Name: probing myosin ensemble mechanics in actin filament bundles using optical tweezers
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers at JoVE.com

Dette arbeidet støttes delvis av University of Mississippi Graduate Student Council Research Fellowship (OA), University of Mississippi Sally McDonnell-Barksdale Honors College (JCW, JER), Mississippi Space Grant Consortium under tilskuddsnummer NNX15AH78H (JCW, DNR) og American Heart Association under tilskuddsnummer 848586 (DNR).

1. Etsning av deksler
<ol><li>Løs opp 100 g KOH i 300 ml 100% etanol i et 1000 ml beger. Rør med rørstang til flertallet av KOH er oppløst. FORSIKTIG: Konsentrert KOH-løsning kan forårsake brannskader og skade på klær. Bruk hansker, øyevern og en laboratoriefrakk.</li>
	<li>Plasser deksler individuelt i dekselrengjøringsstativer. MERK: Stativer er designet med spalter som holder enkle deksler fordelt fra hverandre for å tillate etsing og skylling på hver side av dekselet, dreneringshu...

En in vitro-studie med optisk pinsett kombinert med fluorescensavbildning ble utført for å undersøke dynamikken i myosinensembler som interagerer med aktinfilamenter. Actin-myosin-aktinbunter ble satt sammen ved hjelp av muskelmyosin II, rhodamin aktin i bunnen av bunten og på dekseloverflaten, og 488-merkede, biotinylerte aktinfilamenter på toppen av bunten. Actinprotein fra kaninmuskel ble polymerisert og stabilisert ved bruk av generelle aktinbuffere (GAB) og aktinpolymeriserende buffere (APB). GAB og AP...

Motorproteiner er essensielle for livet, og konverterer kjemisk energi til mekanisk arbeid 1,2,3. Myosinmotorer interagerer med aktinfilamenter ved å ta skritt langs filamentene som ligner på et spor, og dynamikken i aktin-myosin-nettverk utfører muskelkontraksjon, cellemotilitet, kontraktilringen under cytokinese og bevegelse av last inne i cellen, blant andre viktige oppgaver 3,4,5,6,7,8 . Siden myosiner har så mange viktige roller, kan svikt i funksjonaliteten til myosin-aktinnettverket føre til sykdomsutvikling, for eksempel mutasjoner i myosin-tungkjeden som forårsaker hjertehyperkontraktilitet i hypertrofisk kardiomyopati (HCM)9,10,11,12,13,14 . I muskelkontraksjon samarbeider individuelle myosinmotorer med hverandre ved å jobbe som et ensemble for å gi den nødvendige mekaniske energien som utfører den relative glidningen av AFs 4,15,16,17,18. Myosinmotorer danner tverrbroer mellom AFs og bruker konformasjonsendringer på grunn av sin mekanokjemiske syklus for kollektivt å bevege seg mot den piggete enden av de justerte filamentene 17,18,19,20,21.
Utvikling av kvantitative in vitro-motilitetsanalyser på SM-nivå ved hjelp av teknikker som optisk fangst har gjort det lettere å samle enestående detaljer om hvordan individuelle myosinmotorer fungerer, inkludert måling av SM-kraftgenerering og trinnstørrelser 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer og medarbeidere utviklet den optiske fangstanalysen "three-bead" eller "dumbbell" for å undersøke kraftgenereringsmekanikken til enkeltmyosin II-motorer23,31. Ettersom muskelmyosin II jobber i team for å få AF, men ikke er prosessiv på SM-nivå, måtte den optiske fangstanalyseretningen omorganiseres fra den klassiske motorbundne perletilnærmingen32. For å danne manualanalysen ble to optiske feller brukt til å holde en AF over en myosinmotor bundet til en dekselfestet perle, og kraftutgangen fra den ene motoren ble målt gjennom bevegelser av AF i fellen23.
SM-krefter og bruk av en enkelt motor / enkelt filamentanalyseorientering gir imidlertid ikke et fullstendig bilde av kraftgenerering på systemnivå, siden mange motorproteiner, inkludert myosin II, ikke fungerer isolert og ofte ikke fungerer som en sum av delene 15,16,17,32,33,34,35,36 . Mer komplekse strukturer som inkluderer mer enn en motor som interagerer med mer enn ett filament er nødvendig for å bedre forstå synergien til myosin og aktinfilamenter nettverk15,32. Manualanalyseorienteringen har blitt utnyttet til å undersøke generering av små ensemblekrefter ved å ha flere myosiner festet til en perle eller bruke et myosintykt filament festet til en overflate og la motorene samhandle med den suspenderte AF 4,23,34,37,38,39,40.
Andre små ensembleanalyser inkluderer en in vitro filament glidende analyse hvor myosinmotorer er belagt på en dekseloverflate, og en perle bundet til en AF brukes til å undersøke kraften som genereres av motorteamet 4,35,36,38,39,40,41,42,43 . I begge disse tilfellene er myosinene bundet til en stiv overflate - perle eller deksel - og bruker en AF. I disse tilfellene er motorene ikke i stand til å bevege seg fritt eller kommunisere med hverandre, og det å ha myosiner som er stivt bundet, gjenspeiler heller ikke det kompatible, hierarkiske miljøet der motorene ville fungere sammen i sarcomere32. Tidligere studier har antydet at myosin II kan fornemme miljøet og tilpasse seg tilsvarende endrede viskoelastiske eller motoriske konsentrasjonsforhold ved å endre egenskaper som kraftgenerering og driftsforhold41,44,45. Dermed er det behov for å utvikle en optisk fangstanalyse som fremmer og fanger motorisk kommunikasjon og systemkompatibilitet for å male et mer realistisk bilde av det mekanistiske grunnlaget for myosin II ensemblekraftgenerering.
Her utviklet vi en metode for å koble hierarkisk struktur in vitro med optisk fangst ved å danne actomyosinbunter eller smørbrød bestående av flere myosinmotorer som interagerer mellom to aktinfilamenter. Denne modulære analysegeometrien har evnen til direkte å undersøke hvordan molekylære og miljømessige faktorer påvirker ensemble myosin kraftgenerering. Videre har undersøkelse av kraftgenereringsmekanismer gjennom disse aktin-myosinensemblene potensial til å hjelpe til med modellering og forståelse av hvordan storskala cellulære oppgaver, som muskelkontraksjon, forplanter seg opp fra molekylært nivå 9,10,13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actin protein (biotin): skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AB07-A</td>
			<td>Biotinylated actin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein, rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99-A</td>
			<td>Actin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Actin stabilizer and Alexa Fluor 488 stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP413-25</td>
			<td>Required for actin assembly and myosin motility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-D-glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>MP218069110</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting Grade Blocker (casein)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Used to block surface from non-specific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>C79500</td>
			<td>Calcium chloride, provides the necessary control over the dynamics of actin myosin network</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>ICN10040280</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12544C</td>
			<td>Used to make flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AC327190010</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td>Regent used for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>34-538-610KU</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>Used to etch coverslips and adjust buffer pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td>Used to make flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin II protein: rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MY02</td>
			<td>Full length myosin motor protein isolated from rabbit skeletal muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotracker2</td>
			<td>Bruker/JPK</td>
			<td>NT2</td>
			<td>Optical trapping instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Facilities adhesion of actin filaments onto glass surface of the coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>PHDR1</td>
			<td>Actin stabilizer and rhodamine fluorescent stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads, 1 &#956;m</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-10-5</td>
			<td>Optical trapping handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>PR H5121</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing myosin ensemble mechanics in actin filament bundles using optical tweezers

Myosiner er motoriske proteiner som hydrolyserer ATP for å gå langs aktinfilament (AF) spor og er essensielle i cellulære prosesser som motilitet og muskelkontraksjon. For å forstå deres kraftgenererende mekanismer har myosin II blitt undersøkt både på enkeltmolekylnivå (SM) og som team av motorer in vitro ved hjelp av biofysiske metoder som optisk fangst.
Disse studiene viste at myosin kraftgenererende oppførsel kan variere sterkt når man beveger seg fra enkeltmolekylnivået i et tre-perlearrangement til grupper av motorer som arbeider sammen på en stiv perle eller dekseloverflate i et glidearrangement. Disse analysekonstruksjonene tillater imidlertid ikke evaluering av gruppedynamikken til myosin i viskoelastisk strukturhierarki som de ville gjort i en celle. Vi har utviklet en metode som bruker optisk pinsett for å undersøke mekanikken i kraftgenerering av myosinensembler som interagerer med flere aktinfilamenter.
Disse actomyosinbuntene letter etterforskning i et hierarkisk og kompatibelt miljø som fanger opp motorisk kommunikasjon og ensemblekraftutgang. Analysens tilpassbare natur gjør det mulig å endre eksperimentelle forhold for å forstå hvordan modifikasjoner av myosinensemblet, aktinfilamentbunten eller omgivelsene resulterer i forskjellige kraftutganger.

Strømningsceller som inneholder actomyosinbuntsystemene er av standard design, bestående av et mikroskop lysbilde og en etset coverslip atskilt med en kanal laget av dobbeltsidig klebrig tape (figur 1). Analysen bygges deretter fra omslaget opp ved hjelp av iscenesatte introduksjoner som beskrevet i protokollen. Den endelige analysen består av mal rhodamin-merket actin filaments; ønsket myosinkonsentrasjon (1 μM ble brukt for de representative resultatene i figur 2<...

Watch this Scientific Journal Video about Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers at JoVE.com

Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

Dannelse av actomyosinbunter in vitro og måling av myosinensemblekraftgenerering ved hjelp av optisk pinsett presenteres og diskuteres.

Probing Myosin Ensemble Mechanics i Actin Filament Bundles ved hjelp av optisk pinsett

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle ...

Å undersøke aktinoppførsel ved hjelp av denne protokollen er viktig fordi den tillater brukeren å undersøke motorproteinensembledynamikk ved hjelp av presisjonen til optisk fangst. Den største fordelen med denne teknikken er evnen til å måle myosinmekanikk innenfor aktins strukturelle hierarki, i motsetning til den tradisjonelle enkeltmotors enkeltfilamentorienteringen som brukes i mange optiske fangsteksperimenter. En annen fordel med denne protokollen er dens modulære natur, som gjør det mulig for brukeren å tilpasse analysen til det hierarkiske cytoskelettsystemet etter eget valg.For å begynne, bruk to stykker dobbeltsidig klebrig tape til midten av et mikroskop lysbilde tre til fire millimeter fra hverandre. Riv eller klipp deretter av overflødig tape som henger utenfor kanten av lysbildet. Deretter legger du til den PLL-belagte dekselgliden på toppen av båndet vinkelrett på mikroskopets lange akse for å danne en kanal.Bruk et lite rør for å komprimere dekselet på båndet og mikroskopet, skyv grundig til båndet er gjennomsiktig, og sørg for at det ikke er bobler i båndet, da dette kan føre til lekkasje fra strømningskanalen. Tilsett 15 mikroliter av det fortynnede rhodaminaktinet til PLL-strømningscellen og transporter overflødig løsning gjennom strømningscellen, men la ikke strømningskanalen bli tørr. Deretter ruges i 10 minutter i et fuktighetskammer.Deretter fremstilles en milligram per milliliter kaseinoppløsning i aktinpolymerisasjonsbuffer og tilsettes 15 mikroliter av løsningen for å forhindre ikke-spesifikk binding av de påfølgende komponentene. Deretter inkuberes i fem minutter i et fuktighetskammer. Etterpå tilsettes ønsket konsentrasjon av myosin til den tilberedte biotinylerte aktin- og perlesuspensjonen og røres forsiktig med en pipettespiss.Deretter tilsettes umiddelbart 15 mikroliter suspensjon sammen med ønsket myosinkonsentrasjon til strømningscellen og inkuberer i 20 minutter. Deretter forsegler du de åpne endene av flytcellen med neglelakk for å forhindre fordampning under avbildning og optiske fangsteksperimenter. Når systemet er klart, slår du på laseren ved hjelp av laserstrømknappen nederst til venstre på skjermen til 50 milliwatt og lar den stabilisere seg i 30 minutter.Klikk sekvensielt på belysnings-, kamera-, objektiv- og scenebevegelsesknappene i programvaren for å få opp vinduene for visning og manipulering under eksperimentet. Slå på mikroskopbelysningen ved å klikke på På / Av-knappen og sett den til maksimal effekt ved å klikke og dra linjen helt til høyre. Åpne prøveområdet og fjern prøveholderen fra mikroskopstadiet.Legg deretter til flytcellen og fest den med metallprøveholderne, slik at dekselet er på bunnen. Etterpå legger du til 30 mikroliter RO-vann til midten av bunnmålet og setter inn prøvetrinnet på nytt. Løft deretter det nedre målet ved hjelp av L2 på fjernkontrollen til vannperlen berører dekselet.Senk deretter toppmålet til omtrent halvparten av avstanden til strømningscellen er nådd ved hjelp av R2 på fjernkontrollen. Deretter tilsettes 170 mikroliter RO-vann til toppen av strømningscellen direkte under toppmålet og senker toppmålet til det bryter overflatespenningen i vannet og danner en menisk. Deretter flytter du mikroskoptrinnet ved hjelp av pilputen på fjernkontrollen til kanten av båndet ved siden av strømningskanalen er nådd, og lukker deretter prøvedøren.Bruk målvinduet på skjermen, ta kanten av båndet og fokuset ved å bringe det nederste målet kalt Laser Objective opp ved å klikke på den øvre pilen og det øverste målet ved å klikke på bunnpilen ved hjelp av skjermkontrollene. Finn en flytende perle og fell den ved å klikke på felleutløserknappen, som åpner lukkeren og lar fangstlaseren treffe prøven. Klikk deretter på overlappingsmarkøren på skjermen og dra den for å flytte plasseringen til overlappingslaseren.Når den er fanget, kalibrerer du perlen ved å klikke på kalibreringsknappen. Klikk deretter på Innstillinger og skriv inn diameteren på perlen og temperaturen på scenen nederst til venstre i programvarevinduet. Deretter klikker du på Trap 1, deretter på X Signal og utfører hjørnefrekvenstilpasningen ved å klikke på Kjør.Klikk deretter og dra i vinduet for å optimalisere funksjonstilpasningen. Etterpå klikker du på Bruk den til følsomhets- og stivhetsverdier og godtar deretter verdier. Deretter lukker du vinduet.Finn en actomyosin bunt ved å søke etter perler bundet til AFs på overflaten av dekselet slip og ved å se etter både fluorescerende AFs co-lokalisert. Slå på den hvite lyskilden og bruk riktig filterkube for å avbilde hvert aktinfilament ved å vri tårnet. Når den er bekreftet, fanger du perlen som er festet til det øverste filamentet i bunten ved å klikke på utløserknappen.Deretter registrerer du dataene ved å klikke på oscilloskopknappen ved hjelp av skjermkontrollene. For å visualisere målinger uten å registrere dataene, klikk på Start og klikk deretter på Autosave for å lagre alle dataene. For å registrere målinger, klikk på Start record og velg hvilke data som skal visualiseres i sanntid ved å velge fra rullegardinmenyen X Signal eller Y Signal.Kraftsporet av skjelettmyosinmotorer som genererer kraft i det konstruerte in vitro aktinstrukturelle hierarkiet, utviser jevn rampe i kraft til et platå nås over to til fem minutter. Imidlertid observeres det også at noen actomyosinbunter som ikke genererer noen nettokraft og kraftsporene vises som grunnlinjestøy eller ikke utviser noen betydelig netto økning i kraft over 90 sekunder på grunn av lav konsentrasjon av motor eller en ugunstig parallell orientering av filamenter. Denne protokollutviklingen vil bane vei mot å bygge mer komplekse in vitro cytoskeletale analyser som ytterligere vil bidra til å modellere storskala cellulære oppgaver, for eksempel celledeling og muskelkontraksjon nedenfra og opp.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexed Single-molekyl kraft proteolyse målinger ved hjelp av Magnetic pinsett

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Overvåking veggen Mechanics Under Stent Deployment i en Vessel

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Syntese av Native, Fibrous Long Mellomrom og Segmental Long avstand Kollagen

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Magnetiske pinsett for måling av Twist og dreiemoment

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Nanomanipulation av Enkelt RNA-molekyler ved optisk pinsett

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Etikett-free enkelt molekyl Detection Bruke Microtoroid Optiske resonatorer

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...