Name: direct comparison of hyperspectral stimulated raman scattering and coherent anti-stokes raman scattering microscopy for chemical imaging
Uploaded: 2022-04-28T13:20:00
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Cette recherche a été soutenue par le fonds de démarrage du département de chimie de l’Université Purdue.

1. Configuration instrumentale pour l’imagerie CRS hyperspectrale
REMARQUE: La génération de signal CRS nécessite l’utilisation de lasers de haute puissance (c.-à-d. classe 3B ou classe 4). Les protocoles de sécurité doivent être respectés et l’équipement de protection individuelle (EPI) approprié doit être porté en tout temps lorsque vous travaillez à des puissances de pointe aussi élevées. Consultez la documentation appropriée avant l’expérimentation. ...

Le protocole présenté ici décrit la construction d’un microscope CRS multimodal et la comparaison directe entre CARS et l’imagerie SRS. Pour la construction du microscope, les étapes critiques sont le chevauchement spatial et temporel des faisceaux et l’optimisation de la taille des faisceaux. Il est recommandé d’utiliser un échantillon standard tel que le DMSO avant l’imagerie biologique pour optimiser le SNR et calibrer les décalages Raman. La comparaison directe entre les images CARS et SRS révèle q...

Le phénomène de diffusion Raman a été observé pour la première fois en 1928 par C. V. Raman1. Lorsqu’un photon incident interagit avec un échantillon, un événement de diffusion inélastique peut se produire spontanément, dans lequel le changement d’énergie du photon correspond à une transition vibratoire des espèces chimiques analysées. Ce processus ne nécessite pas l’utilisation d’une étiquette chimique, ce qui en fait un outil polyvalent et sans étiquette pour l’analyse chimique tout en minimisant la perturbation des échantillons. Malgré ses avantages, la diffusion Raman spontanée souffre d’une faible section de diffusion (généralement 10à 11 inférieure à la section transversale d’absorption infrarouge [IR]), ce qui nécessite de longs temps d’acquisition pour l’analyse2. Ainsi, la recherche d’une augmentation de la sensibilité du processus de diffusion Raman est essentielle pour pousser les technologies Raman à l’imagerie en temps réel.
Un moyen efficace d’améliorer considérablement la sensibilité de la diffusion Raman consiste à utiliser des processus de diffusion Raman cohérents (CRS), pour lesquels deux impulsions laser sont généralement utilisées pour exciter les transitions vibratoires moléculaires 3,4. Lorsque la différence d’énergie des photons entre les deux lasers correspond aux modes vibratoires des molécules de l’échantillon, de forts signaux Raman seront générés. Les deux procédés CRS les plus couramment utilisés pour l’imagerie sont la diffusion Raman anti-Stokes cohérente (CARS) et la diffusion Raman stimulée (SRS)5. Au cours des deux dernières décennies, les développements technologiques ont fait progresser les techniques de microscopie CARS et SRS pour devenir des outils puissants pour la quantification sans étiquette et l’élucidation des changements chimiques dans les échantillons biologiques.
L’imagerie chimique par microscopie CARS peut être datée de 1982, lorsque le balayage laser a été appliqué pour la première fois pour acquérir des images CARS, démontré par Duncan et al6. La modernisation de la microscopie CARS a été considérablement accélérée après les vastes applications de la microscopie à fluorescence multiphotonique à balayage laser7. Les premiers travaux du groupe Xie utilisant des lasers à haut taux de répétition ont permis à CARS de devenir une plate-forme d’imagerie chimique à grande vitesse, sans étiquette, pour la caractérisation de molécules dans des échantillons biologiques 8,9,10. L’un des principaux problèmes de l’imagerie CARS est la présence d’un arrière-plan non résonant, ce qui réduit le contraste de l’image et déforme le spectre Raman. De nombreux efforts ont été faits pour réduire le fond non résonant 11,12,13,14,15 ou pour extraire les signaux Raman résonnants des spectres CARS 16,17. Une autre avancée qui a considérablement fait progresser le domaine est l’imagerie hyperspectrale CARS, qui permet une cartographie spectrale à chaque pixel d’image avec une sélectivité chimique améliorée 18,19,20,21.
La diffusion Raman stimulée (SRS) est une technologie d’imagerie plus jeune que CARS, bien qu’elle ait été découverte plus tôt22. En 2007, la microscopie SRS a été rapportée en utilisant une source laser à faible taux de répétition23. Bientôt, plusieurs groupes ont démontré l’imagerie SRS à grande vitesse en utilisant des lasers à haut taux de répétition 24,25,26. L’un des principaux avantages de la microscopie SRS par rapport à CARS est l’absence du fond non résonant27, bien que d’autres arrière-plans tels que la modulation de phase croisée (XPM), l’absorption transitoire (TA), l’absorption à deux photons (TPA) et l’effet photothermique (PT) puissent se produire avec SRS28. De plus, le signal SRS et la concentration de l’échantillon ont des relations linéaires, contrairement à CARS, qui a une dépendance quadratique signal-concentration29. Cela simplifie la quantification chimique et le démélange spectral. Le SRS multicolore et hyperspectral a évolué sous différentes formes 30,31,32,33,34,35,36, la focalisation spectrale étant l’une des approches les plus populaires pour l’imagerie chimique 37,38.
Cars et SRS nécessitent la focalisation de la pompe et des faisceaux laser Stokes sur l’échantillon pour correspondre à la transition vibratoire des molécules pour l’excitation du signal. Les microscopes CARS et SRS ont également beaucoup en commun. Cependant, la physique sous-jacente à ces deux processus et les détections de signaux impliquées dans ces technologies de microscopie présentent des disparités 3,39. CARS est un processus paramétrique qui n’a pas de couplage d’énergie photon-molécule net3. Le SRS, cependant, est un processus non paramétrique et contribue au transfert d’énergie entre les photons et les systèmes moléculaires27. Dans CARS, un nouveau signal à la fréquence anti-Stokes est généré, tandis que SRS se manifeste par le transfert d’énergie entre la pompe et les faisceaux laser Stokes.
Le signal CARS satisfait Eq (1)28.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq1v2.png" style="margin: auto;"> (1)
Pendant ce temps, le signal SRS peut être écrit comme Eq (2) 28.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq2v2.png" style="margin: auto;">(2)
Ici, Ip, Is, ICARS et ΔISRS sont les intensités du faisceau de pompe, du faisceau de Stokes, du signal CARS et des signaux SRS, respectivement. χ(3) est la susceptibilité optique non linéaire de troisième ordre de l’échantillon et est une valeur complexe composée de parties réelles et imaginaires.
Ces équations expriment les profils spectraux et la dépendance signal-concentration de CARS et SRS. Les différences physiques se traduisent par des schémas de détection disparates pour ces deux technologies de microscopie. La détection du signal dans CARS implique généralement la séparation spectrale des photons nouvellement générés et la détection à l’aide d’un tube photomultiplicateur (PMT) ou d’un dispositif à couplage de charge (CCD); pour srS, l’échange d’énergie entre la pompe et les faisceaux de Stokes est généralement mesuré par modulation d’intensité à grande vitesse à l’aide d’un modulateur optique et démodulation à l’aide d’une photodiode () associée à un amplificateur de verrouillage.
Bien que de nombreux développements et applications technologiques aient été publiés ces dernières années dans les domaines CARS et SRS, aucune comparaison systématique des deux techniques CRS n’a été effectuée sur la même plate-forme, en particulier pour la microscopie hyperspectrale CARS et SRS. Des comparaisons directes de la sensibilité, de la résolution spatiale, de la résolution spectrale et des capacités de séparation chimique permettraient aux biologistes de choisir la meilleure modalité pour la quantification chimique. Dans ce protocole, des étapes détaillées pour construire une plate-forme d’imagerie multimodale avec des modalités hyperspectrales CARS et SRS basées sur un système laser femtoseconde et une focalisation spectrale sont fournies. Les deux techniques ont été comparées dans le sens avant pour la résolution spectrale, la sensibilité de détection, la résolution spatiale et les contrastes d’imagerie des cellules.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2D galvo scanner set</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acousto-optic modulator</td>
			<td>Isomet</td>
			<td>M1205-P80L-0.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AOM driver</td>
			<td>Isomet</td>
			<td>532B-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCle 6363</td>
			<td>Custom ordered filter (980 sp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delay stage</td>
			<td>Zaber</td>
			<td>X-LSM050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>151882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for beam combination</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DMLP1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for signal separation</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF776-Di01-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MiliporeSigma</td>
			<td>200-664-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIA PaCa 2 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtosecond laser system</td>
			<td>Spectral Physics</td>
			<td>InSightX3+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter for CARS</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>AT655/30m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter for SRS</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET980sp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>Rigol</td>
			<td>DG1022Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods</td>
			<td>Lattice Electro Optics</td>
			<td>SF-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half-wave plate</td>
			<td>Newport</td>
			<td>10RP02-51; 10RP02-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW 2020</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>This is the image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Zurich Instrument</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope housing</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin Pro 2019b</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>This is the spectral fitting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TBS2204B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>S3994-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT detector</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422P-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT voltage amplifier</td>
			<td>Advanced Research Instrument Corp.</td>
			<td>PMT4V3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing beamsplitter cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PBS255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal block</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>BNC-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct comparison of hyperspectral stimulated raman scattering and coherent anti-stokes raman scattering microscopy for chemical imaging

La diffusion Raman stimulée (SRS) et la microscopie cohérente anti-diffusion Raman (CARS) sont les technologies d’imagerie par diffusion Raman cohérente les plus largement utilisées. L’imagerie hyperspectrale SRS et CARS offre des informations spectrales Raman à chaque pixel, ce qui permet une meilleure séparation des différentes compositions chimiques. Bien que les deux techniques nécessitent deux lasers d’excitation, leurs schémas de détection de signal et leurs propriétés spectrales sont très différents. L’objectif de ce protocole est d’effectuer à la fois l’imagerie hyperspectrale SRS et CARS sur une seule plate-forme et de comparer les deux techniques de microscopie pour l’imagerie de différents échantillons biologiques. La méthode de focalisation spectrale est utilisée pour acquérir des informations spectrales à l’aide de lasers femtosecondes. En utilisant des échantillons chimiques standard, la sensibilité, la résolution spatiale et la résolution spectrale de SRS et CARS dans les mêmes conditions d’excitation (c.-à-d. puissance à l’échantillon, temps de séjour en pixels, lentille d’objectif, énergie d’impulsion) sont comparées. Les contrastes d’imagerie de CARS et SRS pour les échantillons biologiques sont juxtaposés et comparés. La comparaison directe des performances CARS et SRS permettrait une sélection optimale de la modalité d’imagerie chimique.

Comparaisons de la résolution spectrale La figure 2 compare la résolution spectrale de la microscopie hyperspectrale SRS (Figure 2A) et CARS (Figure 2B) à l’aide d’un échantillon de DMSO. Pour le spectre SRS, deux fonctions lorentziennes (voir l’étape 2.3 du protocole) ont été appliquées pour s’adapter au spectre, et une résolution de 14,6 cm-1 a été obtenue en utilisant le pic de 2 ...

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Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging

Cet article compare directement la résolution, la sensibilité et les contrastes d’imagerie de la diffusion Raman stimulée (SRS) et de la diffusion Raman anti-Stokes cohérente (CARS) intégrées dans la même plate-forme de microscope. Les résultats montrent que CARS a une meilleure résolution spatiale, SRS donne de meilleurs contrastes et une meilleure résolution spectrale, et les deux méthodes ont une sensibilité similaire.

Comparaison directe de la diffusion Raman stimulée hyperspectrale et de la microscopie à diffusion Raman anti-Stokes cohérente pour l’imagerie chimique

Stimulated Raman scattering (SRS) and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy are the most widely used coherent Raman scattering imaging ...

Ce protocole compare les deux techniques de diffusion Raman cohérente hyperspectrale les plus largement utilisées, y compris la diffusion Raman anti-Stokes cohérente et les processus de diffusion Raman stimulés, ce qui permet aux biologistes de choisir la meilleure modalité d’imagerie pour leurs applications biologiques. En utilisant les signatures vibratoires intrinsèques, la spectroscopie Raman cohérente est capable de cartographier des informations chimiques et des échantillons biologiques sans avoir besoin d’un marquage exogène. La microscopie Raman cohérente a élargi notre compréhension du métabolisme cellulaire, de la cartographie, de la distribution des médicaments, du diagnostic des maladies et de la quantification des changements chimiques.Il s’agit d’une technique qui nécessite une formation suffisante en optique et en spectroscopie. Je recommanderais de lire quelques articles de synthèse et d’être formé par un expert avant d’utiliser cette technique. Pour commencer, préparez les diapositives d’imagerie en plaçant un morceau de ruban adhésif double face sur un couvercle et en découpant une petite forme rectangulaire du ruban adhésif au milieu du ruban adhésif pour créer une zone ouverte pour l’échantillon à placer.Pipette 1 à 2 microlitres de DMSO pur et distribuer la gouttelette au centre de la vacance. Placez délicatement le glissement du couvercle supérieur et placez doucement les bords des glissières du couvercle pour sceller la chambre tout en vous assurant que l’échantillon de DMSO n’entre pas en contact avec les bords du ruban adhésif. Pour les expériences de sensibilité, préparer des dilutions en série de DMSO dans de l’oxyde de deutérium pour donner une plage de concentration de 50 à 0%Prendre 1 à 2 microlitres de chaque solution et préparer des échantillons pressés comme démontré précédemment.Placez l’échantillon sur l’étage du microscope et ajoutez de l’eau ou de l’huile d’immersion si nécessaire pour la lentille de l’objectif ou le condenseur. Déplacez correctement le bord de la gouttelette DMSO dans le champ de vision et ajustez l’objectif pour obtenir la meilleure mise au point, puis centrez le condenseur à l’aide de la méthode d’éclairage Kohler et ouvrez complètement le diaphragme sur le condensateur. Ensuite, réglez la longueur d’onde du faisceau de la pompe à 800 nanomètres pour cibler le pic CH3 du nombre d’onde 2913 et réglez la puissance de la pompe et du faisceau stokes à environ 30 milliwatts avant le microscope en ajustant la demi-plaque d’onde.Pour SRS, réglez le gain de l’amplificateur de verrouillage à environ 10 avec une constante de temps de 7 microsecondes, en vous assurant que la constante de temps est inférieure au temps de séjour en pixels. Définissez les paramètres d’acquisition d’image et le logiciel d’acquisition à l’aide d’un nombre de pixels de 200 par 200 avec une taille de numérisation d’environ 100 x 100 micromètres carrés, en vous assurant que l’image contient à la fois la gouttelette de DMSO et une zone vide, puis numérisez l’échantillon et vérifiez l’image sur l’écran de l’ordinateur. Ensuite, scannez l’image de retard motorisée dans le faisceau de la pompe Stokes tout en surveillant les images en temps réel et scannez le délai jusqu’à ce que le signal soit maximisé.Déplacez la gouttelette DMSO pour couvrir tout le champ de vision et vérifiez si le signal CC maximal est centré dans l’image car le signal dépend du faisceau de la pompe. Ajustez soit la position du faisceau de la pompe via un miroir, soit le décalage de tension dans le logiciel d’imagerie. Après l’optimisation DC, ajustez les miroirs de faisceau Stokes jusqu’à ce que le signal AC soit maximisé en ajustant la valeur de seuil pour afficher une saturation d’environ 50% tout en vérifiant que la saturation est centrée dans l’image.Sinon, affinez les miroirs uniquement dans le faisceau Stokes et surveillez le signal pendant l’alignement en tant que rétroaction en temps réel sur la qualité de l’alignement. Pour l’analyse SNR, ouvrez le logiciel ImageJ et importez l’exemple de fichier texte DMSO enregistré en cliquant sur Fichier, puis sur Importer, suivi des options Image texte et Ouvrir du menu déroulant. Une fois l’image importée, appuyez sur Control Shift C pour afficher la fonction Luminosité et contraste, puis appuyez sur le bouton Auto de la fonction Luminosité et contraste jusqu’à ce que la région de l’échantillon DMSO apparaisse saturée pour trouver le signal d’échantillon maximal.Ensuite, cliquez sur l’outil de sélection Ovale sur l’interface ImageJ et mettez en surbrillance une petite zone de la région DMSO saturée. Après la mise en surbrillance, appuyez sur M pour mesurer la moyenne et l’écart-type de la zone sélectionnée. Pour mesurer l’arrière-plan, ajustez les barres dans la fonction Luminosité et contraste jusqu’à ce que le signal de la région vide puisse être observé, puis cliquez sur la sélection Ovale et mettez en surbrillance une région de l’arrière-plan, en vous assurant que la région sélectionnée ne contient pas de DMSO.Ensuite, appuyez sur M pour mesurer les statistiques de la zone sélectionnée. Ensuite, calculez le SNR comme démontré précédemment en mesurant la valeur moyenne du bruit et la valeur moyenne du signal ainsi que l’écart type. Pour traiter les images CRS hyperspectrales, importez le fichier texte en cliquant sur les options Fichier, puis Importer, Image texte et Ouvrir dans le menu déroulant.Une fois importé, cliquez sur Image, puis sur Piles, puis sur Outils et Options Montage à pile pour convertir le fichier en pile d’images, puis faites défiler le montage jusqu’à ce que le premier pic DMSO soit visible. Sélectionnez une région sur le DMSO et cliquez sur Image, puis sur les options Empiler et Tracer le profil de l’axe Z pour tracer l’intensité par rapport au spectre du nombre d’images. Ensuite, cliquez sur Liste et copiez les données de profil pour extraire les données spectrales brutes.Pour convertir le spectre récupéré en unités de fréquence, effectuez une régression linéaire en utilisant l’étirement CH symétrique et asymétrique du DMSO et leurs nombres de trames correspondants. La résolution spectrale du DMSO a été mesurée à l’aide d’une microscopie hyperspectrale SRS et CARS, qui montrent une résolution de 14,6 et 17,1 nombres d’onde respectivement, indiquant que SRS a une meilleure résolution spectrale. Les spectres SRS DMSO ont été obtenus à des concentrations de 0,1 et 0,01% dans lesquelles le pic au nombre d’onde 2913 peut être résolu dans le premier, mais pas dans le second, indiquant que la limite de détection est comprise entre 0,1 et 0,01% DMSO.Les spectres CARS récupérés en phase montrent que le pic du nombre d’onde DMSO 2913 peut être clairement résolu pour le 0,1% DMSO, mais pas pour le 0,01% indiquant une limite de détection entre ces deux concentrations. Les profils d’intensité SRS et CARS d’une cellule MIA PaCA-2 ont démontré que le signal SRS donnait une résolution de 398,6 nanomètres, tandis que le signal CARS donnait une résolution 1,2 fois meilleure de 330,3 nanomètres. Les images SRS et CARS des cellules MIA PaCa-2 à différentes positions de retard optique montrent les signaux les plus forts avec des gouttelettes lipidiques comme points lumineux pour SRS, tandis que CARS ont des contrastes beaucoup plus réduits.Cependant, un décalage de 37 numéros d’onde vers le rouge dans la focalisation spectrale a amélioré les contrastes lipidiques pour SRS et CARS. Les spectres SRS montrent un signal beaucoup plus fort à 2850 nombre d’onde pour les gouttelettes lipidiques que les autres organites, tandis que les spectres CARS montrent un petit décalage vers le rouge. Pour optimiser le signal de diffusion Raman cohérent, trouvez d’abord la mise au point de l’échantillon, puis réglez le retard optique et enfin, ajustez les miroirs jusqu’à ce qu’un maximum soit atteint.D’autres technologies de pompe-sonde, telles que l’absorption transitoire, sont intrinsèquement intégrées à la plate-forme CRS. Cette technologie est très puissante pour mesurer la cinétique d’absorption de fortes molécules non fluorescentes absorbant la lumière. Cette technique permet aux chercheurs de visualiser de petites molécules sans étiquette avec une activité cellulaire chimique élevée.Il permet également aux chercheurs de voir les changements dans le métabolisme des lipides, la dynamique intracellulaire et la distribution des médicaments.

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