Name: a model for epilepsy of infectious etiology using theiler's murine encephalomyelitis virus
Uploaded: 2022-06-23T12:40:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Model for Epilepsy of Infectious Etiology using Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus at JoVE.com

SBは、FUベルリンの開始助成金によってサポートされています。KSWはR37 NS065434とALSAM財団によってサポートされています。ラボは、D-SPANアワード1F99NS125773-01によってサポートされています。Theilerウイルスと顕微鏡サポートのためのユタ大学細胞イメージングコア施設を提供してくれたRobert Fujinami博士に感謝します。

記載されているすべての手順は、それぞれの当局によって承認されました。動物は、「実験動物の世話と使用のためのガイド」(国立研究評議会)の推奨事項に従って、公衆衛生サービスの方針とユタ大学の施設動物管理および使用委員会、動物プロトコル(番号:21-11009、薬理学および毒物学部)およびベルリン自由大学(プロトコル:G0015 / 21、 LAGeSoベルリン、薬理学および毒物学研究所)、それぞれ。図 3 および 図5 に示す結果は、33.9-42502-04-11/0516および33.9-42502-04-15/1892(LAVES Oldenburg、ハノーバー獣医大学薬理学、毒物学、および薬学部)の下で承認されました。
1.研究を設計するための考慮事項と準備
<ol><li>ウイルス<ol><li>TMEVのダニエル株は、ユタ大学のロバート・フジナミによって親切に提供されました。もともとは、ハーバードコロニー20のマウスから単離された。TMEVを取り扱う前に、各国の生物製剤の具体的な分類や規制を調べ、機関のバイオセーフティ担当者と協議して、規制の遵守を確保してください。典型的には、TMEVは、株および遺伝子組み換えに応じてBSL2として分類される。大多数の動物において発作を誘発するのに必要な標準用量は、3 x 105 プラーク形成単位(PFU)である。 注:トランスジェニックマウスを使用する場合など、用量を調整する必要があるかもしれません。全体として、2 x 104 PFUと2.44 x 107 PFUの間の力価は、発作をうまく誘発するために使用されています。対照動物は無菌PBSを受け、発作を経験しない。ウイルスは人間に感染しません。ただし、実験者は常にPPE(白衣、手袋、安全メガネ)を着用し、マウスの死骸と寝具は廃棄する前にオートクレーブ滅菌する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>動物<ol><li>発作の誘発と調査には、他のマウス系統、例えばSJL/J、FVB/N、またはBalb/cマウス5など、必ずしも発作を示さないため、B6Jマウスを使用してください。急性発作頻度5において雌マウスと雄マウスの間に差はない。青年期から成体マウス(5〜6週齢から開始)で実験を行う。</li>
	</ol></li>
	<li>ダイエット<ol><li>食事療法は、疾患の重症度の実験室間の変動性の1つの原因として決定されています。したがって、食事をバリエーション22の潜在的な要因と見なしてください。</li>
	</ol></li>
	<li>グループサイズ<ol><li>このモデルではすべての動物が急性または慢性の発作を発症するわけではないため、複合試験には約20匹のマウス/グループを使用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>動物福祉<ol><li>いずれかのマウスが治験化合物の感染または投与による重大な副作用を示す場合(例:.、嗜眠、身だしなみ不良、過度の発赤、および創傷からの化膿性分泌物)地域のIACUCガイドラインによって決定された観察時間(例:.、48時間)、マウスを人道的に安楽死させます。.</li>
		<li>感染期間中に極端な体重減少(>20%)を示すマウスを人道的に安楽死させます。.</li>
		<li>動物が適切に食べない場合は、小児用電解質溶液などで湿らせた補助ペレットへのアクセスを与えてください。</li>
	</ol></li>
</ol>2.ウイルス接種
<ol><li>注射器の滅菌<ol><li>インスリン注射器のキャップを取り外します。針の周りのカラーとしてポリエチレンチューブを追加して、2.5mmの適切な注入深さを確保します。シリンジをエタノールに30分間浸します。シリンジをUV光の下に30分間置きます。</li>
		<li>キャップを針に戻します。シリンジを滅菌ポーチで包み、テープで閉じます。準備日をラベル付けします。</li>
	</ol></li>
	<li>ウイルスインジェクション<ol><li>ダニエルのTMEV株のアリコートを-80°Cの冷凍庫から取得します。ウイルスを解凍し、氷の上に保管します。ウイルスの解凍と再凍結は避けてください。シリンジにウイルス懸濁液(20 μLのPBSまたはDMEM培養培地で希釈した3 x 105 PFU)をロードします。 注意:このウイルスはマウスに感染しますが、人間には感染しません。</li>
		<li>消毒剤でベンチを掃除し、ヒュームアブソーバーの下で作業します。ウイルス接種は無菌ではありませんが、可能な限り清潔です。</li>
		<li>マウスを麻酔導入チャンバーに移し、酸素中の2%イソフルランを使用して麻酔を誘発します。外科的耐性に達するには数分かかります。動物の呼吸と麻酔の深さに基づいて濃度を調整します。</li>
		<li>麻酔をかけたマウスをフードの下の麻酔ボックスから移します。つま先のつまみなどによる外科的耐性を確認します。手順全体が30秒未満で行われるため、動物は注射中にイソフルランを吸入する必要はありません。角膜の乾燥を防ぐために目の軟膏を追加します。</li>
		<li>アルコールパッドで動物の頭をきれいにします。マウスの頭を少し左に傾けて、注射部位が上を向くようにします。</li>
		<li>皮膚を少し後方に引っ張り、針を頭に挿入し、右半球の側頭領域(右眼の後方と内側)に2.5mmの深さまで皮質内に20μLを注入します。</li>
		<li>すべての動物で同じ半球で一方的に注射を行います。頭頂皮質の位置の目印として目と耳を使用します。配置は以前に組織学的に検証されています。 図1を参照してください。ブレグマに対する定位固定装置注射による注射座標は−2.0(AP)である。+3.0 (ミリリットル);−1.5 (DV)</li>
		<li>シリンジを5〜15秒間そのままにします。注射による漏れがある場合、または気泡が見られる場合は書き留めてください-その場合は、新しい注射器を準備します。シリンジを慎重に引き抜くときは、少し回転させます。麻酔下での乾燥を防ぐために目の軟膏を塗ります。</li>
		<li>オプション:地域の手順に応じて、尾または耳に動物をコーディングします(オプションですが、動物は無意識であるため簡単です)。</li>
		<li>動物を新しいケージに移し、麻酔からの回復中に加熱パッド(35〜40°C)を半オン/半オフします。動物が胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。. 注:動物は回復後に再びグループ収容することができます(感染した動物は模擬感染した動物と混合されません)。感染したマウスは、非感染マウスと同じ部屋に収容すべきではありません。</li>
		<li>マウスは感染後に体重が減り、追加の給餌が必要になる可能性があるため、最初の7日間のマウスの体重を追跡します。</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63673/63673fig01.jpg"> 図1:TMEV注入手順の概略図。 左から右へ:右頭頂皮質注射の場合、針は目と反対側の耳の間の想像線のわずかに外側に注入されます。深度制御用のカラーは黄色で示されています。注射管は、矢印でマークされた冠状脳の断面に見ることができます。注入部位は、矢印の上に与えられた座標に対応する。右の画像は、海馬層のCA1内のタイラーウイルス(バイオレット)の分布を示しています。図は biorender.com を使用して作成されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63673/63673fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
3.複合試験
<ol><li>コンパウンド調製<ol><li>処方手順を確認してください。推奨事項または提供された指示に従って車両ソリューションを準備します。一例として、抗てんかん薬レベチラセタム(LEV)の手順が提示される。LEVは、350 mg / kgの用量で発作の負担を車両レベルの30%〜40%に軽減します。この研究で使用されたビヒクルは0.5%メチルセルロースです。</li>
		<li>化合物に応じて用量を計算します。計算に従って薬の重さを量ります。1 kgのマウスを治療するために、350 mgのLEVを体重測定します。</li>
		<li>製剤指示書の指示に従って、適切な量のビヒクル溶液(例えば、超音波処理、ビヒクル賦形剤など)を用いてストック溶液を調製する。マウスの注射量が0.01 mL / gであることを考慮すると、1 kgの注射量は350 mgのLEVで10 mLになり、35 mg / mLの溶液が得られます19。計算と用量をmg / kgで、容量をmLで報告してください。 注:例示的なプロトコルは、 補足資料1の2ページにあります。</li>
	</ol></li>
	<li>化合物投与<ol><li>ケージを車両またはコンパウンドグループにランダム化します。てんかん発症のメカニズムに関する研究や検証目的で模擬感染マウスを使用しますが、定期的な薬物スクリーニングには使用しないでください。</li>
		<li>温度、湿度、時刻などの環境条件を報告します。</li>
		<li>コンパウンドとビヒクル溶液で溶液をボルテックスします。シリンジ内のビヒクルまたはコンパウンドを吸引し、シリンジを色分けして取り違えを防ぎます。</li>
		<li>動物の体重を量ります。B6Jマウスが3日目に18 g>であることを確認してください pi (丸めなし)。体重を報告してください。</li>
		<li>化合物を投与する(例えば、腹腔内注射または他の適切な経路によって)。投与の時間とルートを書きます。</li>
		<li>化合物投与後、特に最初の注射後の行動の変化について動物を監視します。.発作が発生した場合は、ラシーンスケール23に従って発作強度を報告します。ステップ 3.2 を参照してください。 注:化合物投与の例示的なプロトコルは補足資料1の3ページにあり、投与中に観察された発作は補足資料1の4〜5ページに記録されます。</li>
	</ol></li>
	<li>取り扱い誘発発作の発作モニタリング<ol><li>この手順は、治療を知らされていない実験者が実行してください。すべてのケージをベンチに持ってきます。明期に毎日2回発作がないか動物を観察します。</li>
		<li>修正されたラシーンスケールで発作活動をスコアリングします23:0 =行動の変化なし、1 =口と顔の動き、2 =頭のうなずき、3 =片側前肢クローヌス、4 =飼育を伴う両側前肢クローヌス、5 =姿勢の緊張の喪失を伴う全身性強直間代性活動、時にはジャンプ、6 =長期にわたる過度のジャンプと多動。発作の数と強度を報告します。</li>
		<li>ケージ上でペンをスライドさせて音を立てます。</li>
		<li>各動物を別の箱に移して戻します。</li>
		<li>ケージを前後にゆっくりと振って、ケージの側面や上部に動物がぶつかって怪我をする危険があるほど激しくケージを振らないように注意してください。</li>
		<li>ケージ内のすべての動物の発作を監視します。いつでも、マウスに発作がある場合は、それをホームケージに戻し、ノイズや取り扱いによる発作刺激なしに発作のレベルを書き留めます。</li>
		<li>自発的に、またはケージを穏やかに振った後につかまっていない動物の場合、より激しい取り扱いによって発作を引き起こします:マウスの尾を左から右にひっくり返して慎重に裏返します。 注:発作のある動物は興奮過敏であり、びくびくする可能性があります。</li>
		<li>発作行動について各動物をもう一度観察します。後続のケージについてもこのプロセスを繰り返します。 注:発作モニタリングの例示的なプロトコルは、 補足資料1、6〜7ページにあります。</li>
	</ol></li>
	<li>複合効果に関するデータレポート<ol><li>反復測定(RM)ANOVAを使用して毎日の体重を分析します。</li>
		<li>毎日の累積発作負荷値を使用して、データをグラフィカルに表示します。有効性データ(ラシーンステージ3〜5発作のない動物の数)を、保護された数/それぞれのグループでテストされた数(通常N = 20)として提示します。.したがって、フィッシャーの正確確率検定を使用して、反応(押収または非押収)について、車両で治療されたグループと薬物で処理されたグループ間のデータを比較します。 注:ステージ2以下の発作があり、保護されていない動物がステージ3〜5の発作を起こしている場合、動物は発作から「保護されている」と見なされます。</li>
		<li>同様に、行動障害または毒性作用のある動物の数/各グループでテストされた数と同様に忍容性データを分析します。.死亡を含む悪影響に注意してください。</li>
		<li>ビヒクルを注射したマウスの50%未満が急性につかむ場合は、データを考慮しないでください。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Getts, D. R., Balcar, V. J., Matsumoto, I., M&#252;ller, M., King, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+and+the+immune+system:+their+roles+in+seizure+cascade+development.">Viruses and the immune system: their roles in seizure cascade development.</a> Journal of Neurochemistry. 104 (5), 1167-1176 (2008).</li><li>Libbey, J. E., Fujinami, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotropic+viral+infections+leading+to+epilepsy:+Focus+on+Theiler's+murine+encephalomyelitis+virus.">Neurotropic viral infections leading to epilepsy: Focus on Theiler's murine encephalomyelitis virus.</a> Future Virology. 6 (11), 1339-1350 (2011).</li><li>Vezzani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections,+inflammation+and+epilepsy.">Infections, inflammation and epilepsy.</a> Acta Neuropathologica. 131 (2), 211-234 (2016).</li><li>Misra, U. K., Tan, C. T., Kalita, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+encephalitis+and+epilepsy.">Viral encephalitis and epilepsy.</a> Epilepsia. 49, 13-18 (2008).</li><li>Libbey, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seizures+following+picornavirus+infection).">Seizures following picornavirus infection).</a> Epilepsia. 49 (6), 1066-1074 (2008).</li><li>Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+postinfection+epilepsy+after+Theiler's+virus+infection+of+C57BL/6+mice.">Development of postinfection epilepsy after Theiler's virus infection of C57BL/6 mice.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (12), 1210-1219 (2010).</li><li>Stewart, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+zebrafish+models+of+epilepsy:+What,+how+and+where+next.">Perspectives of zebrafish models of epilepsy: What, how and where next.</a> Brain Research Bulletin. 87 (2-3), 135-143 (2012).</li><li>Br&#246;er, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+inflammation,+neurodegeneration+and+seizure+development+following+picornavirus+infection+markedly+differ+among+virus+and+mouse+strains+and+substrains.">Brain inflammation, neurodegeneration and seizure development following picornavirus infection markedly differ among virus and mouse strains and substrains.</a> Experimental Neurology. 279, 57-74 (2016).</li><li>Br&#246;er, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+mouse+models+of+multiple+sclerosis+and+epilepsy:+Marked+differences+in+neuropathogenesis+following+infection+with+two+naturally+occurring+variants+of+Theiler's+virus+BeAn+strain.">Viral mouse models of multiple sclerosis and epilepsy: Marked differences in neuropathogenesis following infection with two naturally occurring variants of Theiler's virus BeAn strain.</a> Neurobiology of Disease. 99, 121-132 (2017).</li><li>Loewen, J. L., Barker-Haliski, M. L., Dahle, E. J., White, H. S., Wilcox, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Injury,+gliosis,+and+glial+proliferation+in+two+models+of+temporal+lobe+epilepsy.">Neuronal Injury, gliosis, and glial proliferation in two models of temporal lobe epilepsy.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 75 (4), 366-378 (2016).</li><li>Bell, L. A., Wallis, G. J., Wilcox, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivity+and+increased+proliferation+of+NG2+cells+following+central+nervous+system+infection+with+Theiler's+murine+encephalomyelitis+virus.">Reactivity and increased proliferation of NG2 cells following central nervous system infection with Theiler's murine encephalomyelitis virus.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 369 (2020).</li><li>Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theiler's+virus+infection+chronically+alters+seizure+susceptibility.">Theiler's virus infection chronically alters seizure susceptibility.</a> Epilepsia. 51 (8), 1418-1428 (2010).</li><li>Buenz, E. J., Rodriguez, M., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+spatial+memory+is+a+consequence+of+picornavirus+infection.">Disrupted spatial memory is a consequence of picornavirus infection.</a> Neurobiology of Disease. 24 (2), 266-273 (2006).</li><li>Tramoni-Negre, E., Lambert, I., Bartolomei, F., Felician, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+memory+deficits+in+temporal+lobe+epilepsy.">Long-term memory deficits in temporal lobe epilepsy.</a> Revue Neurologique. 173 (7-8), 490-497 (2017).</li><li>Ponds, R. W., Hendriks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+rehabilitation+of+memory+problems+in+patients+with+epilepsy.">Cognitive rehabilitation of memory problems in patients with epilepsy.</a> Seizure. 15 (4), 267-273 (2006).</li><li>Sloviter, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+status+epilepticus+in+animals:+What+are+we+modeling.">Experimental status epilepticus in animals: What are we modeling.</a> Epilepsia. 12, 11-13 (2009).</li><li>L&#246;scher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+seizures+and+epilepsy:+Past,+present,+and+future+role+for+the+discovery+of+antiseizure+drugs.">Animal models of seizures and epilepsy: Past, present, and future role for the discovery of antiseizure drugs.</a> Neurochemical Research. 42 (7), 1873-1888 (2017).</li><li>Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+National+Institute+of+Neurological+Disorders+and+Stroke+(NINDS)+Epilepsy+Therapy+Screening+Program+(ETSP).">The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP).</a> Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).</li><li>Metcalf, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+prototype+antiseizure+and+anti-inflammatory+compounds+in+the+Theiler's+murine+encephalomyelitis+virus+model+of+epilepsy.">Screening of prototype antiseizure and anti-inflammatory compounds in the Theiler's murine encephalomyelitis virus model of epilepsy.</a> Epilepsia Open. 7 (1), 46-58 (2021).</li><li>Daniels, J. B., Pappenheimer, A. M., Richardson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+encephalomyelitis+of+mice+(DA+strain).">Observations on encephalomyelitis of mice (DA strain).</a> Journal of Experimental Medicine. 96 (6), 517-530 (1952).</li><li>K&#228;ufer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptors+CCR2+and+CX3CR1+regulate+viral+encephalitis-induced+hippocampal+damage+but+not+seizures.">Chemokine receptors CCR2 and CX3CR1 regulate viral encephalitis-induced hippocampal damage but not seizures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8929-8938 (2018).</li><li>Libbey, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+diet+on+the+severity+of+central+nervous+system+disease:+One+part+of+lab-to-lab+variability.">The effects of diet on the severity of central nervous system disease: One part of lab-to-lab variability.</a> Nutrition. 32 (7-8), 877-883 (2016).</li><li>Racine, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+seizure+activity+by+electrical+stimulation.+II.+Motor+seizure.">Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure.</a> Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).</li><li>Kim, J. E., Cho, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pilocarpine+model+of+temporal+lobe+epilepsy+and+EEG+monitoring+using+radiotelemetry+system+in+mice.">The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy and EEG monitoring using radiotelemetry system in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Tu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-floating+immunostaining+of+mouse+brains.">Free-floating immunostaining of mouse brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).</li></ol>

著者は、競合する経済的利益はないと宣言しています。

これは、急性および慢性発作の発症の調査を可能にするてんかんの最初の感染ベースのげっ歯類モデルです。これは、てんかんの最も一般的な病因の1つに対する疾患の予防または修飾のための薬物標的および新規化合物を特定するのに役立ちます。
上述のように、TMEV処置マウスの適切な割合が取り扱い誘発性発作を示すことを確実にするために、バッチおよびウイルス力価の慎重な検討が必要であり得る。動物の発作が通常よりも少ない場合は、N = 20匹のバッチを使用してウイルス効率を検証します。その活性が低下した場合(50%未満)、新しいアリコートを作り、N = 20匹の動物でそれらをテストします。新しいアリコートがより効率的でない場合は、ウイルスの新しいバッチを精製する必要があります。一部のトランスジェニックマウス株では、より低いウイルス力価を使用する必要があるかもしれません。したがって、ウイルス力価は予備実験後に必要に応じて希釈する必要があります。B6マウスで入手可能なほとんどのデータは、ジャクソン研究所(米国メイン州バーハーバーまたはドイツ、スルツフェルドのチャールズリバー)からのものです。しかし、ハーラン(アイストラップ、ドイツ)から得られたB6マウスでも同様の発作率が確認されています8。B6バックグラウンドを有するトランスジェニック動物の発作率は野生型B6マウスに匹敵するが、遺伝的変化がウイルス侵入、炎症反応、または神経変性に影響を与える場合は異なる可能性がある21。急性発作は自発的に観察されますが、取り扱いと騒音によって引き起こされるため、発作率を比較する場合は、すべての動物を同様の方法で扱うことが最も重要です。1日2回の取り扱いセッションでは、以前は発作の負担が高く、感染後3〜7日目に発作を示すマウスの割合が高くなっています6,8,19。発作の負担を増やすために、追加の処理セッション(1日目と2日目)も採用される場合があります。さらに、動物を各取り扱いセッションの前に観察して、自発発作が発生していないことを確認することができます。たとえば、騒々しい実験室環境では発作が発生する可能性があり、その結果、テスト時間中に動物が取り扱いによって引き起こされる発作に抵抗する可能性があります。
TMEV感染は大多数のマウスで取り扱い誘発性発作を引き起こしますが、一部の動物がこの治療に耐性がある理由は不明です。上記のように、電図発作(関連する行動が最小限またはまったくない)が発生し、付随するEEG記録なしでは通常定量化されない可能性があります。また、注射場所のわずかな違いが脳内のウイルス効果の低下を促進する可能性もあります。しかし、海馬へのウイルスの向性のために、皮質および線条体感染5,6,8,9の後に発作が報告されています。このモデルにおける薬物スクリーニング研究のために、発作の減少(例えば、発作負担の50%減少)を同定するために、各群に対してより多くの動物が必要とされる(例えば、N=20)。さらに、このモデルにおける発作行動の変動性は、有意な発作の減少を特定するために、薬物対ビヒクル効果のより大きな差を必要とする。したがって、このモデルの1つの制限は、より大きなグループサイズの要件です。それにもかかわらず、十分なグループサイズはまた、このモデルにおける抗てんかんおよび抗炎症効果の同定を可能にする19。
このモデルで観察可能な発作の大部分は、急性感染期間中に発生します。TMEVで治療されたマウスで観察された海馬変性、免疫細胞の活性化、および認知障害の発生にもかかわらず、治療された動物のごく一部だけが最終的に慢性の自然発作を発症します。この全体的な発作負荷が低いため、このモデルで自然発作を適切に研究するには、多数の感染したマウスが必要であり、これは多くのプロジェクトの範囲と能力を超えています。深層電極移植や脳波モニタリングも実験動物の負担を増大させる。深部電極は自発発作活動の特定に役立つ可能性がありますが、感染後の海馬の解剖学的構造の変化により、一貫した電極配置が困難になる可能性があります。
てんかんの新しい治療法を特定することが急務であるため、抗てんかん効果の迅速なスクリーニング方法として使用できるモデルの開発が必要です。このモデルは、この緊急の要求に対処する機能を提供します。さらに、定位手術を必要としないという事実は、抗けいれん化合物の研究に適した、実行しやすいモデルになります。

ウイルス性脳炎の頻繁な結果の1つはてんかん発作です。多くのウイルス感染は、感染の急性期に症候性発作を引き起こします。このような発作のリスクは、一般の人々の間で20%以上増加します1,2,3。感染を生き延びた患者は、感染後数ヶ月から数年で慢性てんかんを発症するリスクが4%〜20%増加します1,4。Theilerのマウス脳脊髄炎ウイルス(TMEV)は、ウイルス性脳炎のマウスモデルにおける急性および慢性発作を研究するのに適したウイルスとして同定されています5,6,7。TMEVは、ピコルナウイルス科の非エンベロープ、ポジティブセンス、一本鎖RNAウイルスであり、伝統的にSJLマウスの脊髄の脱髄を研究するために使用されてきましたが、C57BL/6(B6)マウスは感染後迅速にウイルスを除去する能力があるため保護されています。しかし、TMEVは、感染後最初の週(pi)以内に雄および雌のB6マウスの50%〜75%に急性発作を誘発し、約25%〜40%が慢性てんかんを発症します 週から数ヶ月π2,5,6,8,9。発作とは別に、マウスは神経変性および神経膠症を伴うてんかん海馬の一般的な組織病理学も示します5、6、8、10、11、12。さらに、TMEVに感染したB6マウスは、学習と記憶のための行動テストで有意に悪いパフォーマンスを示し、てんかんの臨床患者にも見られる認知併存疾患を持っています13、14、15。
伝統的に、てんかんおよび発作のモデルは、発作を誘発するために化学痙攣物質の適用または電気刺激のいずれかを利用する。しかし、これらのモデルは構成概念の妥当性を欠いており、臨床患者に見られるよりも重度の発作と脳損傷を示すことがよくあります16。すべての研究質問17に適したモデルはありません。TMEVモデルの使用は、CNSの感染後の発作発症の素因が研究されている場合、または化合物が抗てんかん効率についてスクリーニングされる場合に特に興味深いものです。
TMEVモデルが確立され、国際的にいくつかの異なる研究所で使用されているため、著者らは、モデルの実装を成功させるための多くの詳細、たとえば、さまざまなウイルスおよびマウス系統の特異性を特定しました。最も信頼性の高い発作誘導は、ダニエル株のTMEVおよびB6Jマウス2、5、6、8、9を用いて生じた。このモデルは現在、国立神経障害・脳卒中研究所(NINDS)によって、てんかんおよび発作に対する新薬を特定するためのプラットフォームとして使用されています18,19。この論文には、ウイルス誘導と臨床モニタリングの詳細なプロトコルが含まれており、他の研究者がこのウイルス性脳炎のモデルを利用して、疾患メカニズムの理解を深めたり、薬物検査を行ったりすることができます。
次のプロトコルは、このモデルの複合試験用に設計された研究を反映していますが、他の多くのタイプの研究を実行することができます。マウスは、右半球の側頭領域(右眼の後部および内側)にダニエル株のTMEVを注射する前に短時間麻酔されます。研究の質問に応じて、非感染対照動物が必要な場合、マウスはTMEVの代わりに滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4、KH 2 PO 4 [1.06 mM]、NaCl [155.17 mM]、およびNa 2 HPO4·7H 2 O [2.97mM]を含む)を受け取ります。TMEV感染マウスでの以前の経験では、取り扱い誘発性発作は感染後3日目から7日目の間に発生することが示されています。実験化合物の注入頻度、経路、および試験時間は、それらの特性によって異なります。金曜日にウイルス接種を行うことが推奨されており、これにより、3〜7日目の発作モニタリングが翌週の月曜日から金曜日に行われます。発作モニタリング週の間、実験化合物は、化合物の動態または作用機序によって特に示唆されない限り、1日2回(少なくとも4時間間隔)投与することができる。治療中の発作モニタリングは、予め決定された時点で行うことができる。注入および観察時間は、個々の化合物によって異なります。動物に試験化合物または薬物化合物の代わりにビヒクルを注射する。これら2つのグループは、実験グループと同様に取り扱いおよび観察することができる。実験中、マウスを扱い、発作をスコアリングする1人は、治療を知らされないはずです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent paper</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>any</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.)</td>
			<td>30216542</td>
			<td>0. 1 mg&#8211;220 g&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal balance</td>
			<td>Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.)</td>
			<td>STX2202</td>
			<td>0.01 g&#8211;2200 g&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes</td>
			<td>BD (Mississauga, ON, Canada)&#160;</td>
			<td>BD329461</td>
			<td>Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle - 1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daniel&#39;s strain of TMEV</td>
			<td>kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah)</td>
			<td>-</td>
			<td>3 x 105 plaque-forming units aliquot(s)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super</td>
			<td>Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.)</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso</td>
			<td>VETone (Boise, ID, U.S.A)</td>
			<td>502017</td>
			<td>Isoflurane 250 mL, 2%&#8211;5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume absorber&#160;</td>
			<td>Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Protection Disposable SMS White Lab Coats&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.)</td>
			<td>17-100-810A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 9&#160;</td>
			<td>(La Jolla, CA, U.S.A.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>any</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel Microsoft&#160;</td>
			<td>(Redmond, WA, U.S.A.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Word Microsoft&#160;</td>
			<td>(Redmond, WA, U.S.A.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse cage</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>any mouse cage holding at least 5 mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide needles&#160;</td>
			<td>BD (Mississauga, ON, Canada)</td>
			<td>329652</td>
			<td>BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes - 26 G x 3/8 - 0.45 mm x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-Sealing Sterilizing Pouch&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.)</td>
			<td>NC9241087&#160;</td>
			<td>12.6 x 25.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small glass flask</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>any, volume 25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.)</td>
			<td>10010056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; CO. KG</td>
			<td>X171.1</td>
			<td>size according to volume of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; CO. KG</td>
			<td>AAN2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Luer-Lok</td>
			<td>BD (Mississauga, ON, Canada)</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL syringe only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer</td>
			<td>Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.)</td>
			<td>EW-08895-23</td>
			<td>Bath sonicator - 0.5 gal, 115 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vehicle solution</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>depending on compound vehicle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex REAX&#160;</td>
			<td>Heidolph Instruments GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td>541-10000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a model for epilepsy of infectious etiology using theiler's murine encephalomyelitis virus

てんかんの主な原因の1つは中枢神経系(CNS)の感染です。このような感染を生き延びた患者の約8%が結果としててんかんを発症し、経済的に発展していない国ではその割合が有意に高くなります。この研究は、感染病因のてんかんのモデリングの概要を提供し、それを新しい抗てんかん化合物検査のプラットフォームとして使用する。C57BL / 6マウスにおけるTheilerのマウス脳脊髄炎ウイルス(TMEV)の非定位脳内注射によるてんかん誘導のプロトコルが提示され、ウイルス性脳炎の初期および慢性の臨床症状の多くを再現します そしてその後のてんかん ヒト患者。発作活動を監視し、新規化合物の潜在的な抗てんかん効果を検出するための脳炎中のマウスの臨床評価が記載されている。さらに、ウイルス性脳炎および海馬損傷および神経炎症などの発作の組織病理学的結果、ならびに自然てんかん発作などの長期的結果も示されている。TMEVモデルは、CNS感染の結果としてのてんかん発症のメカニズムの調査を可能にする最初のトランスレーショナル、感染主導の実験プラットフォームの1つです。したがって、CNS感染後にてんかんを発症するリスクのある患者の潜在的な治療標的および化合物を特定するのにも役立ちます。

急性発作に対する複合効果 行動発作は、薬物注射(DI)中またはその後のAM / PM発作処理/監視セッション中に発生した場合に記録されます。発作の取り扱い中に観察された発作は、LEV(350 mg / kg)の 図2 に示すヒートマップとして表示できます。発作負荷の分析のために、ビヒクル治療群についての最終(7日目)累積発作負荷値の平均をとり、Mann-Whitney U検定により化合物治療群と比較する(発作負担値には注射後観察で収集されたものを含む)。複合効果については、フィッシャーの正確確率検定により、ビヒクル群と薬物投与群の間で有効性に統計的な差があるかどうかが判断されます。同様に、忍容性データはフィッシャーの正確確率検定で分析されます。体重分析は、実験の過程での変化、および化合物処理マウスとビヒクル処理マウスの違いを決定するために、反復測定ANOVAによって実行されます。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63673/63673fig02.jpg"> 図2:ビヒクル(0.5%メチルセルロース)またはLEV(350 mg / kg)によるテスト後の行動発作のヒートマップ。 1日2回の注射は、取り扱いと発作の観察の1時間前に行われました。.行動発作は、薬物注射(DI)中またはその後のAM / PM発作処理/モニタリングセッション中に発生した場合に記録されました。.LEV(350 mg / kg)は、5日間の観察期間にわたって、取り扱いセッション中に観察される発作(車両発作負担の35.9%)を大幅に減少させます。.ヒートマップは、発作ステージ1〜3を緑、4を黄色、5をオレンジで描くことによって作成されます。この新しい図は、公開されたデータセット19から作成されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63673/63673fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
慢性てんかん 最初の週の円周率で報告された発作の負担とは別に、研究と仮説に応じて役立つ可能性のあるいくつかの読み出しがあります。動物を長期間飼育すると、感染した動物のサブセットは数週間で自発的なてんかん発作を発症しますが、これは急性発作よりも頻度が低く、したがってEEG記録が必要です。マウスからのEEGを記録するために、電極は、脳定位固定装置手術24において埋め込まれる必要がある。図3は、TMEV8に感染したマウスにおけるEEG記録による慢性期における様々なてんかんイベントを示す。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63673/63673fig03.jpg"> 図3:マウスのDAウイルス感染後の慢性期(14週pi)における典型的なEEGトレース。 (A-C)行動運動相関が見られなかった代表的なEEGイベント、すなわち、(A)単一のスパイク、(B)スパイククラスター、(C)ならびに電図、おそらく限局性発作。(D-F)代表的な脳波イベントと行動は相関しています。Dに示されているマウスは、ミオクローヌスけいれん(「M」で示され、運動アーチファクトを伴う)、常同型の動き(「ヘッドプレス」で示され、マウスが頭を地面に平らに押したとき)、または行動停止を伴う発作様イベントを有していた。「Scr」は引っ掻き傷の運動アーチファクトを記述し、(E)および(F)は全身性けいれん発作中の典型的なEEG変化を示す:(E)持続時間22秒および1Hzのラシーンステージ3発作、および(F)持続時間34秒および5.4Hzのステージ5発作。この図は8より前に公開されており、エルゼビアの許可を得て転載されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63673/63673fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
組織学 てんかんと発作は通常、実験モデルで再現される患者の海馬病理を伴うため、ほとんどの検査室では、海馬の変化や潜在的な抗てんかん治療が病理に及ぼす影響も分析しています。一般的に分析されるパラメータには、海馬の神経変性と収縮、ならびに特定の免疫細胞集団の標識による炎症が含まれます。このような分析のために、実験の終わりに、呼吸停止が起こり、心拍数が著しく遅くなるか不整脈を示すまで、マウスを深く麻酔します。血液は、PBSの心内灌流とそれに続く4%パラホルムアルデヒド(PFA)25 によって除去され、組織を固定します。次に、組織を凍結切片および(免疫)染色26によって処理し、続いて顕微鏡分析を行います。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63673/63673fig04.jpg"> 図4:てんかんTMEV感染マウスにおける海馬変性。 (A,B)クレシルバイオレット染色冠状切片は、(A)対照(PBS)マウスでは正常な細胞構造を示し、(B)TMEVマウスでは2ヶ月πで海馬変性を示す。注:側脳室の肥大、肺胞の崩壊、および錐体細胞層の菲薄化。(C)この損傷の定量化は、海馬面積の有意な減少を示し、それに対応するTMEVマウス(N = 7)対PBSマウス(N = 6;データはSEM±平均値;p < 0.001;学生のt検定)。(D,E)NeuN標識はさらに、6ヶ月piで採取された切片における神経細胞喪失の大きさを示す。矢印は、錐体細胞が完全に失われている領域を示す。(E)歯状回はてんかんマウスでも比較的無傷であるように見える。スケールバー=(A、B)2ミリメートル;(奥行き、東)0.5ミリメートル。この図は6より前に出版されており、オックスフォード大学出版局の許可を得て転載されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63673/63673fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63673/63673fig05.jpg"> 図5:感染後7日目の急性脳炎によるT細胞浸潤の異なる重症度の代表的な顕微鏡写真。同側背海馬を含む連続切片を、Tリンパ球を標識するためにCD3に対する抗体で染色した。(A,D)模擬感染動物に現れたT細胞浸潤のない正常な海馬。(ロ、エ)TMEV感染マウスの大多数に見られるような中程度のT細胞浸潤。(C, F)Tリンパ球の重度の浸潤は、感染したマウスの一部でのみ見られました。この図は8より前に公開されており、エルゼビアの許可を得て転載されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63673/63673fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:補足ファイルは、TMEVモデルの複合テストに使用されるフォームで構成されています。 1 ページ目には、実験のセットアップの概要を示します。化合物、ビヒクル、および化合物溶液の調製に関する情報は、1〜2ページに記載されています。複合アプリケーションは3ページに記録されています。4〜5ページのスコアリングシートは、化合物注射を行う実験者によって観察および定量化された発作を記録するために使用されます。4ページでは、5匹のマウスのケージ1〜4についてデータを収集でき、5ページでは、私たちの手で化合物試験を行うための標準的な動物数であるケージ5〜8を記録することができます。6〜7ページのスコアリングシートは、化合物を注入するたびに1時間後に観察、取り扱い、および穏やかなケージの振とうを実行している盲目の観察者によって使用されます。ここでも、発作スコアは、これらの例示的なスコアシート上に合計8つのケージについて記録することができる。最後のページ8は、他の観察やメモを記録するために使用できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63673/Suppl.%20File%201.zip" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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A Model for Epilepsy of Infectious Etiology using Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus

C57BL / 6マウスにおけるTheilerマウス脳脊髄炎ウイルス(TMEV)による脳内感染は、ヒト患者におけるウイルス性脳炎およびその後のてんかんの初期および慢性の臨床症状の多くを再現します。この論文では、TMEVモデルのウイルス感染、症状、および組織病理学について説明します。

Theilerマウス脳脊髄炎ウイルスを用いた感染病因のてんかんモデル

One of the main causes of epilepsy is an infection of the central nervous system (CNS); approximately 8% of patients who survive such an infection develop ...

TMEVモデルは、CNS感染の結果としての発作発生のメカニズムの調査を可能にする最初の実験プラットフォームの1つです。中枢神経系感染症はてんかんのリスクを著しく高めます。これらのモデルは、リスクのある患者の潜在的な治療標的と化合物を特定するのに役立ちます。実験者はマウスを扱う訓練を受けるべきです。ウイルス注射は、死んだ動物に染料を注入して十分な精度とルーチンを達成することにより、非常によく実践できます。手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるローラ・ベルです。まず、インスリン注射器のキャップを外し、針の周りのカラーとしてポリエチレンチューブを追加して、2.5ミリメートルの適切な注入深さを確保します。次に、シリンジをエタノールに30分間沈め、シリンジをUV光の下に30分間置きます。次に、キャップを針に戻し、注射器を滅菌ポーチに包みます。ポーチをテープで留めて閉じ、準備日をラベル付けします。ウイルス注射を行うには、マイナス80°Cの冷凍庫からTMEVのダニエルズ株のアリコートを入手します。ウイルスを解凍し、氷の上に保管します。次に、シリンジにウイルス懸濁液をロードします。その後、消毒剤でベンチを掃除し、吸煙剤の下で作業します。麻酔をかけたマウスをフード下の麻酔ボックスから移し、つま先をつまんで手術耐性を確認します。次に、アルコールパッドで動物の頭をきれいにし、注射部位が上を向くようにマウスの頭を少し左に傾けます。皮膚を少し後ろに引っ張り、針を頭に挿入します。次に、右半球の側頭領域の2.5ミリメートルの深さまで20マイクロリットルを心質内注射します。シリンジを5〜15秒間そのままにしておき、インジェクションからの漏れがないか、気泡が見られない場合は、新しいシリンジを準備します。シリンジを慎重に引き抜くときは、少し回転させます。次に、麻酔からの回復中に加熱パッドの半分オン、半分オフに置かれた新しいケージに動物を移します。また、胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。まず、すべてのケージをベンチに持ってきて、明期に1日2回発作がないか動物を観察します。修正されたレーススケールで発作活動をスコアリングし、発作の数と強度を報告します。次に、ケージを横切ってペンをスライドさせて音を立て、各動物を別の箱に移して戻します。自発的につかまっていない動物やケージを穏やかに振った後、マウスの尾を左から右にひっくり返して慎重にひっくり返しながら、より激しい取り扱いで発作を引き起こします。発作行動について各動物をもう一度観察し、後続のケージについてもこのプロセスを繰り返します。行動発作は、薬物注射中またはその後の発作処理モニタリングセッション中に発生した場合に記録されました。観測されたデータは、発作段階を異なる色で描いて作成されたヒートマップとして提示されました。EEGを記録することにより、TMEVに感染してから数か月後の慢性期にさまざまなてんかんイベントを特定できます。海馬変性およびてんかんTMEV感染マウスの定量化は、対照と比較したTMEVマウスの海馬面積の有意な減少および対応する心室面積の増加を示す。免疫組織学的分析は、炎症細胞の存在などのさまざまなパラメータに関する情報を提供できます。このとき、海馬を含む切片は、Tリンパ球を標識する抗体で染色した。模擬感染動物はT細胞浸潤を示さないが、TMEV感染マウスの大多数では中程度の浸潤が見られた。感染したマウスのいくつかは、Tリンパ球の重度の浸潤を示します。すべての動物が各観察期間中に発作を起こすわけではありません。また、発作の発生率が最も高いのは、接種後5日目と6日目です。TMEVモデルを使用して、感染誘発性発作に対する新しい抗てんかん薬の有効性をテストします。併存する行動変化および電気生理学的変化を調査するアッセイも評価することができる。TMEVモデルは、てんかん研究コミュニティに側頭葉てんかんの最初のCNS感染誘発モデルを提供し、感染後のてんかん形成の根底にあるメカニズムの調査を可能にしました。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

ゼブラフィッシュ幼生における前脳電気生理学的記録

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

脳内注入戦略を使用してジカ ウイルス性神経疾患のマウスモデルの確立: 胎生期、新生児、およびアダルト

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

くも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管攣縮の定量化法の体積

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

神経活動と Spm と頭蓋内脳波データを使用した接続の分析

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

Inducement and Evaluation of a Murine Model of Experimental Myopia

誘因とマウス実験近視モデルの評価

Murine model of myopia can be a powerful tool for myopia research because of the comparatively easy genetic manipulation. One way to induce myopia in ...

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

てんかんのゼブラフィッシュモデルにおける行動と生理学的解析

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

病原体や医薬品との相互作用、脳によって障壁の交差を勉強する人間の血-脳インターフェイス モデル

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

Analysis of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage with High Frequency Transcranial Duplex Ultrasound

高周波経頭蓋二重超音波を用いたくも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管れん縮の解析

Cerebral vasospasm that occurs in the weeks after subarachnoid hemorrhage, a type of hemorrhagic stroke, contributes to delayed cerebral ischemia. A ...

A Behavioral Screen for Heat-Induced Seizures in Mouse Models of Epilepsy

てんかんのマウスモデルにおける熱誘発発作の行動スクリーニング

Transgenic mouse models have proved to be powerful tools in studying various aspects of human neurological disorders, including epilepsy. The ...

Preparation and Implantation of Electrodes for Electrically Kindling VGAT-Cre Mice to Generate a Model for Temporal Lobe Epilepsy

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique ...