Name: direct comparison of hyperspectral stimulated raman scattering and coherent anti-stokes raman scattering microscopy for chemical imaging
Uploaded: 2022-04-28T13:20:00
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Diese Forschung wurde vom Startup-Fonds des Purdue University Department of Chemistry unterstützt.

1. Instrumenteller Aufbau für die hyperspektrale CRS-Bildgebung
HINWEIS: Die Erzeugung von CRS-Signalen erfordert die Verwendung von Hochleistungslasern (d. h. Klasse 3B oder Klasse 4). Sicherheitsprotokolle müssen beachtet werden, und bei Arbeiten mit solch hohen Spitzenleistungen muss jederzeit eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) getragen werden. Konsultieren Sie die ordnungsgemäße Dokumentation, bevor Sie experimentieren. Dieses Protokoll konzentriert sich...

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt den Aufbau eines multimodalen CRS-Mikroskops und den direkten Vergleich zwischen CARS- und SRS-Bildgebung. Für die Mikroskopkonstruktion sind die kritischen Schritte räumliche und zeitliche Strahlüberlappung und Strahlgrößenoptimierung. Es wird empfohlen, vor der biologischen Bildgebung eine Standardprobe wie DMSO zur Optimierung von SNR und Kalibrierung von Raman-Verschiebungen zu verwenden. Der direkte Vergleich zwischen CARS- und SRS-Bildern zeigt, dass CARS eine bessere...

Das Raman-Streuungsphänomen wurde erstmals 1928 von C. V. Raman1 beobachtet. Wenn ein einfallendes Photon mit einer Probe interagiert, kann spontan ein inelastisches Streuereignis auftreten, bei dem die Energieänderung des Photons mit einem Schwingungsübergang der analysierten chemischen Spezies übereinstimmt. Dieser Prozess erfordert nicht die Verwendung eines chemischen Tags und ist somit ein vielseitiges, etikettenfreies Werkzeug für die chemische Analyse bei gleichzeitiger Minimierung der Probenstörung. Trotz ihrer Vorteile leidet die spontane Raman-Streuung unter einem geringen Streuquerschnitt (typischerweise 1011 niedriger als der Infrarot-Absorptionsquerschnitt [IR]), was lange Erfassungszeiten für die Analyseerforderlich macht 2. Daher ist das Bestreben, die Empfindlichkeit des Raman-Streuprozesses zu erhöhen, unerlässlich, um Raman-Technologien für die Echtzeit-Bildgebung voranzutreiben.
Eine effektive Möglichkeit, die Empfindlichkeit der Raman-Streuung erheblich zu erhöhen, sind kohärente Raman-Streuprozesse (CRS), für die typischerweise zwei Laserpulse verwendet werden, um molekulare Schwingungsübergängeanzuregen 3,4. Wenn die Photonen-Energiedifferenz zwischen den beiden Lasern mit den Schwingungsmoden von Probenmolekülen übereinstimmt, werden starke Raman-Signale erzeugt. Die beiden am häufigsten verwendeten CRS-Verfahren für die Bildgebung sind kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) und stimulierte Raman-Streuung (SRS)5. In den letzten zwei Jahrzehnten haben technologische Entwicklungen CARS- und SRS-Mikroskopietechniken zu leistungsfähigen Werkzeugen für die markierungsfreie Quantifizierung und Aufklärung chemischer Veränderungen in biologischen Proben gemacht.
Die chemische Bildgebung durch CARS-Mikroskopie kann auf das Jahr 1982 datiert werden, als Laserscanning zum ersten Mal angewendet wurde, um CARS-Bilder zu erfassen, demonstriert von Duncan et al6. Die Modernisierung der CARS-Mikroskopie wurde nach den breiten Anwendungen der Laser-Scanning-Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopiestark beschleunigt 7. Frühe Arbeiten der Xie-Gruppe, die Laser mit hoher Wiederholungsrate verwenden, haben CARS zu einer schnellen, markierungsfreien, chemischen Bildgebungsplattform für die Charakterisierung von Molekülen in biologischen Probenentwickelt 8,9,10. Eines der Hauptprobleme für die CARS-Bildgebung ist das Vorhandensein eines nicht resonanten Hintergrunds, der den Bildkontrast reduziert und das Raman-Spektrum verzerrt. Es wurden viele Anstrengungen unternommen, um entweder den nicht resonanten Hintergrund 11,12,13,14,15 zu reduzieren oder resonante Raman-Signale aus den CARS-Spektren 16,17 zu extrahieren. Ein weiterer Fortschritt, der das Feld stark vorangebracht hat, ist die hyperspektrale CARS-Bildgebung, die eine spektrale Kartierung an jedem Bildpixel mit verbesserter chemischer Selektivität 18,19,20,21 ermöglicht.
Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) ist eine jüngere Bildgebungstechnologie als CARS, obwohl sie früher entdeckt wurde22. Im Jahr2007 wurde berichtet, dass die SRS-Mikroskopie eine Laserquelle mit niedriger Wiederholungsrate 23 verwendete. Bald demonstrierten mehrere Gruppen eine Hochgeschwindigkeits-SRS-Bildgebung mit Lasern mit hoher Wiederholungsrate24,25,26. Einer der Hauptvorteile der SRS-Mikroskopie gegenüber CARS ist das Fehlen des nicht-resonanten Hintergrunds27, obwohl andere Hintergründe wie Kreuzphasenmodulation (XPM), transiente Absorption (TA), Zwei-Photonen-Absorption (TPA) und photothermischer (PT) -Effekt bei SRS28 auftreten können. Darüber hinaus haben das SRS-Signal und die Probenkonzentration lineare Beziehungen, im Gegensatz zu CARS, das eine quadratische Signalkonzentrationsabhängigkeitaufweist 29. Dies vereinfacht die chemische Quantifizierung und spektrale Entmischung. Mehrfarbiges und hyperspektrales SRS hat sich in verschiedenen Formenentwickelt 30,31,32,33,34,35,36, wobei die spektrale Fokussierung einer der beliebtesten Ansätze für die chemische Bildgebung ist 37,38.
Sowohl CARS als auch SRS erfordern die Fokussierung der Pumpe und der Stokes-Laserstrahlen auf die Probe, um den Schwingungsübergang der Moleküle für die Signalanregung anzupassen. Auch CARS und SRS-Mikroskope haben viel gemeinsam. Die Physik, die diesen beiden Prozessen zugrunde liegt, und die Signaldetektionen, die an diesen Mikroskopietechnologien beteiligt sind, weisen jedoch Disparitätenauf 3,39. CARS ist ein parametrischer Prozess, der keine Netto-Photonen-Molekül-Energiekopplunghat 3. SRS ist jedoch ein nichtparametrischer Prozess und trägt zum Energietransfer zwischen Photonen und molekularen Systemen bei27. In CARS wird ein neues Signal bei Anti-Stokes-Frequenz erzeugt, während sich SRS als Energieübertragung zwischen der Pumpe und den Stokes-Laserstrahlen manifestiert.
CARS Signal erfüllt Eq (1)28.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq1v2.png" style="margin: auto;"> (1)
In der Zwischenzeit kann das SRS-Signal als Eq (2) 28 geschrieben werden.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq2v2.png" style="margin: auto;">(2)
Hier sind I p, I s, I CARS und ΔISRS die Intensitäten des Pumpenstrahls, des Stokes-Strahls, des CARS-Signals bzw. der SRS-Signale. χ(3) ist die nichtlineare optische Suszeptibilität der Probe dritter Ordnung und ist ein komplexer Wert, der sich aus realen und imaginären Teilen zusammensetzt.
Diese Gleichungen drücken die Spektralprofile und die Signalkonzentrationsabhängigkeit von CARS und SRS aus. Unterschiede in der Physik führen zu unterschiedlichen Nachweisschemata für diese beiden Mikroskopietechnologien. Die Signaldetektion in CARS beinhaltet in der Regel die spektrale Trennung neu erzeugter Photonen und die Detektion mit einer Photomultiplierröhre (PMT) oder einem ladungsgekoppelten Gerät (CCD); Für SRS wird der Energieaustausch zwischen der Pumpe und Stokes-Strahlen normalerweise durch Hochgeschwindigkeitsintensitätsmodulation mit einem optischen Modulator und Demodulation mit einer Photodiode (PD) in Verbindung mit einem Lock-in-Verstärker gemessen.
Obwohl in den letzten Jahren viele technologische Entwicklungen und Anwendungen sowohl im CARS- als auch im SRS-Bereich veröffentlicht wurden, wurden keine systematischen Vergleiche der beiden CRS-Techniken auf derselben Plattform durchgeführt, insbesondere für die hyperspektrale CARS- und SRS-Mikroskopie. Direkte Vergleiche in Bezug auf Empfindlichkeit, räumliche Auflösung, spektrale Auflösung und chemische Trennfähigkeiten würden es Biologen ermöglichen, die beste Modalität für die chemische Quantifizierung auszuwählen. In diesem Protokoll werden detaillierte Schritte zum Aufbau einer multimodalen Bildgebungsplattform mit hyperspektralen CARS- und SRS-Modalitäten auf der Grundlage eines Femtosekundenlasersystems und einer spektralen Fokussierung bereitgestellt. Die beiden Techniken wurden in Vorwärtsrichtung für spektrale Auflösung, Detektionsempfindlichkeit, räumliche Auflösung und bildgebende Kontraste von Zellen verglichen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2D galvo scanner set</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acousto-optic modulator</td>
			<td>Isomet</td>
			<td>M1205-P80L-0.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AOM driver</td>
			<td>Isomet</td>
			<td>532B-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCle 6363</td>
			<td>Custom ordered filter (980 sp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delay stage</td>
			<td>Zaber</td>
			<td>X-LSM050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>151882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for beam combination</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DMLP1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for signal separation</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF776-Di01-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MiliporeSigma</td>
			<td>200-664-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIA PaCa 2 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtosecond laser system</td>
			<td>Spectral Physics</td>
			<td>InSightX3+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter for CARS</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>AT655/30m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter for SRS</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET980sp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>Rigol</td>
			<td>DG1022Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods</td>
			<td>Lattice Electro Optics</td>
			<td>SF-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half-wave plate</td>
			<td>Newport</td>
			<td>10RP02-51; 10RP02-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW 2020</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>This is the image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Zurich Instrument</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope housing</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin Pro 2019b</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>This is the spectral fitting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TBS2204B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>S3994-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT detector</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422P-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT voltage amplifier</td>
			<td>Advanced Research Instrument Corp.</td>
			<td>PMT4V3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing beamsplitter cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PBS255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal block</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>BNC-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct comparison of hyperspectral stimulated raman scattering and coherent anti-stokes raman scattering microscopy for chemical imaging

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) und die kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) sind die am weitesten verbreiteten kohärenten Raman-Streubildgebungstechnologien. Hyperspektrale SRS- und CARS-Bildgebung bieten Raman-Spektralinformationen an jedem Pixel, was eine bessere Trennung verschiedener chemischer Zusammensetzungen ermöglicht. Obwohl beide Techniken zwei Anregungslaser erfordern, sind ihre Signaldetektionsschemata und spektralen Eigenschaften sehr unterschiedlich. Das Ziel dieses Protokolls ist es, sowohl hyperspektrale SRS- als auch CARS-Bildgebung auf einer einzigen Plattform durchzuführen und die beiden Mikroskopietechniken zur Abbildung verschiedener biologischer Proben zu vergleichen. Die Spektralfokussierungsmethode wird verwendet, um Spektralinformationen mit Femtosekundenlasern zu erfassen. Durch die Verwendung chemischer Standardproben werden die Empfindlichkeit, die räumliche Auflösung und die spektrale Auflösung von SRS und CARS unter den gleichen Anregungsbedingungen (d. h. Leistung an der Probe, Pixelverweilzeit, Objektivlinse, Pulsenergie) verglichen. Die bildgebenden Kontraste von CARS und SRS für biologische Proben werden gegenübergestellt und verglichen. Der direkte Vergleich von CARS- und SRS-Leistungen würde eine optimale Auswahl der Modalität für die chemische Bildgebung ermöglichen.

Vergleiche der spektralen Auflösung Abbildung 2 vergleicht die spektrale Auflösung der hyperspektralen SRS- (Abbildung 2A) und CARS- (Abbildung 2B) Mikroskopie unter Verwendung einer DMSO-Probe. Für das SRS-Spektrum wurden zwei Lorentzsche Funktionen (siehe Protokollschritt 2.3) angewendet, um in das Spektrum zu passen, und eine Auflösung von 14,6 cm-1 wurde unter Verwendung des 2.913 cm-1-Pea...

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Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging

Dieses Papier vergleicht direkt die Auflösung, Empfindlichkeit und Bildkontraste der stimulierten Raman-Streuung (SRS) und der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS), die in dieselbe Mikroskopplattform integriert sind. Die Ergebnisse zeigen, dass CARS eine bessere räumliche Auflösung hat, SRS bessere Kontraste und spektrale Auflösung liefert und beide Methoden eine ähnliche Empfindlichkeit aufweisen.

Direkter Vergleich der hyperspektralen stimulierten Raman-Streuung und der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streumikroskopie für die chemische Bildgebung

Stimulated Raman scattering (SRS) and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy are the most widely used coherent Raman scattering imaging ...

Dieses Protokoll vergleicht die beiden am weitesten verbreiteten hyperspektralen kohärenten Raman-Streutechniken, einschließlich der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung und der stimulierten Raman-Streuprozesse, und dies ermöglicht es den Biologen, die beste Bildgebungsmodalität für ihre biologischen Anwendungen zu wählen. Mithilfe der intrinsischen Schwingungssignaturen ist die kohärente Raman-Spektroskopie in der Lage, chemische Informationen und biologische Proben zu kartieren, ohne dass eine exogene Markierung erforderlich ist. Die kohärente Raman-Mikroskopie hat unser Verständnis des Zellstoffwechsels, der Kartierung, der Arzneimittelverteilung, der Krankheitsdiagnostik und der Quantifizierung chemischer Veränderungen erweitert.Dies ist eine Technik, die eine ausreichende Ausbildung sowohl in der Optik als auch in der Spektroskopie erfordert. Ich würde empfehlen, ein paar Übersichtsartikel zu lesen und von einem Experten geschult zu werden, bevor ich diese Technik anwende. Bereiten Sie zunächst die Bildfolien vor, indem Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband auf einen Deckzettel legen und eine kleine rechteckige Form des Bandes aus der Mitte des Bandes ausschneiden, um einen offenen Bereich für die zu platzierende Probe zu schaffen.Pipette 1 bis 2 Mikroliter reines DMSO und dosieren Sie das Tröpfchen in der Mitte des Leerstands. Platzieren Sie den oberen Deckschlitten vorsichtig und platzieren Sie vorsichtig die Kanten der Abdeckschlitten, um die Kammer abzudichten, während Sie sicherstellen, dass die DMSO-Probe nicht mit den Rändern des Bandes in Berührung kommt. Für Sensitivitätsexperimente bereiten Sie serielle Verdünnungen von DMSO in Deuteriumoxid vor, um einen Konzentrationsbereich von 50 bis 0% zu erhalten. Nehmen Sie 1 bis 2 Mikroliter jeder Lösung und bereiten Sie gepresste Proben vor, wie zuvor gezeigt.Legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch und fügen Sie bei Bedarf Wasser oder Tauchöl für die Objektivlinse oder den Kondensator hinzu. Bewegen Sie den Rand des DMSO-Tröpfchens ordnungsgemäß im Sichtfeld und stellen Sie die Objektivlinse für den besten Fokus ein, zentrieren Sie dann den Kondensator mit der Kohler-Beleuchtungsmethode und öffnen Sie die Membran am Kondensator vollständig. Als nächstes stimmen Sie die Wellenlänge des Pumpenstrahls auf 800 Nanometer ab, um die 2913-Wellenzahl CH3-Spitze anzuvisieren, und stellen Sie die Leistung sowohl der Pumpe als auch des Stokes-Strahls auf etwa 30 Milliwatt vor dem Mikroskop ein, indem Sie die Halbwellenplatte einstellen.Stellen Sie für SRS die Lock-in-Verstärkerverstärkung auf etwa 10 mit einer Zeitkonstante von 7 Mikrosekunden ein, um sicherzustellen, dass die Zeitkonstante kleiner ist als die Pixelverweildauer. Stellen Sie die Bildaufnahmeparameter und die Erfassungssoftware mit einer Pixelzahl von 200 x 200 mit einer Scangröße von etwa 100 x 100 Quadratmikrometern ein, stellen Sie sicher, dass das Bild sowohl das DMSO-Tröpfchen als auch einen leeren Bereich enthält, scannen Sie dann die Probe und überprüfen Sie das Bild auf dem Computerbildschirm. Als nächstes scannen Sie das motorisierte Verzögerungsbild im Stokes-Pumpenstrahl, während Sie die Echtzeitbilder überwachen, und scannen Sie über die Verzögerung, bis das Signal maximiert ist.Bewegen Sie den DMSO-Tropfen, um das gesamte Sichtfeld abzudecken, und prüfen Sie, ob das DC-Signalmaximum im Bild zentriert ist, da das Signal pumpenstrahlabhängig ist. Stellen Sie entweder die Position des Pumpenstrahls über einen Spiegel oder den Spannungsversatz in der Bildgebungssoftware ein. Passen Sie nach der DC-Optimierung die Stokes-Strahlspiegel an, bis das AC-Signal maximiert ist, indem Sie den Schwellenwert so einstellen, dass eine Sättigung von etwa 50 % angezeigt wird, während Sie überprüfen, ob die Sättigung im Bild zentriert ist.Wenn nicht, stimmen Sie die Spiegel nur im Stokes-Strahl ab und überwachen Sie das Signal während der Ausrichtung als Echtzeit-Feedback über die Qualität der Ausrichtung. Öffnen Sie für die SNR-Analyse die ImageJ-Software und importieren Sie die gespeicherte DMSO-Beispieltextdatei, indem Sie auf Datei, dann auf Importieren und anschließend auf die Optionen Textbild und Öffnen aus dem Dropdown-Menü klicken. Sobald das Bild importiert wurde, drücken Sie die Strg-Umschalttaste C, um die Helligkeits- und Kontrastfunktion aufzurufen, und drücken Sie dann die Auto-Taste in der Helligkeits- und Kontrastfunktion, bis der Bereich des DMSO-Samples gesättigt erscheint, um das maximale Sample-Signal zu finden.Klicken Sie anschließend auf der ImageJ-Benutzeroberfläche auf das Auswahlwerkzeug "Oval" und markieren Sie einen kleinen Bereich des gesättigten DMSO-Bereichs. Drücken Sie nach dem Markieren M, um den Mittelwert und die Standardabweichung des ausgewählten Bereichs zu messen. Um den Hintergrund zu messen, passen Sie die Balken in der Helligkeits- und Kontrastfunktion an, bis das Signal des leeren Bereichs beobachtet werden kann, klicken Sie dann auf die Option "Oval" und markieren Sie einen Bereich des Hintergrunds, um sicherzustellen, dass der ausgewählte Bereich kein DMSO enthält.Drücken Sie anschließend M, um die Statistiken des ausgewählten Bereichs zu messen. Als nächstes berechnen Sie die SNR wie zuvor gezeigt, indem Sie den Rauschmittelwert und den Signalmittelwert zusammen mit der Standardabweichung messen. Um die hyperspektralen CRS-Bilder zu verarbeiten, importieren Sie die Textdatei, indem Sie im Dropdown-Menü auf Datei und dann auf Importieren, Textbild und Öffnen klicken.Klicken Sie nach dem Import auf Image, dann auf Stacks, gefolgt von Tools und Montage to Stack-Optionen, um die Datei in einen Image-Stack zu konvertieren, und scrollen Sie dann durch die Montage, bis der erste DMSO-Peak sichtbar ist. Wählen Sie einen Bereich auf dem DMSO aus und klicken Sie auf Bild, gefolgt von den Optionen Stapel und Z-Achsenprofil plotten, um das Spektrum der Intensität im Vergleich zur Bildzahl darzustellen. Klicken Sie anschließend auf Liste und kopieren Sie die Profildaten, um die Spektralrohdaten zu extrahieren.Um das wiedergewonnene Spektrum in Frequenzeinheiten umzuwandeln, führen Sie eine lineare Regression durch, indem Sie die symmetrische und asymmetrische CH verwenden, die sich von DMSO und den entsprechenden Bildnummern erstreckt. Die spektrale Auflösung des DMSO wurde mit einer hyperspektralen SRS- und CARS-Mikroskopie gemessen, die eine Auflösung von 14,6 bzw. 17,1 Wellenzahl zeigen, was darauf hindeutet, dass SRS eine bessere spektrale Auflösung hat. Die DMSO-SRS-Spektren wurden bei Konzentrationen von 0,1 und 0,01% erhalten, in denen der Peak bei der Wellenzahl 2913 in der ersten, aber nicht in der letzteren aufgelöst werden kann, was darauf hinweist, dass die Nachweisgrenze zwischen 0,1 und 0,01% DMSO liegt.Die phasenabgerufenen CARS-Spektren zeigen, dass der DMSO 2913-Wellenzahl-Peak für die 0,1%DMSO eindeutig aufgelöst werden kann, aber nicht für die 0,01%, die eine Nachweisgrenze zwischen diesen beiden Konzentrationen anzeigt. SRS- und CARS-Intensitätsprofile einer MIA PaCA-2-Zelle zeigten, dass das SRS-Signal eine Auflösung von 398,6 Nanometern ergab, während das CARS-Signal eine 1,2-mal bessere Auflösung von 330,3 Nanometern ergab. Die SRS- und CARS-Bilder von MIA PaCa-2-Zellen an verschiedenen optischen Verzögerungspositionen zeigen die stärksten Signale mit Lipidtröpfchen als helle Punkte für SRS, während CARS stark reduzierte Kontraste aufweisen.Eine Rotverschiebung der Spektralfokussierung um 37 Wellenzahlen verbesserte jedoch die Lipidkontraste sowohl für SRS als auch für CARS. Die SRS-Spektren zeigen bei einer Wellenzahl von 2850 ein viel stärkeres Signal für Lipidtröpfchen als andere Organellen, während die CARS-Spektren eine kleine Rotverschiebung aufweisen. Um das kohärente Raman-Streusignal zu optimieren, finden Sie zuerst den Sample-Fokus, stimmen Sie dann die optische Verzögerung ab und optimieren Sie schließlich die Spiegel, bis ein Maximum erreicht ist.Andere Pump-Sonden-Technologien, wie die transiente Absorption, sind inhärent in die CRS-Plattform integriert. Diese Technologie ist sehr leistungsfähig für die Messung der Absorptionskinetik von starken, lichtabsorbierenden nicht-fluoreszierenden Molekülen. Diese Technik ermöglicht es Forschern, kleine Moleküle markierungsfrei mit hoher chemischer Zellaktivität zu betrachten.Es ermöglicht den Forschern auch, Veränderungen im Fettstoffwechsel, in der intrazellulären Dynamik und in der Arzneimittelverteilung zu betrachten.

Research

JoVE Journal

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