Name: a model for epilepsy of infectious etiology using theiler's murine encephalomyelitis virus
Uploaded: 2022-06-23T12:40:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Model for Epilepsy of Infectious Etiology using Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus at JoVE.com

SB поддерживается стартовым грантом FU Berlin. KSW поддерживается R37 NS065434 и Фондом ALSAM. LAB поддерживается наградой D-SPAN 1F99NS125773-01. Мы благодарим Роберта Фудзинами, доктора философии, за предоставление нам вируса Тейлера и Центр клеточной визуализации Университета штата Юта за поддержку микроскопии.

<ol>
	<li>Getts, D. R., Balcar, V. J., Matsumoto, I., M&#252;ller, M., King, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+and+the+immune+system:+their+roles+in+seizure+cascade+development.">Viruses and the immune system: their roles in seizure cascade development.</a> Journal of Neurochemistry. 104 (5), 1167-1176 (2008).</li><li>Libbey, J. E., Fujinami, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotropic+viral+infections+leading+to+epilepsy:+Focus+on+Theiler's+murine+encephalomyelitis+virus.">Neurotropic viral infections leading to epilepsy: Focus on Theiler's murine encephalomyelitis virus.</a> Future Virology. 6 (11), 1339-1350 (2011).</li><li>Vezzani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections,+inflammation+and+epilepsy.">Infections, inflammation and epilepsy.</a> Acta Neuropathologica. 131 (2), 211-234 (2016).</li><li>Misra, U. K., Tan, C. T., Kalita, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+encephalitis+and+epilepsy.">Viral encephalitis and epilepsy.</a> Epilepsia. 49, 13-18 (2008).</li><li>Libbey, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seizures+following+picornavirus+infection).">Seizures following picornavirus infection).</a> Epilepsia. 49 (6), 1066-1074 (2008).</li><li>Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+postinfection+epilepsy+after+Theiler's+virus+infection+of+C57BL/6+mice.">Development of postinfection epilepsy after Theiler's virus infection of C57BL/6 mice.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (12), 1210-1219 (2010).</li><li>Stewart, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+zebrafish+models+of+epilepsy:+What,+how+and+where+next.">Perspectives of zebrafish models of epilepsy: What, how and where next.</a> Brain Research Bulletin. 87 (2-3), 135-143 (2012).</li><li>Br&#246;er, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+inflammation,+neurodegeneration+and+seizure+development+following+picornavirus+infection+markedly+differ+among+virus+and+mouse+strains+and+substrains.">Brain inflammation, neurodegeneration and seizure development following picornavirus infection markedly differ among virus and mouse strains and substrains.</a> Experimental Neurology. 279, 57-74 (2016).</li><li>Br&#246;er, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+mouse+models+of+multiple+sclerosis+and+epilepsy:+Marked+differences+in+neuropathogenesis+following+infection+with+two+naturally+occurring+variants+of+Theiler's+virus+BeAn+strain.">Viral mouse models of multiple sclerosis and epilepsy: Marked differences in neuropathogenesis following infection with two naturally occurring variants of Theiler's virus BeAn strain.</a> Neurobiology of Disease. 99, 121-132 (2017).</li><li>Loewen, J. L., Barker-Haliski, M. L., Dahle, E. J., White, H. S., Wilcox, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Injury,+gliosis,+and+glial+proliferation+in+two+models+of+temporal+lobe+epilepsy.">Neuronal Injury, gliosis, and glial proliferation in two models of temporal lobe epilepsy.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 75 (4), 366-378 (2016).</li><li>Bell, L. A., Wallis, G. J., Wilcox, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivity+and+increased+proliferation+of+NG2+cells+following+central+nervous+system+infection+with+Theiler's+murine+encephalomyelitis+virus.">Reactivity and increased proliferation of NG2 cells following central nervous system infection with Theiler's murine encephalomyelitis virus.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 369 (2020).</li><li>Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theiler's+virus+infection+chronically+alters+seizure+susceptibility.">Theiler's virus infection chronically alters seizure susceptibility.</a> Epilepsia. 51 (8), 1418-1428 (2010).</li><li>Buenz, E. J., Rodriguez, M., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+spatial+memory+is+a+consequence+of+picornavirus+infection.">Disrupted spatial memory is a consequence of picornavirus infection.</a> Neurobiology of Disease. 24 (2), 266-273 (2006).</li><li>Tramoni-Negre, E., Lambert, I., Bartolomei, F., Felician, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+memory+deficits+in+temporal+lobe+epilepsy.">Long-term memory deficits in temporal lobe epilepsy.</a> Revue Neurologique. 173 (7-8), 490-497 (2017).</li><li>Ponds, R. W., Hendriks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+rehabilitation+of+memory+problems+in+patients+with+epilepsy.">Cognitive rehabilitation of memory problems in patients with epilepsy.</a> Seizure. 15 (4), 267-273 (2006).</li><li>Sloviter, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+status+epilepticus+in+animals:+What+are+we+modeling.">Experimental status epilepticus in animals: What are we modeling.</a> Epilepsia. 12, 11-13 (2009).</li><li>L&#246;scher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+seizures+and+epilepsy:+Past,+present,+and+future+role+for+the+discovery+of+antiseizure+drugs.">Animal models of seizures and epilepsy: Past, present, and future role for the discovery of antiseizure drugs.</a> Neurochemical Research. 42 (7), 1873-1888 (2017).</li><li>Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+National+Institute+of+Neurological+Disorders+and+Stroke+(NINDS)+Epilepsy+Therapy+Screening+Program+(ETSP).">The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP).</a> Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).</li><li>Metcalf, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+prototype+antiseizure+and+anti-inflammatory+compounds+in+the+Theiler's+murine+encephalomyelitis+virus+model+of+epilepsy.">Screening of prototype antiseizure and anti-inflammatory compounds in the Theiler's murine encephalomyelitis virus model of epilepsy.</a> Epilepsia Open. 7 (1), 46-58 (2021).</li><li>Daniels, J. B., Pappenheimer, A. M., Richardson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+encephalomyelitis+of+mice+(DA+strain).">Observations on encephalomyelitis of mice (DA strain).</a> Journal of Experimental Medicine. 96 (6), 517-530 (1952).</li><li>K&#228;ufer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptors+CCR2+and+CX3CR1+regulate+viral+encephalitis-induced+hippocampal+damage+but+not+seizures.">Chemokine receptors CCR2 and CX3CR1 regulate viral encephalitis-induced hippocampal damage but not seizures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8929-8938 (2018).</li><li>Libbey, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+diet+on+the+severity+of+central+nervous+system+disease:+One+part+of+lab-to-lab+variability.">The effects of diet on the severity of central nervous system disease: One part of lab-to-lab variability.</a> Nutrition. 32 (7-8), 877-883 (2016).</li><li>Racine, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+seizure+activity+by+electrical+stimulation.+II.+Motor+seizure.">Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure.</a> Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).</li><li>Kim, J. E., Cho, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pilocarpine+model+of+temporal+lobe+epilepsy+and+EEG+monitoring+using+radiotelemetry+system+in+mice.">The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy and EEG monitoring using radiotelemetry system in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Tu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-floating+immunostaining+of+mouse+brains.">Free-floating immunostaining of mouse brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Это первая модель эпилепсии у грызунов, основанная на инфекции, которая позволяет исследовать развитие острых и хронических припадков. Это поможет определить лекарственные мишени и новые соединения для профилактики заболеваний или модификации для одной из наиболее распространенных этиологий эпилепсии.
Как описано выше, может потребоваться тщательное рассмотрение партии и титра вируса, чтобы гарантировать, что адекватная доля мышей, получавших TMEV, демонстрирует судороги, вызванные обработкой. Если у животных меньше судорог, чем обычно, используйте партию из N = 20 животных для проверки эффективности вируса. Если его активность снижена (менее 50%), пора делать новые аликвоты и тестировать их на N = 20 животных. Если новые аликвоты не более эффективны, следует очистить новую партию вируса. Для некоторых трансгенных линий мышей может потребоваться использование более низкого вирусного титра; Поэтому вирусный титр следует разбавлять по мере необходимости после предварительных экспериментов. Большинство доступных данных о мышах B6 поступило из лабораторий Джексона (Бар-Харбор, Мэн, США или Чарльз-Ривер, Зульцфельд, Германия); однако аналогичная частота судорог у мышей B6, полученных от Harlan (Eystrup, Германия), была подтверждена8. Частота судорог у трансгенных животных с фоном B6 сопоставима с мышами B6 дикого типа, но может отличаться, если генетические изменения влияют на инвазию вируса, воспалительную реакцию или нейродегенерацию21. Острые припадки наблюдаются спонтанно, но вызваны обращением и шумом, поэтому крайне важно обращаться со всеми животными одинаково при сравнении частоты приступов. Сеансы обработки два раза в день ранее обеспечивали высокую судорожную нагрузку и большую долю мышей, демонстрирующих судороги в течение 3-7 дней после заражения 6,8,19. Дополнительные сеансы обработки (1-й и 2-й дни) также могут быть использованы для увеличения судорожной нагрузки. Кроме того, животные могут наблюдаться перед каждым сеансом обработки, чтобы убедиться, что спонтанные припадки не возникают. Например, шумная лабораторная среда может вызвать судороги, которые, в свою очередь, могут сделать животных невосприимчивыми к судорогам, вызванным обращением, во время тестирования.
В то время как инфекция TMEV вызывает судороги, вызванные обработкой, у большинства мышей, неизвестно, почему некоторые животные устойчивы к этому лечению. Как описано выше, может случиться так, что электрографические припадки (с минимальным или отсутствующим сопутствующим поведением) возникают и обычно не количественно оцениваются без сопутствующей записи ЭЭГ. Также может случиться так, что небольшие различия в месте инъекции способствуют снижению вирусного эффекта в головном мозге; Тем не менее, судороги были зарегистрированы после корковой и стриарной инфекции 5,6,8,9 из-за тропизма вируса к гиппокампу. Для скрининговых исследований лекарств в этой модели, чтобы выявить снижение судорог (например, снижение судорожного бремени на 50%), требуется большее количество животных для каждой группы (например, N = 20). Кроме того, вариабельность судорожного поведения в этой модели требует больших различий в эффектах лекарств и транспортных средств, чтобы определить значительное снижение судорог. Поэтому одним из ограничений этой модели является требование больших размеров групп. Тем не менее, достаточные размеры групп также позволяют идентифицировать противосудорожные и противовоспалительные эффекты в этой модели19.
Подавляющее большинство наблюдаемых припадков в этой модели происходит в период острой инфекции. Несмотря на дегенерацию гиппокампа, активацию иммунных клеток и когнитивный дефицит, наблюдаемые у мышей, получавших TMEV, только у небольшой части животных, получавших лечение, в конечном итоге развиваются хронические спонтанные судороги. Это низкое общее бремя судорог потребует большого количества инфицированных мышей, чтобы должным образом изучить спонтанные судороги в этой модели, что выходит за рамки и возможности многих проектов. Имплантация глубинных электродов и мониторинг ЭЭГ также увеличат нагрузку на экспериментальных животных. В то время как глубинные электроды могут помочь в выявлении спонтанной судорожной активности, изменения в анатомии гиппокампа после инфекции могут затруднить последовательное размещение электродов.
Острая необходимость определения новых методов лечения эпилепсии требует разработки моделей, которые могут быть использованы в качестве метода быстрого скрининга противосудорожной эффективности. Эта модель предоставляет функции для удовлетворения этого срочного запроса. Более того, тот факт, что он не требует какой-либо стереотаксической хирургии, делает его подходящей и простой в исполнении моделью для исследования противосудорожных соединений.

Одним из частых последствий вирусного энцефалита являются эпилептические припадки. Многие вирусные инфекции вызывают симптоматические судороги во время острой фазы инфекции; Риск таких припадков увеличивается более чем на 20% среди населения в целом 1,2,3. Пациенты, пережившие инфекцию, также имеют повышенный риск развития хронической эпилепсии в 4-20% в течение нескольких месяцев или лет после заражения 1,4. Вирус мышиного энцефаломиелита Тейлера (TMEV) был идентифицирован как подходящий вирус для изучения острых и хронических судорог на мышиной модели вирусного энцефалита 5,6,7. TMEV представляет собой безоболочечный одноцепочечный РНК-вирус семейства Picornaviridae с положительным смыслом и традиционно используется для изучения демиелинизации в спинном мозге мышей SJL, от которого защищены мыши C57BL / 6 (B6), поскольку они обладают способностью быстро очищать вирус после заражения. Тем не менее, TMEV вызывает острые судороги у 50-75% мышей-самцов и самок B6 в течение первой недели после заражения (pi), в то время как примерно у 25-40% развивается хроническая эпилепсия от нескольких недель домесяцев pi 2,5,6,8,9. Помимо судорог, у мышей также наблюдается общая гистопатология эпилептического гиппокампа с нейродегенерацией и глиозом 5,6,8,10,11,12. Кроме того, мыши B6, инфицированные TMEV, показывают значительно худшие результаты в поведенческих тестах на обучение и память и имеют когнитивную коморбидность, что также наблюдается у клинических пациентов с эпилепсией13,14,15.
Традиционно модели эпилепсии и судорог используют либо применение химиосудорожных веществ, либо электрическую стимуляцию, чтобы вызвать судороги; Однако эти модели не имеют конструктной валидности и часто демонстрируют более тяжелые судороги и повреждения головного мозга, чем у клинических пациентов16. Не существует модели, подходящей для каждого исследовательского вопроса17. Использование модели TMEV особенно интересно, если исследуются предрасполагающие факторы развития судорог после инфекции ЦНС или если проводится скрининг соединений на предмет их противосудорожной эффективности.
Поскольку модель TMEV была создана и используется в нескольких различных лабораториях по всему миру, авторы определили множество деталей, которые позволяют успешно реализовать модель, например, специфичность различных штаммов вирусов и мышей. Наиболее достоверная индукция судорог была получена с помощью штамма Даниэля мышей TMEV и B6J 2,5,6,8,9. В настоящее время модель используется Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (NINDS) в качестве платформы для выявления новых лекарств против эпилепсии и судорог18,19. Эта статья включает в себя подробный протокол индукции вируса и клинического мониторинга, чтобы позволить другим исследователям использовать эту модель вирусного энцефалита для дальнейшего понимания механизмов заболевания, а также для тестирования лекарств.
Следующий протокол отражает исследование, предназначенное для тестирования соединений в этой модели, хотя может быть выполнено множество других типов исследований. Мышей ненадолго анестезируют перед инъекцией штаммом TMEV Даниэля в височную область правого полушария (заднюю и медиальную по отношению к правому глазу). В зависимости от вопроса исследования, если требуются неинфицированные контрольные животные, мыши получают стерильный фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS, pH 7,4, включая KH 2 PO 4 [1,06 мМ], NaCl [155,17 мМ] и Na 2 HPO4·7H 2 O [2,97мМ]) вместо TMEV. Предыдущий опыт работы с мышами, инфицированными TMEV, показал, что судороги, вызванные обработкой, возникают между 3-м и 7-м днем после заражения. Частота инъекций, путь и время испытаний экспериментальных соединений варьируются в зависимости от их свойств. Рекомендуется проводить прививку вируса в пятницу, что позволяет проводить мониторинг приступов на 3-7 день на следующей неделе, с понедельника по пятницу. В течение недели мониторинга приступов экспериментальные соединения можно вводить (в/) два раза в день (с интервалом не менее 4 часов), если иное не вытекает из кинетики или механизма действия соединения. Мониторинг судорог во время лечения может проводиться в заранее определенный момент времени. Время инъекции и наблюдения варьируется в зависимости от отдельных соединений. Животным вводят исследуемое соединение или транспортное средство вместо лекарственного соединения. Эти две группы можно обрабатывать и наблюдать аналогично экспериментальной группе. Во время эксперимента один человек, работающий с мышами и оценивающий судороги, должен быть слеп к лечению.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent paper</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>any</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.)</td>
			<td>30216542</td>
			<td>0. 1 mg&#8211;220 g&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal balance</td>
			<td>Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.)</td>
			<td>STX2202</td>
			<td>0.01 g&#8211;2200 g&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes</td>
			<td>BD (Mississauga, ON, Canada)&#160;</td>
			<td>BD329461</td>
			<td>Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle - 1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daniel&#39;s strain of TMEV</td>
			<td>kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah)</td>
			<td>-</td>
			<td>3 x 105 plaque-forming units aliquot(s)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super</td>
			<td>Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.)</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso</td>
			<td>VETone (Boise, ID, U.S.A)</td>
			<td>502017</td>
			<td>Isoflurane 250 mL, 2%&#8211;5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume absorber&#160;</td>
			<td>Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Protection Disposable SMS White Lab Coats&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.)</td>
			<td>17-100-810A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 9&#160;</td>
			<td>(La Jolla, CA, U.S.A.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>any</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel Microsoft&#160;</td>
			<td>(Redmond, WA, U.S.A.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Word Microsoft&#160;</td>
			<td>(Redmond, WA, U.S.A.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse cage</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>any mouse cage holding at least 5 mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide needles&#160;</td>
			<td>BD (Mississauga, ON, Canada)</td>
			<td>329652</td>
			<td>BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes - 26 G x 3/8 - 0.45 mm x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-Sealing Sterilizing Pouch&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.)</td>
			<td>NC9241087&#160;</td>
			<td>12.6 x 25.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small glass flask</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>any, volume 25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.)</td>
			<td>10010056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; CO. KG</td>
			<td>X171.1</td>
			<td>size according to volume of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; CO. KG</td>
			<td>AAN2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Luer-Lok</td>
			<td>BD (Mississauga, ON, Canada)</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL syringe only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer</td>
			<td>Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.)</td>
			<td>EW-08895-23</td>
			<td>Bath sonicator - 0.5 gal, 115 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vehicle solution</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>depending on compound vehicle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex REAX&#160;</td>
			<td>Heidolph Instruments GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td>541-10000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a model for epilepsy of infectious etiology using theiler's murine encephalomyelitis virus

Одной из основных причин эпилепсии является инфекция центральной нервной системы (ЦНС); Примерно у 8% пациентов, переживших такую инфекцию, развивается эпилепсия, причем показатели значительно выше в менее экономически развитых странах. В данной работе представлен обзор моделирования эпилепсии инфекционной этиологии и использования ее в качестве платформы для тестирования новых противосудорожных соединений. Представлен протокол индукции эпилепсии путем нестереотаксической внутримозговой инъекции вируса мышиного энцефаломиелита Тейлера (TMEV) у мышей C57BL/6, который воспроизводит многие ранние и хронические клинические симптомы вирусного энцефалита и последующей эпилепсии у пациентов-людей. Описана клиническая оценка мышей во время энцефалита для мониторинга судорожной активности и выявления потенциальных противосудорожных эффектов новых соединений. Кроме того, показаны гистопатологические последствия вирусного энцефалита и судорог, таких как повреждение гиппокампа и нейровоспаление, а также долгосрочные последствия, такие как спонтанные эпилептические припадки. Модель TMEV является одной из первых трансляционных, ориентированных на инфекцию, экспериментальных платформ, позволяющих исследовать механизмы развития эпилепсии как следствия инфекции ЦНС. Таким образом, он также служит для выявления потенциальных терапевтических мишеней и соединений для пациентов с риском развития эпилепсии после инфекции ЦНС.

Комплексное воздействие на острые судороги Поведенческие припадки регистрируются, если они возникают во время инъекции наркотиков (DI) или во время последующих сеансов обработки/мониторинга приступов AM / PM. Судороги, наблюдаемые во время обработки судорог, можно представить в виде тепловой карты, которая показана на рисунке 2 для LEV (350 мг / кг). Для анализа судорожного бремени берется среднее значение окончательных (7-й день) кумулятивных значений судорожной нагрузки для группы, обработанной носителем, и сравнивается с помощью теста Манна-Уитни с группой, получавшей соединение (значения судорожной нагрузки включают значения, собранные при наблюдении после инъекции). Что касается эффективности соединения, точный тест Фишера определяет, существует ли статистическая разница в эффективности между группами, получавшими транспортное средство и лекарственное средство. Точно так же данные о переносимости анализируются с помощью точного теста Фишера. Анализ массы тела проводится с помощью повторных измерений ANOVA для определения изменений в ходе эксперимента, а также различий между мышами, получавшими соединения и транспортные средства.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63673/63673fig02.jpg"> Рисунок 2: Тепловая карта поведенческих припадков после тестирования с носителем (0,5% метилцеллюлозы) или LEV (350 мг / кг). Инъекции два раза в день проводились за 1 ч до обработки и наблюдения за судорогами. Поведенческие припадки регистрировались, если они происходили во время инъекции наркотиков (DI) или во время последующих сеансов обработки/мониторинга приступов AM / PM. LEV (350 мг / кг) значительно снижает судороги, наблюдаемые во время сеансов обработки (35,9% от судорожного бремени транспортного средства) в течение 5-дневного периода наблюдения. Тепловая карта создается путем изображения приступов 1-3 стадии зеленым цветом, 4 желтым цветом и 5 оранжевым цветом. Этот новый рисунок был создан на основе опубликованного набора данных19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63673/63673fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Хроническая эпилепсия Помимо зарегистрированного судорожного бремени в первую неделю pi, есть несколько показаний, которые могут быть полезны в зависимости от исследования и гипотезы. Если животные содержатся в течение длительного времени, у подгруппы инфицированных животных будут развиваться спонтанные эпилептические припадки через несколько недель, которые возникают реже, чем острые припадки, и, таким образом, требуют записи ЭЭГ. Чтобы записать ЭЭГ мышей, электроды должны быть имплантированы в стереотаксическую хирургию24. На рисунке 3 показаны различные эпилептические события в хронической фазе с помощью записи ЭЭГ у мышей, инфицированных TMEV8.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63673/63673fig03.jpg"> Рисунок 3: Типичные следы ЭЭГ в хронической фазе (14 недель pi) после заражения вирусом DA у мышей. (A-C) Репрезентативные события ЭЭГ, в которых не наблюдалось поведенческого моторного коррелята, т.е. (A) одиночные спайки, (B) спайковые кластеры, (C), а также электрографический, предположительно фокальный припадок. (Д-Ж) Репрезентативные события ЭЭГ с поведенческими коррелятами. У мыши, показанной в D, были судорожные события с миоклоническими подергиваниями (обозначенными буквой «М», сопровождаемыми артефактами движения), стереотипными движениями (обозначенными «нажатием на голову», когда мышь плоски прижимала голову к земле) или поведенческой остановкой; «Scr» описывает артефакт движения царапания, (E) и (F) показывают типичные изменения ЭЭГ во время генерализованных судорожных припадков: (E) приступ 3-й стадии Расина с продолжительностью 22 с и 1 Гц и (F) приступ 5-й стадии с продолжительностью 34 с и 5,4 Гц. Этот рисунок был опубликован до8 и перепечатывается с разрешения Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63673/63673fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Гистология Поскольку эпилепсия и судороги обычно сопровождаются патологией гиппокампа у пациентов, которая повторяется в экспериментальных моделях, большинство лабораторий также анализируют изменения гиппокампа или влияние потенциального противосудорожного лечения на патологию. Обычно анализируемые параметры включают нейродегенерацию и сокращение гиппокампа, а также воспаление путем маркировки специфических популяций иммунных клеток. Для таких анализов в конце эксперимента мышей глубоко анестезируют до тех пор, пока не произойдет остановка дыхания и частота сердечных сокращений значительно замедлится или не проявится аритмия. Кровь удаляется путем внутрисердечной перфузии PBS с последующим введением 4% параформальдегида (PFA)25 для фиксации ткани. Затем ткань обрабатывают криосекцией и (иммунным) окрашиванием26 с последующим микроскопическим анализом.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63673/63673fig04.jpg"> Рисунок 4: Дегенерация гиппокампа у мышей, инфицированных эпилептическим TMEV. (A, B) Окрашенные фиолетовым цветом корональные срезы Cresyl демонстрируют нормальную цитоархитектонику у мыши (A) контроля (PBS) и дегенерацию гиппокампа у мыши (B) TMEV через 2 месяца PI. Примечание: Увеличение боковых желудочков, коллапс альвеуса и истончение пирамидного клеточного слоя. (C) Количественная оценка этого повреждения показывает значительное уменьшение площади гиппокампа и соответствующее увеличение площади желудочков мышей TMEV (N = 7) по сравнению с мышами PBS (N = 6; данные являются средними ± SEM; p < 0,001; t-критерий Стьюдента). (Д,Е) Маркировка NeuN также иллюстрирует величину потери нейрональных клеток в срезах, взятых через 6 месяцев пи. Стрелками обозначены области с полной пирамидной потерей клеток. (E) Зубчатая извилина, по-видимому, относительно неповреждена даже у мышей с эпилепсией. Масштабная линейка = (A,B) 2 мм; (D,E) 0,5 мм. Этот рисунок был опубликован до6 лет и перепечатывается с разрешения издательства Oxford University Press. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63673/63673fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63673/63673fig05.jpg"> Рисунок 5: Репрезентативные микрофотографии различной степени тяжести Т-клеточной инфильтрации вследствие острого энцефалита через 7 дней после заражения. Серийные срезы, содержащие ипсилатеральный дорсальный гиппокамп, окрашивали антителами против CD3 с целью маркировки Т-лимфоцитов. (А,Д) Нормальный гиппокамп без инфильтрации Т-клеток, как это было у фиктивно инфицированных животных. (В, Е) Умеренная инфильтрация Т-клеток, наблюдаемая у большинства мышей, инфицированных TMEV. (К, Ж) Тяжелая инфильтрация Т-лимфоцитов, которая наблюдалась только у некоторых инфицированных мышей. Этот рисунок был опубликован до8 и перепечатывается с разрешения Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63673/63673fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Дополнительный файл 1: Дополнительный файл состоит из формы, используемой для испытаний соединений в модели TMEV. На стр. 1 приведен обзор экспериментальной установки. Информация о составе, носителе и приготовлении раствора компаунда записана на стр. 1-2. Составное внесение описано на стр. 3. Оценочные листы на страницах 4-5 используются для записи наблюдаемых и количественно оцениваемых экспериментатором, выполняющим инъекцию соединения. На странице 4 можно собрать данные для клеток 1-4 по 5 мышей в каждой, а на странице 5 можно записать клетки 5-8, что является стандартным количеством животных для тестирования соединений в наших руках. Оценочные листы на страницах 6-7 используются слепым наблюдателем, который выполняет наблюдение, обработку и мягкое встряхивание клетки через 1 час после каждой инъекции соединения. Опять же, оценки судорог можно отметить в общей сложности для восьми клеток в этих образцовых оценочных листах. Последняя страница 8 может быть использована для записи любых других наблюдений или заметок. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63673/Suppl.%20File%201.zip" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Model for Epilepsy of Infectious Etiology using Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus at JoVE.com

A Model for Epilepsy of Infectious Etiology using Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus

Внутримозговая инфекция вирусом мышиного энцефаломиелита Тейлера (TMEV) у мышей C57BL/6 реплицирует многие ранние и хронические клинические симптомы вирусного энцефалита и последующей эпилепсии у пациентов-людей. В этой статье описывается вирусная инфекция, симптомы и гистопатология модели TMEV.

Модель эпилепсии инфекционной этиологии с использованием вируса мышиного энцефаломиелита Тейлера

One of the main causes of epilepsy is an infection of the central nervous system (CNS); approximately 8% of patients who survive such an infection develop ...

Модель TMEV является одной из первых экспериментальных платформ, позволяющих исследовать механизмы развития судорог как следствия инфекции ЦНС. Инфекции ЦНС значительно увеличивают риск развития эпилепсии. Эта модель помогает идентифицировать потенциальные терапевтические мишени и соединения для пациентов из группы риска.Экспериментаторы должны быть обучены работе с мышами. Инъекцию вируса можно очень хорошо практиковать, вводя краситель мертвым животным для достижения достаточной точности и рутины. Демонстрировать процедуру будет Лаура Белл, аспирантка из моей лаборатории.Для начала снимите колпачок инсулинового шприца и добавьте полиэтиленовую трубку в качестве воротника вокруг иглы, чтобы обеспечить адекватную глубину инъекции 2,5 миллиметра. Затем погрузите шприц в этанол на 30 минут и поместите шприц под ультрафиолетовый свет на 30 минут. Затем наденьте колпачок обратно на иглу и заверните шприц в стерилизующий мешочек.Заклейте пакет скотчем, чтобы закрыть его, и наклейте этикетку с датой приготовления. Чтобы выполнить инъекцию вируса, возьмите аликвоты штамма Дэниелса TMEV из морозильной камеры при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Разморозьте вирус и держите его на льду.Затем загрузите шприц с вирусной суспензией. После этого очистите скамейку дезинфицирующим средством и поработайте под поглотителем дыма. Перенесите анестезированную мышь из анестезиологического бокса под капюшоном и проверьте хирургическую переносимость, выполнив защемление пальца ноги.Затем очистите голову животного спиртовой подушечкой и слегка наклоните голову мыши влево, чтобы место инъекции было направлено вверх. Оттяните кожу немного назад и введите иглу в головку. Далее вводят 20 микролитров внутрикордно на глубину 2,5 миллиметра в височную область правого полушария.Оставьте шприц на месте на пять-15 секунд и проверьте, нет ли утечки из инъекции, или, если видны пузырьки воздуха, приготовьте новый шприц. Осторожно вытаскивая шприц, слегка поверните его. Затем пересаживают животное в новую клетку, в которую помещают наполовину наполовину, наполовину выключенную грелку во время восстановления после наркоза.И не оставляйте животных без присмотра до тех пор, пока они не придут в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Во-первых, поднесите все клетки к скамейке и наблюдайте за животными на предмет судорог два раза в день во время световой фазы. Оцените активность приступов по модифицированной гоночной шкале и сообщите количество и интенсивность приступов.Затем проведите загоном по клетке, чтобы пошуметь, и перенесите каждое животное в другой ящик и обратно. Для животных, которые не схватились спонтанно или после легкого встряхивания клетки, вызывайте судороги более интенсивным обращением, осторожно переворачивая мышь, переворачивая ее хвостом слева направо. Понаблюдайте за каждым животным на предмет судорожного поведения еще раз и повторите процесс для последующих клеток.Поведенческие припадки регистрировались, если они происходили во время инъекций наркотиков или во время последующих сеансов мониторинга обработки припадков. Наблюдаемые данные были представлены в виде тепловой карты, созданной путем изображения стадий припадка разными цветами. С помощью записи ЭЭГ можно выявить различные эпилептические явления в хронической фазе, через несколько месяцев после заражения ТМВ.Количественная оценка дегенерации гиппокампа и эпилептических мышей, инфицированных TMEV, показывает значительное уменьшение площади гиппокампа и соответствующее увеличение площади желудочков мышей TMEV по сравнению с контрольной группой. Иммуногистологический анализ может предоставить информацию о различных параметрах, таких как наличие воспалительных клеток. В этом случае срезы, содержащие гиппокамп, окрашивали антителами для маркировки Т-лимфоцитов.У фиктивно инфицированных животных инфильтрация Т-клеток отсутствовала, тогда как умеренная инфильтрация наблюдалась у большинства мышей, инфицированных TMEV. У некоторых инфицированных мышей наблюдается тяжелая инфильтрация Т-лимфоцитов. Не у всех животных случаются судороги в течение каждого периода наблюдения.Кроме того, самая высокая частота судорог приходится на пятый и шестой день после прививки. Мы используем модель TMEV для проверки эффективности новых противосудорожных препаратов против судорог, вызванных инфекцией. Анализы, исследующие коморбидные поведенческие изменения и электрофизиологические изменения, также могут быть оценены.Модель TMEV предоставила сообществу исследователей эпилепсии первую модель височной эпилепсии, вызванную инфекцией ЦНС, что позволило исследовать основные механизмы эпилептогенеза после заражения.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Передний мозг Электрофизиологические записи в личинки данио рерио

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

Создание модели мыши Зика вирус-индуцированной неврологических расстройств, используя стратегии внутримозговых инъекций: эмбриональные, у новорожденных и взрослых

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Объемный метод количественного определения церебрального спазм сосудов в мышиных модели субарахноидальное кровоизлияние

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Анализ нейронной активности и подключение с использованием внутричерепных ЭЭГ данных с программным обеспечением УСВ

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

Inducement and Evaluation of a Murine Model of Experimental Myopia

Побуждение и оценки мышиных модели экспериментальной близорукости

Murine model of myopia can be a powerful tool for myopia research because of the comparatively easy genetic manipulation. One way to induce myopia in ...

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

Поведенческий и физиологический анализ в модели эпилепсии рыбок данио

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

Мозг человека кровь интерфейс модель для изучения пересечения барьера патогенов или лекарства и их взаимодействия с мозгом

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

Analysis of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage with High Frequency Transcranial Duplex Ultrasound

Анализ церебрального спазма сосудов в мышиной модели субарахноидального кровоизлияния с помощью высокочастотного транскраниального дуплексного ультразвука

Cerebral vasospasm that occurs in the weeks after subarachnoid hemorrhage, a type of hemorrhagic stroke, contributes to delayed cerebral ischemia. A ...

A Behavioral Screen for Heat-Induced Seizures in Mouse Models of Epilepsy

Поведенческий экран для тепловых припадков в мышиных моделях эпилепсии

Transgenic mouse models have proved to be powerful tools in studying various aspects of human neurological disorders, including epilepsy. The ...

Preparation and Implantation of Electrodes for Electrically Kindling VGAT-Cre Mice to Generate a Model for Temporal Lobe Epilepsy

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique ...