objectif et de mouvement de scène dans le logiciel pour afficher ces fenêtres de visualisation et de manipulation pendant l’expérience. Allumez l’éclairage du microscope en cliquant sur le bouton On/Off et réglez-le à puissance maximale en cliquant et en faisant glisser la barre tout en faisant glisser la barre vers la droite. Ouvrez la zone d’échantillon et retirez le porte-échantillon de l’étage du microscope.Ajoutez ensuite la cellule d’écoulement et fixez-la avec les porte-échantillons métalliques, en veillant à ce que le couvercle soit sur le fond. Ensuite, ajoutez 30 microlitres d’eau osmosée au centre de l’objectif inférieur et réinsérez l’étape de l’échantillon. Soulevez ensuite l’objectif inférieur à l’aide du L2 de la télécommande jusqu’à ce que le cordon d’eau touche le couvercle.Ensuite, abaissez l’objectif supérieur jusqu’à ce qu’environ la moitié de la distance jusqu’à la cellule d’écoulement soit atteinte à l’aide du R2 de la télécommande. Ensuite, ajoutez 170 microlitres d’eau osmosée au sommet de la cellule d’écoulement directement sous l’objectif supérieur et abaissez l’objectif supérieur jusqu’à ce qu’il brise la tension superficielle de l’eau et forme un ménisque. Ensuite, déplacez l’étage du microscope à l’aide du pavé fléché de la télécommande jusqu’à ce que le bord de la bande adjacent au canal d’écoulement soit atteint, puis fermez la porte de l’échantillon.À l’aide de la fenêtre d’objectif à l’écran, amenez le bord de la bande et la mise au point en amenant l’objectif inférieur nommé Objectif laser vers le haut en cliquant sur la flèche supérieure et l’objectif supérieur en cliquant sur la flèche inférieure à l’aide des commandes à l’écran. Trouvez un cordon flottant et piégez-le en cliquant sur le bouton de l’obturateur du piège, ce qui ouvrira l’obturateur et permettra au laser de piégeage de frapper l’échantillon. Ensuite, cliquez sur le curseur de recouvrement à l’écran et faites-le glisser pour déplacer l’emplacement du laser de piégeage.Une fois piégé, calibrez le cordon en cliquant sur le bouton d’étalonnage. Ensuite, cliquez sur Paramètres et tapez le diamètre de la perle et la température de la scène située en bas à gauche de la fenêtre du logiciel. Ensuite, cliquez sur Trap 1, puis sur X Signal et effectuez l’ajustement de fréquence de coin en cliquant sur Exécuter.Cliquez ensuite et faites glisser dans la fenêtre pour optimiser l’ajustement de la fonction. Ensuite, cliquez sur Utiliser pour les valeurs de sensibilité et de rigidité, puis acceptez les valeurs. Ensuite, fermez la fenêtre.Trouvez un faisceau d’actomyosine en recherchant les billes liées aux FA sur la surface du bordereau de couverture et en recherchant les deux AF fluorescents co-localisés. Allumez la source de lumière blanche et utilisez le cube filtrant approprié pour imager chaque filament d’actine en tournant la tourelle. Une fois vérifié, emprisonnez le cordon attaché au filament supérieur du faisceau en cliquant sur le bouton de l’obturateur du piège.Ensuite, enregistrez les données en cliquant sur le bouton de l’oscilloscope à l’aide des commandes à l’écran. Pour visualiser les mesures sans enregistrer les données, cliquez sur Démarrer, puis sur Enregistrement automatique pour enregistrer toutes les données. Pour enregistrer les mesures, cliquez sur Démarrer l’enregistrement et choisissez les données à visualiser en temps réel en choisissant dans le menu déroulant X Signal ou Y Signal.La trace de force des moteurs de myosine squelettique générant une force dans la hiérarchie structurelle d’actine in vitro construite présente une montée en force constante jusqu’à ce qu’un plateau soit atteint en deux à cinq minutes. Cependant, on observe également que certains faisceaux d’actomyosine qui ne génèrent aucune force nette et les traces de force apparaissent comme bruit de base ou ne présentent pas d’augmentation nette substantielle de la force sur 90 secondes en raison d’une faible concentration de moteur ou d’une orientation parallèle défavorable des filaments. Ce développement de protocole ouvrira la voie à la construction de tests cytosquelettiques in vitro plus complexes qui aideront davantage à modéliser des tâches cellulaires à grande échelle, telles que la division cellulaire et la contraction musculaire de bas en haut.

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