Name: probing myosin ensemble mechanics in actin filament bundles using optical tweezers
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers at JoVE.com

Este trabalho é apoiado em parte pela University of Mississippi Graduate Student Council Research Fellowship (OA), pela University of Mississippi Sally McDonnell-Barksdale Honors College (JCW, JER), pelo Mississippi Space Grant Consortium sob o número de concessão NNX15AH78H (JCW, DNR) e pela American Heart Association sob o número de concessão 848586 (DNR).

1. Folhas de cobertura de gravação
<ol><li>Dissolver 100 g de KOH em 300 mL de etanol a 100% em um copo de 1.000 mL. Mexa com uma barra de agitação até que a maioria do KOH tenha se dissolvido. CUIDADO: A solução concentrada de KOH pode causar queimaduras e danos à roupa. Use luvas, proteção para os olhos e um jaleco.</li>
	<li>Coloque as tampas individualmente em racks de limpeza de tampas. NOTA: Os racks são projetados com fendas que mantêm as tampas simples espaçadas para permitir...

Um estudo in vitro utilizando pinças ópticas combinadas com imagens de fluorescência foi realizado para investigar a dinâmica de conjuntos de miosina interagindo com filamentos de actina. Os feixes de actina-miosina-actina foram montados usando miosina muscular II, actina de rodamina na parte inferior do feixe e na superfície da lâmina de cobertura e filamentos de actina biotinilados marcados com 488 no topo do feixe. A proteína actina do músculo coelho foi polimerizada e estabilizada usando tampões ger...

As proteínas motoras são essenciais à vida, convertendo energia química em trabalho mecânico 1,2,3. Os motores de miosina interagem com os filamentos de actina dando passos ao longo dos filamentos semelhantes a uma trilha, e a dinâmica das redes de actina-miosina realiza a contração muscular, a motilidade celular, o anel contrátil durante a citocinese e o movimento de carga dentro da célula, entre outras tarefas essenciais 3,4,5,6,7,8 . Como as miosinas têm tantos papéis essenciais, a falha na funcionalidade da rede miosina-actina pode levar ao desenvolvimento de doenças, como mutações na cadeia pesada da miosina que causam hipercontratilidade cardíaca na cardiomiopatia hipertrófica (CMH)9,10,11,12,13,14 . Na contração muscular, os motores individuais de miosina cooperam entre si, trabalhando como um conjunto para fornecer a energia mecânica necessária que realiza o deslizamento relativo das FAs 4,15,16,17,18. Os motores de miosina formam pontes transversais entre as FAs e utilizam alterações conformacionais devido ao seu ciclo mecanoquímico para se moverem coletivamente em direção à extremidade farpada dos filamentos alinhados 17,18,19,20,21.
O desenvolvimento de ensaios quantitativos de motilidade in vitro no nível do SM usando técnicas como o aprisionamento óptico facilitou a coleta de detalhes sem precedentes de como os motores individuais de miosina funcionam, incluindo a medição da geração de força SM e os tamanhos dos passos 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al. desenvolveram o ensaio de aprisionamento óptico "três contas" ou "halteres" para investigar a mecânica de geração de força de motores de miosina II simples23,31. Como a miosina II muscular trabalha em equipes para contrair FAs, mas não é processiva no nível do SM, a orientação do ensaio de aprisionamento óptico teve que ser rearranjada a partir da abordagem clássica do grânulo ligado ao motor32. Para formar o ensaio de halteres, duas armadilhas ópticas foram utilizadas para segurar uma FA sobre um motor de miosina ligado a um cordão preso por deslizamento de cobertura, e a saída de força pelo motor único foi medida através de movimentos da FA dentro da armadilha23.
No entanto, as forças SM e o uso de uma única orientação motor/ensaio de filamento único não fornecem uma imagem completa sobre a geração de força no nível do sistema, uma vez que muitas proteínas motoras, incluindo a miosina II, não funcionam isoladamente e muitas vezes não funcionam como uma soma de suas partes 15,16,17,32,33,34,35,36 . Estruturas mais complexas que incluam mais de um motor interagindo com mais de um filamento são necessárias para melhor compreender a sinergia das redes de filamentos de miosina e actina15,32. A orientação do ensaio de halteres tem sido explorada para investigar a geração de força de pequenos conjuntos por ter múltiplas miosinas ligadas a um grânulo ou usando um filamento de miosina espessa ligado a uma superfície e permitindo que os motores interajam com a FA suspensa 4,23,34,37,38,39,40.
Outros pequenos ensaios de conjunto incluem um ensaio de deslizamento de filamento in vitro em que os motores de miosina são revestidos em uma superfície de deslizamento de cobertura, e um talão ligado a um FA é usado para sondar a força gerada pela equipe de motores 4,35,36,38,39,40,41,42,43 . Em ambos os casos, as miosinas estão ligadas a uma superfície rígida – grânulos ou deslizamento de cobertura – e utilizam um AF. Nesses casos, os motores não são capazes de se mover livremente ou se comunicar uns com os outros, nem ter miosinas rigidamente ligadas reflete o ambiente hierárquico e compatível em que os motores trabalhariam juntos no sarcômero32. Estudos anteriores sugeriram que a miosina II pode sentir seu ambiente e adaptar-se de acordo com as mudanças nas condições de concentração viscoelástica ou motora, alterando características como geração de força e razão de serviço41,44,45. Assim, há uma necessidade de desenvolver um ensaio de armadilhagem óptica que promova e capture a comunicação motora e a conformidade com o sistema para pintar uma imagem mais realista dos fundamentos mecanicistas da geração de força do conjunto de miosina II.
Aqui, desenvolvemos um método para acoplar estrutura hierárquica in vitro com aprisionamento óptico, formando feixes de actomiosina ou sanduíches consistindo de múltiplos motores de miosina interagindo entre dois filamentos de actina. Esta geometria de ensaio modular tem a capacidade de investigar diretamente como os fatores moleculares e ambientais influenciam a geração de força de miosina do conjunto. Além disso, investigar os mecanismos de geração de força por meio desses conjuntos de actina-miosina tem o potencial de auxiliar na modelagem e compreensão de como tarefas celulares em larga escala, como a contração muscular, se propagam a partir do nível molecular 9,10,13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actin protein (biotin): skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AB07-A</td>
			<td>Biotinylated actin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein, rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99-A</td>
			<td>Actin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Actin stabilizer and Alexa Fluor 488 stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP413-25</td>
			<td>Required for actin assembly and myosin motility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-D-glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>MP218069110</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting Grade Blocker (casein)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Used to block surface from non-specific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>C79500</td>
			<td>Calcium chloride, provides the necessary control over the dynamics of actin myosin network</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>ICN10040280</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12544C</td>
			<td>Used to make flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AC327190010</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td>Regent used for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>34-538-610KU</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>Used to etch coverslips and adjust buffer pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td>Used to make flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin II protein: rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MY02</td>
			<td>Full length myosin motor protein isolated from rabbit skeletal muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotracker2</td>
			<td>Bruker/JPK</td>
			<td>NT2</td>
			<td>Optical trapping instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Facilities adhesion of actin filaments onto glass surface of the coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>PHDR1</td>
			<td>Actin stabilizer and rhodamine fluorescent stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads, 1 &#956;m</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-10-5</td>
			<td>Optical trapping handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>PR H5121</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing myosin ensemble mechanics in actin filament bundles using optical tweezers

As miosinas são proteínas motoras que hidrolisam o ATP para percorrer as trilhas do filamento de actina (FA) e são essenciais em processos celulares, como motilidade e contração muscular. Para entender seus mecanismos geradores de força, a miosina II tem sido investigada tanto no nível de molécula única (SM) quanto como equipes de motores in vitro usando métodos biofísicos, como armadilhas ópticas.
Esses estudos mostraram que o comportamento gerador de força da miosina pode diferir muito quando se move do nível de molécula única em um arranjo de três esferas para grupos de motores trabalhando juntos em um grânulo rígido ou superfície de deslizamento de cobertura em um arranjo de deslizamento. No entanto, essas construções de ensaio não permitem avaliar a dinâmica de grupo da miosina dentro da hierarquia estrutural viscoelástica como fariam dentro de uma célula. Desenvolvemos um método utilizando pinças ópticas para investigar a mecânica de geração de força por conjuntos de miosina interagindo com múltiplos filamentos de actina.
Esses feixes de actomiosina facilitam a investigação em um ambiente hierárquico e complacente que captura a comunicação motora e a saída de força do conjunto. A natureza personalizável do ensaio permite alterar as condições experimentais para entender como as modificações no conjunto de miosina, no feixe de filamentos de actina ou no ambiente circundante resultam em diferentes saídas de força.

As células de fluxo que contêm os sistemas de feixe de actomiosina são de um projeto padrão, consistindo de uma lâmina de microscópio e uma lâmina de cobertura gravada separada por um canal feito de fita adesiva de dupla face (Figura 1). O ensaio é então construído a partir do deslizamento de cobertura usando introduções em estágios, conforme descrito no protocolo. O ensaio final consiste em filamentos de actina marcados com rodamina; a concentração de miosina desejada (1 μM ...

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Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

A formação de feixes de actomiosina in vitro e a medição da geração de força do conjunto de miosina usando pinças ópticas são apresentadas e discutidas.

Sondando a mecânica do conjunto de miosina em feixes de filamentos de actina usando pinças ópticas

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle ...

Investigar o comportamento da actina usando este protocolo é significativo porque permite ao usuário sondar a dinâmica do conjunto de proteínas motoras usando a precisão da armadilha óptica. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de medir a mecânica da miosina dentro da hierarquia estrutural da actina, em oposição à orientação tradicional de filamento único motor usada em muitos experimentos de aprisionamento óptico. Outra vantagem deste protocolo é a sua natureza modular, que permite ao usuário personalizar o ensaio para o sistema de citoesqueleto hierárquico de sua escolha.Para começar, aplique dois pedaços de fita adesiva de dupla face no meio de um microscópio deslizando de três a quatro milímetros de distância um do outro. Em seguida, rasgue ou corte o excesso de fita que fica pendurado na borda do slide. Em seguida, adicione a tampa revestida de PLL em cima da fita perpendicular ao longo eixo da lâmina do microscópio para formar um canal.Usando um pequeno tubo para comprimir a tampa deslize para a fita e o microscópio, deslize completamente até que a fita fique transparente, garantindo que não haja bolhas na fita, pois isso pode causar vazamento do canal de fluxo. Adicione 15 microlitros da actina de rodamina diluída à célula de fluxo PLL e passe o excesso de solução através da célula de fluxo, mas não permita que o canal de fluxo fique seco. Em seguida, incube por 10 minutos em uma câmara de umidade.Em seguida, prepare uma solução de caseína de um miligrama por mililitro em tampão de polimerização de actina e adicione 15 microlitros da solução para evitar a ligação não específica dos componentes subsequentes. Em seguida, incube por cinco minutos em uma câmara de umidade. Depois, adicione a concentração desejada de miosina à suspensão de actina e grânulos biotinilados preparados e mexa suavemente com uma ponta de pipeta.Em seguida, adicione imediatamente 15 microlitros da suspensão, juntamente com a concentração de miosina desejada, à célula de fluxo e incube por 20 minutos. Em seguida, sele as extremidades abertas da célula de fluxo com esmalte para evitar a evaporação durante os experimentos de imagem e aprisionamento óptico. Quando o sistema estiver pronto, ligue o laser usando o botão de energia a laser no canto inferior esquerdo da tela a 50 miliwatts e deixe-o estabilizar por 30 minutos.Clique sequencialmente nos botões de iluminação, câmera, objetivo e movimento do palco dentro do software para abrir essas janelas para visualização e manipulação durante o experimento. Ligue a iluminação do microscópio clicando no botão Ligar/Desligar e definindo-o para a potência máxima, clicando e arrastando a barra até à direita. Abra a área da amostra e remova o suporte da amostra do estágio do microscópio.Em seguida, adicione a célula de fluxo e prenda-a com os suportes de amostra de metal, garantindo que o deslizamento da tampa esteja no fundo. Depois, adicione 30 microlitros de água RO ao centro da objetiva inferior e reinsira o estágio da amostra. Em seguida, levante a objetiva inferior usando o L2 no controle remoto até que o talão de água toque o deslizamento da tampa.Em seguida, abaixe a objetiva superior até que cerca de metade da distância até a célula de fluxo seja alcançada usando o R2 no controle remoto. Em seguida, adicione 170 microlitros de água RO ao topo da célula de fluxo diretamente sob a objetiva superior e abaixe a objetiva superior até quebrar a tensão superficial da água e formar um menisco. Posteriormente, mova o estágio do microscópio usando a almofada de seta no controle remoto até que a borda da fita adjacente ao canal de fluxo seja alcançada e, em seguida, feche a porta da amostra.Usando a janela objetiva na tela, traga a borda da fita e o foco trazendo a objetiva inferior chamada Laser Objective para cima clicando na seta superior e a objetiva superior clicando na seta inferior usando os controles na tela. Encontre um grânulo flutuante e prenda-o clicando no botão do obturador do trap, que abrirá o obturador e permitirá que o laser de armadilha atinja a amostra. Em seguida, clique no cursor de interceptação na tela e arraste-o para mover a localização do laser de interceptação.Uma vez preso, calibre o talão clicando no botão de calibração. Em seguida, clique em Configurações e digite o diâmetro do talão e a temperatura do palco encontrado no canto inferior esquerdo da janela do software. Em seguida, clique em Trap 1, depois em X Signal e execute o ajuste de frequência de canto clicando em Executar.Em seguida, clique e arraste dentro da janela para otimizar o ajuste da função. Depois, clique em Usá-lo para valores de sensibilidade e rigidez e, em seguida, aceite os valores. Em seguida, feche a janela.Encontre um feixe de actomiosina procurando por contas ligadas a FAs na superfície da folha de cobertura e procurando por ambas as FAs fluorescentes co-localizadas. Ligue a fonte de luz branca e use o cubo de filtro apropriado para obter a imagem de cada filamento de actina girando a torre. Uma vez verificado, prenda o talão preso ao filamento superior do feixe clicando no botão do obturador da armadilha.Em seguida, registre os dados clicando no botão do osciloscópio usando os controles na tela. Para visualizar as medições sem registrar os dados, clique em Iniciar e, em seguida, clique em Salvar automaticamente para salvar todos os dados. Para registrar as medições, clique em Iniciar registro e escolha quais dados devem ser visualizados em tempo real, escolhendo no menu suspenso Sinal X ou Sinal Y.O traço de força dos motores de miosina esquelética gerando força dentro da hierarquia estrutural de actina in vitro construída exibe rampa constante em força até que um platô seja atingido ao longo de dois a cinco minutos. No entanto, observa-se também que alguns feixes de actomiosina que não geram nenhuma força líquida e os traços de força aparecem como ruído de linha de base ou não exibem aumento líquido substancial da força ao longo de 90 segundos devido a uma baixa concentração de motor ou uma orientação paralela desfavorável dos filamentos. Este desenvolvimento de protocolo abrirá o caminho para a construção de ensaios citoesqueléticos in vitro mais complexos que ajudarão ainda mais a modelar tarefas celulares em larga escala, como divisão celular e contração muscular de baixo para cima.

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