Name: probing myosin ensemble mechanics in actin filament bundles using optical tweezers
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00
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Este trabajo es apoyado en parte por la Beca de Investigación del Consejo de Estudiantes Graduados de la Universidad de Mississippi (OA), la Universidad de Mississippi Sally McDonnell-Barksdale Honors College (JCW, JER), el Consorcio de Subvenciones Espaciales de Mississippi bajo el número de subvención NNX15AH78H (JCW, DNR) y la Asociación Americana del Corazón bajo el número de subvención 848586 (DNR).

1. Cubreobjetos de grabado
<ol><li>Disolver 100 g de KOH en 300 ml de etanol al 100% en un vaso de precipitados de 1.000 ml. Revuelva con una barra de agitación hasta que la mayoría del KOH se haya disuelto. PRECAUCIÓN: La solución concentrada de KOH puede causar quemaduras y daños a la ropa. Use guantes, protección para los ojos y una bata de laboratorio.</li>
	<li>Coloque los cubreobjetos individualmente en los bastidores de limpieza de cubreobjetos. NOTA: Los bastidores están diseñados...

Se realizó un estudio in vitro utilizando pinzas ópticas combinadas con imágenes de fluorescencia para investigar la dinámica de los conjuntos de miosina que interactúan con los filamentos de actina. Los haces de actina-miosina-actina se ensamblaron utilizando miosina muscular II, actina rodamina en la parte inferior del haz y en la superficie del cubreobjetos, y filamentos de actina biotinilados marcados con 488 en la parte superior del paquete. La proteína de actina del músculo del conejo se polimerizó...

Las proteínas motoras son esenciales para la vida, convirtiendo la energía química en trabajo mecánico 1,2,3. Los motores de miosina interactúan con los filamentos de actina dando pasos a lo largo de los filamentos similares a una pista, y la dinámica de las redes actina-miosina lleva a cabo la contracción muscular, la motilidad celular, el anillo contráctil durante la citocinesis y el movimiento de la carga dentro de la célula, entre otras tareas esenciales 3,4,5,6,7,8 . Dado que las miosinas tienen tantas funciones esenciales, la falla en la funcionalidad de la red miosina-actina puede conducir al desarrollo de enfermedades, como mutaciones en la cadena pesada de miosina que causan hipercontractilidad cardíaca en la miocardiopatía hipertrófica (MCH)9,10,11,12,13,14 . En la contracción muscular, los motores individuales de miosina cooperan entre sí trabajando como un conjunto para proporcionar la energía mecánica requerida que lleva a cabo el deslizamiento relativo de las FA 4,15,16,17,18. Los motores de miosina forman puentes cruzados entre los AF y utilizan cambios conformacionales debido a su ciclo mecanoquímico para moverse colectivamente hacia el extremo de púas de los filamentos alineados 17,18,19,20,21.
El desarrollo de ensayos cuantitativos de motilidad in vitro a nivel de SM utilizando técnicas como la captura óptica ha facilitado la recopilación de detalles sin precedentes sobre cómo funcionan los motores de miosina individuales, incluida la medición de la generación de fuerza SM y los tamaños de paso 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al. desarrollaron el ensayo de atrapamiento óptico de "tres perlas" o "mancuernas" para sondear la mecánica de generación de fuerza de motores de miosina II23,31. Como la miosina muscular II trabaja en equipos para contraer AF pero no es procesiva a nivel SM, la orientación del ensayo de captura óptica tuvo que reorganizarse a partir del enfoque clásico de perlas ligadas al motor32. Para formar el ensayo de mancuernas, se utilizaron dos trampas ópticas para sostener un AF sobre un motor de miosina unido a un cordón adherido a un cubreobjetos, y la salida de fuerza del motor único se midió a través de los movimientos del AF dentro de la trampa23.
Sin embargo, las fuerzas SM y el uso de una orientación de ensayo de un solo motor / filamento único no dan una imagen completa sobre la generación de fuerza a nivel de sistema, ya que muchas proteínas motoras, incluida la miosina II, no funcionan de forma aislada y, a menudo, no funcionan como una suma de sus partes 15,16,17,32,33,34,35,36 . Son necesarias estructuras más complejas que incluyan más de un motor interactuando con más de un filamento para comprender mejor la sinergia de las redes de filamentos de miosina y actina15,32. La orientación del ensayo con mancuernas se ha explotado para investigar la generación de fuerza de conjuntos pequeños al tener múltiples miosinas unidas a un cordón o usar un filamento grueso de miosina unido a una superficie y permitir que los motores interactúen con el AF suspendido 4,23,34,37,38,39,40.
Otros ensayos de conjunto pequeño incluyen un ensayo de deslizamiento de filamentos in vitro en el que los motores de miosina están recubiertos sobre una superficie de cubreobjetos, y se utiliza un cordón unido a un AF para sondear la fuerza generada por el equipo de motores 4,35,36,38,39,40,41,42,43 . En ambos casos, las miosinas están unidas a una superficie rígida (perla o cubreobjetos) y utilizan un AF. En estos casos, los motores no son capaces de moverse libremente o comunicarse entre sí, ni tener miosinas rígidamente unidas refleja el ambiente jerárquico y compatible en el que los motores trabajarían juntos en el sarcómero32. Estudios previos han sugerido que la miosina II puede detectar su entorno y adaptarse en consecuencia a las cambiantes condiciones de concentración viscoelástica o motora alterando características como la generación de fuerza y la relación de trabajo41,44,45. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar un ensayo de captura óptica que fomente y capture la comunicación motora y el cumplimiento del sistema para pintar una imagen más realista de los fundamentos mecanicistas de la generación de fuerza del conjunto de miosina II.
Aquí, desarrollamos un método para acoplar la estructura jerárquica in vitro con la captura óptica formando haces de actomiosina o sándwiches que consisten en múltiples motores de miosina que interactúan entre dos filamentos de actina. Esta geometría de ensayo modular tiene la capacidad de sondear directamente cómo los factores moleculares y ambientales influyen en la generación de fuerza de miosina en conjunto. Además, la investigación de los mecanismos de generación de fuerza a través de estos conjuntos de actina-miosina tiene el potencial de ayudar a modelar y comprender cómo las tareas celulares a gran escala, como la contracción muscular, se propagan desde el nivel molecular 9,10,13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actin protein (biotin): skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AB07-A</td>
			<td>Biotinylated actin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein, rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99-A</td>
			<td>Actin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Actin stabilizer and Alexa Fluor 488 stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP413-25</td>
			<td>Required for actin assembly and myosin motility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-D-glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>MP218069110</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting Grade Blocker (casein)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Used to block surface from non-specific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>C79500</td>
			<td>Calcium chloride, provides the necessary control over the dynamics of actin myosin network</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>ICN10040280</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12544C</td>
			<td>Used to make flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AC327190010</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td>Regent used for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>34-538-610KU</td>
			<td>Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>Used to etch coverslips and adjust buffer pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td>Used to make flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin II protein: rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MY02</td>
			<td>Full length myosin motor protein isolated from rabbit skeletal muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotracker2</td>
			<td>Bruker/JPK</td>
			<td>NT2</td>
			<td>Optical trapping instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Facilities adhesion of actin filaments onto glass surface of the coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>PHDR1</td>
			<td>Actin stabilizer and rhodamine fluorescent stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads, 1 &#956;m</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-10-5</td>
			<td>Optical trapping handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>PR H5121</td>
			<td>Used for buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing myosin ensemble mechanics in actin filament bundles using optical tweezers

Las miosinas son proteínas motoras que hidrolizan ATP para avanzar a lo largo de las pistas de filamentos de actina (FA) y son esenciales en procesos celulares como la motilidad y la contracción muscular. Para comprender sus mecanismos de generación de fuerza, la miosina II se ha investigado tanto a nivel de molécula única (SM) como como equipos de motores in vitro utilizando métodos biofísicos como el atrapamiento óptico.
Estos estudios mostraron que el comportamiento generador de fuerza de miosina puede diferir mucho cuando se mueve desde el nivel de una sola molécula en una disposición de tres perlas a grupos de motores que trabajan juntos en una superficie rígida de talón o cubreobjetos en una disposición de deslizamiento. Sin embargo, estas construcciones de ensayo no permiten evaluar la dinámica de grupo de la miosina dentro de la jerarquía estructural viscoelástica como lo harían dentro de una célula. Hemos desarrollado un método que utiliza pinzas ópticas para investigar la mecánica de la generación de fuerza por conjuntos de miosina que interactúan con múltiples filamentos de actina.
Estos paquetes de actomiosina facilitan la investigación en un entorno jerárquico y compatible que captura la comunicación motora y la salida de fuerza del conjunto. La naturaleza personalizable del ensayo permite alterar las condiciones experimentales para comprender cómo las modificaciones al conjunto de miosina, el haz de filamentos de actina o el entorno circundante dan como resultado diferentes salidas de fuerza.

Las células de flujo que contienen los sistemas de haz de actomiosina son de un diseño estándar, que consiste en un portaobjetos de microscopio y un cubreobjetos grabados separados por un canal hecho de cinta adhesiva de doble cara (Figura 1). Luego, el ensayo se construye desde el cubreobjetos utilizando introducciones escalonadas como se describe en el protocolo. El ensayo final consiste en filamentos de actina marcados con rodamina plantilla; la concentración de miosina deseada (se ut...

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Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

Se presenta y discute la formación de haces de actomiosina in vitro y la medición de la generación de fuerza del conjunto de miosina utilizando pinzas ópticas.

Sondeo de la mecánica del conjunto de miosina en haces de filamentos de actina utilizando pinzas ópticas

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle ...

La investigación del comportamiento de la actina utilizando este protocolo es importante porque permite al usuario sondear la dinámica del conjunto de proteínas motoras utilizando la precisión del atrapamiento óptico. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de medir la mecánica de la miosina dentro de la jerarquía estructural de actina, a diferencia de la orientación tradicional de un solo filamento de un solo motor utilizada en muchos experimentos de captura óptica. Otra ventaja de este protocolo es su naturaleza modular, que permite al usuario personalizar el ensayo al sistema de citoesqueleto jerárquico de su elección.Para comenzar, aplique dos piezas de cinta adhesiva de doble cara en el centro de un portaobjetos de microscopio a tres o cuatro milímetros de distancia entre sí. Luego rasgue o corte el exceso de cinta que cuelga del borde de la diapositiva. A continuación, agregue el deslizamiento de la cubierta recubierto con PLL en la parte superior de la cinta perpendicular al eje largo del portaobjetos del microscopio para formar un canal.Usando un pequeño tubo para comprimir el deslizamiento de la cubierta sobre la cinta y el microscopio, deslice completamente hasta que la cinta sea transparente, asegurándose de que no haya burbujas en la cinta, ya que esto puede causar fugas del canal de flujo. Agregue 15 microlitros de actina rodamina diluida a la celda de flujo PLL y absorba el exceso de solución a través de la celda de flujo, pero no permita que el canal de flujo se seque. Luego, incubar durante 10 minutos en una cámara de humedad.A continuación, prepare una solución de caseína de un miligramo por mililitro en tampón de polimerización de actina y agregue 15 microlitros de la solución para evitar la unión no específica de los componentes posteriores. Luego, incubar durante cinco minutos en una cámara de humedad. Después, agregue la concentración deseada de miosina a la suspensión de actina y perlas biotiniladas preparadas y revuelva suavemente con la punta de una pipeta.Luego, agregue inmediatamente 15 microlitros de la suspensión junto con la concentración de miosina deseada a la celda de flujo e incube durante 20 minutos. A continuación, selle los extremos abiertos de la celda de flujo con esmalte de uñas para evitar la evaporación durante los experimentos de captura óptica y de imágenes. Una vez que el sistema esté listo, encienda el láser usando el botón de encendido del láser en la esquina inferior izquierda de la pantalla a 50 milivatios y deje que se estabilice durante 30 minutos.Haga clic secuencialmente en los botones de iluminación, cámara, objetivo y movimiento del escenario dentro del software para abrir esas ventanas para ver y manipular durante el experimento. Encienda la iluminación del microscopio haciendo clic en el botón de encendido / apagado y ajustándola a la máxima potencia haciendo clic y arrastrando la barra hasta la derecha. Abra el área de muestra y retire el portamuestras de la etapa del microscopio.Luego agregue la celda de flujo y asegúrela con los soportes de muestras de metal, asegurándose de que el deslizamiento de la cubierta esté en la parte inferior. Luego, agregue 30 microlitros de agua RO al centro del objetivo inferior y vuelva a insertar la etapa de muestra. Luego levante el objetivo inferior usando el L2 en el control remoto hasta que la cuenta de agua toque el deslizamiento de la cubierta.A continuación, baje el objetivo superior hasta que se alcance aproximadamente la mitad de la distancia a la celda de flujo utilizando el R2 en el control remoto. Luego, agregue 170 microlitros de agua RO a la parte superior de la celda de flujo directamente debajo del objetivo superior y baje el objetivo superior hasta que rompa la tensión superficial del agua y forme un menisco. Posteriormente, mueva la etapa del microscopio con la almohadilla de flecha del control remoto hasta que se alcance el borde de la cinta adyacente al canal de flujo y, a continuación, cierre la puerta de la muestra.Usando la ventana de objetivo en la pantalla, traiga el borde de la cinta y enfoque levantando el objetivo inferior llamado Objetivo láser haciendo clic en la flecha superior y el objetivo superior haciendo clic en la flecha inferior usando los controles en pantalla. Encuentre una cuenta flotante y trampérela haciendo clic en el botón del obturador de la trampa, que abrirá el obturador y permitirá que el láser de captura golpee la muestra. Luego, haga clic en el cursor de captura en la pantalla y arrástrelo para mover la ubicación del láser de captura.Una vez atrapado, calibre el talón haciendo clic en el botón de calibración. Luego, haga clic en Configuración y escriba el diámetro de la cuenta y la temperatura del escenario que se encuentra en la parte inferior izquierda de la ventana del software. A continuación, haga clic en Trap 1, luego en X Signal y realice el ajuste de frecuencia de esquina haciendo clic en Run.Luego haga clic y arrastre dentro de la ventana para optimizar el ajuste de la función. Luego, haga clic en Usarlo para valores de sensibilidad y rigidez y luego acepte los valores. A continuación, cierre la ventana.Encuentre un paquete de actomiosina buscando perlas unidas a AF en la superficie de la cubierta y buscando ambos AF fluorescentes colocalizados. Encienda la fuente de luz blanca y use el cubo de filtro apropiado para obtener imágenes de cada filamento de actina girando la torreta. Una vez verificado, atrape la cuenta unida al filamento superior del paquete haciendo clic en el botón del obturador de la trampa.Luego, registre los datos haciendo clic en el botón del osciloscopio usando los controles en pantalla. Para visualizar las mediciones sin registrar los datos, haga clic en Inicio y luego haga clic en Autoguardar para guardar todos los datos. Para registrar mediciones, haga clic en Iniciar registro y elija qué datos se visualizarán en tiempo real eligiendo en el menú desplegable Señal X o Señal Y.La traza de fuerza de los motores de miosina esquelética que generan fuerza dentro de la jerarquía estructural de actina in vitro construida exhibe una rampa constante en la fuerza hasta que se alcanza una meseta durante dos a cinco minutos. Sin embargo, también se observa que algunos haces de actomiosina que no generan ninguna fuerza neta y las trazas de fuerza aparecen como ruido de referencia o no exhiben un aumento neto sustancial de la fuerza durante 90 segundos debido a una baja concentración del motor o una orientación paralela desfavorable de los filamentos. Este desarrollo del protocolo allanará el camino hacia la construcción de ensayos citoesqueléticos in vitro más complejos que ayudarán aún más a modelar tareas celulares a gran escala, como la división celular y la contracción muscular de abajo hacia arriba.

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