Name: direct comparison of hyperspectral stimulated raman scattering and coherent anti-stokes raman scattering microscopy for chemical imaging
Uploaded: 2022-04-28T13:20:00
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Questa ricerca è stata supportata dal fondo di avvio del Dipartimento di Chimica della Purdue University.

1. Configurazione strumentale per l'imaging CRS iperspettrale
NOTA: La generazione del segnale CRS richiede l'uso di laser ad alta potenza (ad esempio, classe 3B o classe 4). I protocolli di sicurezza devono essere affrontati e devono essere indossati in ogni momento adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) quando si lavora a potenze di picco così elevate. Consultare la documentazione appropriata prima della sperimentazione. Questo protocollo si concentra sulla prog...

Il protocollo qui presentato descrive la costruzione di un microscopio CRS multimodale e il confronto diretto tra CARS e SRS imaging. Per la costruzione del microscopio, i passaggi critici sono la sovrapposizione del fascio spaziale e temporale e l'ottimizzazione delle dimensioni del fascio. Si consiglia di utilizzare un campione standard come DMSO prima dell'imaging biologico per ottimizzare l'SNR e calibrare gli spostamenti Raman. Il confronto diretto tra le immagini CARS e SRS rivela che CARS ha una migliore risoluzio...

Il fenomeno dello scattering Raman fu osservato per la prima volta nel 1928 da C. V. Raman1. Quando un fotone incidente interagisce con un campione, può verificarsi spontaneamente un evento di scattering anelastico, in cui il cambiamento di energia del fotone corrisponde a una transizione vibrazionale delle specie chimiche analizzate. Questo processo non richiede l'uso di un tag chimico, rendendolo uno strumento versatile e privo di etichette per l'analisi chimica riducendo al minimo le perturbazioni del campione. Nonostante i suoi vantaggi, lo scattering Raman spontaneo soffre di una bassa sezione trasversale di scattering (tipicamente 1011 inferiore alla sezione trasversale di assorbimento a infrarossi [IR]), che richiede lunghi tempi di acquisizione per l'analisi2. Pertanto, la ricerca di aumentare la sensibilità del processo di scattering Raman è essenziale per spingere le tecnologie Raman per l'imaging in tempo reale.
Un modo efficace per migliorare notevolmente la sensibilità dello scattering Raman è attraverso processi di scattering Raman coerenti (CRS), per i quali due impulsi laser sono tipicamente utilizzati per eccitare le transizioni vibrazionali molecolari 3,4. Quando la differenza di energia fotonica tra i due laser corrisponde alle modalità vibrazionali delle molecole campione, verranno generati forti segnali Raman. I due processi CRS più comunemente usati per l'imaging sono lo scattering raman anti-Stokes coerente (CARS) e lo scattering Raman stimolato (SRS)5. Negli ultimi due decenni, gli sviluppi tecnologici hanno avanzato le tecniche di microscopia CARS e SRS per diventare potenti strumenti per la quantificazione senza etichette e la delucidazione dei cambiamenti chimici nei campioni biologici.
L'imaging chimico mediante microscopia CARS può essere datato al 1982, quando la scansione laser è stata applicata per la prima volta per acquisire immagini CARS, dimostrata da Duncan et al6. La modernizzazione della microscopia CARS è stata notevolmente accelerata dopo le ampie applicazioni della microscopia a fluorescenza multifotone a scansione laser7. I primi lavori del gruppo Xie che utilizzano laser ad alto tasso di ripetizione hanno trasformato CARS in una piattaforma di imaging chimico ad alta velocità, priva di etichette, per la caratterizzazione di molecole in campioni biologici 8,9,10. Uno dei principali problemi per l'imaging CARS è la presenza di uno sfondo non consonante, che riduce il contrasto dell'immagine e distorce lo spettro Raman. Sono stati fatti molti sforzi per ridurre lo sfondo non consonante 11,12,13,14,15 o per estrarre segnali Raman risonanti dagli spettri CARS 16,17. Un altro progresso che ha notevolmente migliorato il campo è l'imaging CARS iperspettrale, che consente la mappatura spettrale di ogni pixel dell'immagine con una migliore selettività chimica 18,19,20,21.
Lo scattering Raman stimolato (SRS) è una tecnologia di imaging più giovane di CARS, sebbene sia stata scoperta prima del22. Nel 2007, la microscopia SRS è stata segnalata utilizzando una sorgente laser a basso tasso di ripetizione23. Ben presto, diversi gruppi hanno dimostrato l'imaging SRS ad alta velocità utilizzando laser ad alto tasso di ripetizione 24,25,26. Uno dei principali vantaggi della microscopia SRS rispetto a CARS è l'assenza dello sfondo non consonante27, sebbene altri sfondi come la modulazione multifase (XPM), l'assorbimento transitorio (TA), l'assorbimento a due fotoni (TPA) e l'effetto fototermico (PT), possano verificarsi con SRS28. Inoltre, il segnale SRS e la concentrazione del campione hanno relazioni lineari, a differenza di CARS, che ha una dipendenza quadratica segnale-concentrazione29. Ciò semplifica la quantificazione chimica e l'unmixing spettrale. L'SRS multicolore e iperspettrale si è evoluto in diverse forme 30,31,32,33,34,35,36, con la messa a fuoco spettrale che è uno degli approcci più popolari per l'imaging chimico 37,38.
Sia CARS che SRS richiedono la messa a fuoco della pompa e dei raggi laser Stokes sul campione per abbinare la transizione vibrazionale delle molecole per l'eccitazione del segnale. Anche i microscopi CARS e SRS hanno molto in comune. Tuttavia, la fisica alla base di questi due processi e le rilevazioni di segnali coinvolte in queste tecnologie di microscopia hanno disparità 3,39. CARS è un processo parametrico che non ha un accoppiamento netto di energia fotone-molecola3. SRS, tuttavia, è un processo non parametrico e contribuisce al trasferimento di energia tra fotoni e sistemi molecolari27. In CARS, viene generato un nuovo segnale alla frequenza anti-Stokes, mentre SRS si manifesta come il trasferimento di energia tra la pompa e i raggi laser Stokes.
Il segnale CARS soddisfa Eq (1)28.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq1v2.png" style="margin: auto;"> (1)
Nel frattempo, il segnale SRS può essere scritto come Eq (2)28.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq2v2.png" style="margin: auto;">(2)
Qui, Ip, Is, ICARS e ΔISRS sono rispettivamente le intensità del fascio della pompa, del fascio di Stokes, del segnale CARS e dei segnali SRS. χ(3) è la suscettibilità ottica non lineare del terzo ordine del campione ed è un valore complesso composto da parti reali e immaginarie.
Queste equazioni esprimono i profili spettrali e la dipendenza dalla concentrazione del segnale di CARS e SRS. Le differenze nella fisica si traducono in schemi di rilevamento disparati per queste due tecnologie di microscopia. Il rilevamento del segnale in CARS di solito comporta la separazione spettrale di fotoni di nuova generazione e il rilevamento utilizzando un tubo fotomoltiplicatore (PMT) o un dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD); per SRS, lo scambio di energia tra la pompa e i fasci di Stokes viene solitamente misurato mediante modulazione di intensità ad alta velocità utilizzando un modulatore ottico e demodulazione utilizzando un fotodiodo (PD) abbinato a un amplificatore lock-in.
Sebbene molti sviluppi tecnologici e applicazioni siano stati pubblicati negli ultimi anni sia in ambito CARS che SRS, non sono stati eseguiti confronti sistematici delle due tecniche CRS sulla stessa piattaforma, in particolare per la microscopia iperspettrale CARS e SRS. Confronti diretti in sensibilità, risoluzione spaziale, risoluzione spettrale e capacità di separazione chimica consentirebbero ai biologi di selezionare la migliore modalità per la quantificazione chimica. In questo protocollo, vengono forniti passaggi dettagliati per costruire una piattaforma di imaging multimodale con entrambe le modalità CARS iperspettrale e SRS basate su un sistema laser a femtosecondi e messa a fuoco spettrale. Le due tecniche sono state confrontate in avanti per la risoluzione spettrale, la sensibilità di rilevamento, la risoluzione spaziale e i contrasti di imaging delle cellule.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2D galvo scanner set</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acousto-optic modulator</td>
			<td>Isomet</td>
			<td>M1205-P80L-0.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AOM driver</td>
			<td>Isomet</td>
			<td>532B-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCle 6363</td>
			<td>Custom ordered filter (980 sp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delay stage</td>
			<td>Zaber</td>
			<td>X-LSM050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>151882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for beam combination</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DMLP1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for signal separation</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF776-Di01-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MiliporeSigma</td>
			<td>200-664-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIA PaCa 2 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtosecond laser system</td>
			<td>Spectral Physics</td>
			<td>InSightX3+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter for CARS</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>AT655/30m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter for SRS</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET980sp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>Rigol</td>
			<td>DG1022Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods</td>
			<td>Lattice Electro Optics</td>
			<td>SF-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half-wave plate</td>
			<td>Newport</td>
			<td>10RP02-51; 10RP02-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW 2020</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>This is the image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Zurich Instrument</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope housing</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin Pro 2019b</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>This is the spectral fitting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TBS2204B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>S3994-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT detector</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422P-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT voltage amplifier</td>
			<td>Advanced Research Instrument Corp.</td>
			<td>PMT4V3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing beamsplitter cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PBS255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal block</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>BNC-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct comparison of hyperspectral stimulated raman scattering and coherent anti-stokes raman scattering microscopy for chemical imaging

Lo scattering Raman stimolato (SRS) e la microscopia a dispersione Raman (CARS) coerente anti-Stokes sono le tecnologie di imaging a dispersione Raman coerente più utilizzate. L'imaging iperspettrale SRS e CARS offre informazioni spettrali Raman su ogni pixel, che consente una migliore separazione di diverse composizioni chimiche. Sebbene entrambe le tecniche richiedano due laser di eccitazione, i loro schemi di rilevamento del segnale e le proprietà spettrali sono molto diversi. L'obiettivo di questo protocollo è quello di eseguire sia l'imaging iperspettrale SRS che CARS su un'unica piattaforma e confrontare le due tecniche di microscopia per l'imaging di diversi campioni biologici. Il metodo di messa a fuoco spettrale viene impiegato per acquisire informazioni spettrali utilizzando laser a femtosecondi. Utilizzando campioni chimici standard, vengono confrontate la sensibilità, la risoluzione spaziale e la risoluzione spettrale di SRS e CARS nelle stesse condizioni di eccitazione (ad esempio, potenza al campione, tempo di permanenza dei pixel, obiettivo, energia dell'impulso). I contrasti di imaging di CARS e SRS per campioni biologici sono giustapposti e confrontati. Il confronto diretto delle prestazioni di CARS e SRS consentirebbe una selezione ottimale della modalità per l'imaging chimico.

Confronti della risoluzione spettrale La Figura 2 confronta la risoluzione spettrale della microscopia iperspettrale SRS (Figura 2A) e CARS (Figura 2B) utilizzando un campione DMSO. Per lo spettro SRS, sono state applicate due funzioni lorentziane (vedi fase di protocollo 2.3) per adattarsi allo spettro e una risoluzione di 14,6 cm-1 è stata ottenuta utilizzando il picco di 2.913 cm-1 . Per...

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Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging

Questo documento confronta direttamente la risoluzione, la sensibilità e i contrasti di imaging dello scattering Raman stimolato (SRS) e dello scattering Raman anti-Stokes coerente (CARS) integrati nella stessa piattaforma del microscopio. I risultati mostrano che CARS ha una migliore risoluzione spaziale, SRS offre migliori contrasti e risoluzione spettrale ed entrambi i metodi hanno una sensibilità simile.

Confronto diretto tra lo scattering Raman stimolato iperspettrale e la microscopia a dispersione raman coerente anti-Stokes per l'imaging chimico

Stimulated Raman scattering (SRS) and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy are the most widely used coherent Raman scattering imaging ...

Questo protocollo confronta le due tecniche di scattering Raman iperspettrale coerenti più utilizzate, tra cui lo scattering raman anti-Stokes coerente e i processi di scattering Raman stimolati e questo consente ai biologi di scegliere la migliore modalità di imaging per le loro applicazioni biologiche. Utilizzando le firme vibrazionali intrinseche, la spettroscopia Raman coerente è in grado di mappare informazioni chimiche e campioni biologici senza la necessità di etichettatura esogena. La microscopia Raman coerente ha ampliato la nostra comprensione del metabolismo cellulare, della mappatura, delle distribuzioni dei farmaci, della diagnostica delle malattie e della quantificazione dei cambiamenti chimici.Questa è una tecnica che richiede una formazione sufficiente sia in ottica che in spettroscopia. Consiglierei di leggere alcuni articoli di recensione e di essere addestrati da un esperto prima di utilizzare questa tecnica. Per iniziare, preparare le diapositive di imaging posizionando un pezzo di nastro biadesivo su una slitta di copertura e ritagliare una piccola forma rettangolare del nastro dal centro del nastro per creare un'area aperta per il posizionamento del campione.Pipettare da 1 a 2 microlitri di DMSO puro ed erogare la goccia al centro del posto vacante. Posizionare con attenzione lo slip del coperchio superiore e posizionare delicatamente i bordi degli slip del coperchio per sigillare la camera assicurandosi che il campione DMSO non entri in contatto con i bordi del nastro. Per gli esperimenti di sensibilità, preparare diluizioni seriali di DMSO in ossido di deuterio per dare un intervallo di concentrazione dal 50 allo 0% Prendere da 1 a 2 microlitri di ciascuna soluzione e preparare campioni pressati come dimostrato in precedenza.Posizionare il campione sul palco del microscopio e aggiungere acqua o olio per immersione, se necessario, per la lente dell'obiettivo o il condensatore. Spostare correttamente il bordo della goccia DMSO nel campo visivo e regolare l'obiettivo per la migliore messa a fuoco, quindi centrare il condensatore utilizzando il metodo di illuminazione Kohler e aprire completamente il diaframma sul condensatore. Quindi, sintonizzare la lunghezza d'onda del fascio della pompa a 800 nanometri per indirizzare il picco CH3 del numero d'onda 2913 e impostare la potenza sia della pompa che del raggio di Stokes a circa 30 milliwatt prima del microscopio regolando la piastra a mezza onda.Per SRS, impostare il guadagno dell'amplificatore lock-in su circa 10 con una costante di tempo di 7 microsecondi, assicurandosi che la costante di tempo sia inferiore al tempo di permanenza dei pixel. Imposta i parametri di acquisizione delle immagini e il software di acquisizione utilizzando un numero di pixel di 200 per 200 con una dimensione di scansione di circa 100 x 100 metri quadrati, assicurandoti che l'immagine contenga sia il droplet DMSO che un'area vuota, quindi scansiona il campione e controlla l'immagine sullo schermo del computer. Quindi, scansiona l'immagine di ritardo motorizzata nel raggio della pompa Stokes mentre monitori le immagini in tempo reale e scansiona il ritardo fino a quando il segnale non viene massimizzato.Spostare la goccia DMSO per coprire l'intero campo visivo e verificare se il massimo del segnale CC è centrato nell'immagine poiché il segnale dipende dal fascio della pompa. Regolare la posizione del fascio della pompa tramite uno specchio o l'offset di tensione nel software di imaging. Dopo l'ottimizzazione DC, regolare gli specchi del fascio di Stokes fino a quando il segnale CA non viene massimizzato regolando il valore di soglia per visualizzare circa il 50% di saturazione controllando che la saturazione sia centrata nell'immagine.In caso contrario, mettere a punto gli specchi solo nel fascio di Stokes e monitorare il segnale durante l'allineamento come feedback in tempo reale sulla qualità dell'allineamento. Per l'analisi SNR, aprire il software ImageJ e importare il file di testo di esempio DMSO salvato facendo clic su File, quindi su Importa, quindi sulle opzioni Immagine di testo e Apri dal menu a discesa. Una volta importata l'immagine, premere Ctrl Maiusc C per visualizzare la funzione Luminosità e Contrasto, quindi premere il pulsante Automatico nella funzione Luminosità e Contrasto finché la regione del campione DMSO appare satura per trovare il segnale di campionamento massimo.Quindi, fare clic sullo strumento di selezione Ovale nell'interfaccia ImageJ ed evidenziare una piccola area della regione DMSO satura. Dopo l'evidenziazione, premere M per misurare la deviazione media e standard dell'area selezionata. Per misurare lo sfondo, regolare le barre nella funzione Luminosità e contrasto fino a quando non è possibile osservare il segnale della regione vuota, quindi fare clic sulla selezione ovale ed evidenziare una regione dello sfondo, assicurandosi che la regione selezionata non contenga DMSO.Successivamente, premere M per misurare le statistiche dell'area selezionata. Quindi, calcolare l'SNR come dimostrato in precedenza misurando il valore medio del rumore e il valore medio del segnale insieme alla deviazione standard. Per elaborare le immagini CRS iperspettrali, importare il file di testo facendo clic sulle opzioni File, quindi Importa, Immagine di testo e Apri dal menu a discesa.Una volta importato, fai clic su Immagine, quindi su Stack, seguito dalle opzioni Strumenti e Montaggio su Stack per convertire il file in uno stack di immagini, quindi scorri il montaggio fino a visualizzare il primo picco DMSO. Selezionare una regione sul DMSO e fare clic su Immagine, quindi sulle opzioni Stack e Plot Z-axis Profile per tracciare lo spettro dell'intensità rispetto allo spettro del numero di fotogrammi. Quindi, fai clic su Elenca e copia i dati del profilo per estrarre i dati spettrali grezzi.Per convertire lo spettro recuperato in unità di frequenza, eseguire una regressione lineare utilizzando il CH simmetrico e asimmetrico che si estende da DMSO e i relativi numeri di fotogramma corrispondenti. La risoluzione spettrale del DMSO è stata misurata utilizzando una microscopia iperspettrale SRS e CARS, che mostrano una risoluzione rispettivamente di 14,6 e 17,1, indicando che SRS ha una migliore risoluzione spettrale. Gli spettri DMSO SRS sono stati ottenuti a concentrazioni dello 0,1 e dello 0,01% in cui il picco al numero d'onda 2913 può essere risolto nel primo, ma non nel secondo, indicando che il limite di rilevamento è compreso tra 0,1 e 0,01% DMSO.Gli spettri CARS recuperati in fase mostrano che il picco del numero d'onda DMSO 2913 può essere chiaramente risolto per lo 0,1% DMSO, ma non per lo 0,01% che indica un limite di rilevamento tra queste due concentrazioni. I profili di intensità SRS e CARS di una cella MIA PaCA-2 hanno dimostrato che il segnale SRS ha dato una risoluzione di 398,6 nanometri, mentre il segnale CARS ha dato una risoluzione 1,2 volte migliore di 330,3 nanometri. Le immagini SRS e CARS delle cellule MIA PaCa-2 in diverse posizioni di ritardo ottico mostrano i segnali più forti con goccioline lipidiche come punti luminosi per SRS, mentre CARS ha contrasti molto ridotti.Tuttavia, uno spostamento in rosso del numero d'onda 37 nella messa a fuoco spettrale ha migliorato i contrasti lipidici sia per SRS che per CARS. Gli spettri SRS mostrano un segnale molto più forte a 2850 numero d'onda per le goccioline lipidiche rispetto ad altri organelli, mentre gli spettri CARS mostrano un piccolo spostamento verso il rosso. Per ottimizzare il segnale di scattering Raman coerente, prima trova la messa a fuoco del campione, quindi sintonizza il ritardo ottico e, infine, perfeziona gli specchi fino a raggiungere il massimo.Altre tecnologie pompa-sonda, come l'assorbimento transitorio, sono intrinsecamente integrate nella piattaforma CRS. Questa tecnologia è molto potente per misurare la cinetica di assorbimento di molecole non fluorescenti che assorbono la luce forte. Questa tecnica consente ai ricercatori di visualizzare piccole molecole in modo privo di etichette con un'elevata attività chimica delle cellule.Consente inoltre ai ricercatori di visualizzare i cambiamenti nel metabolismo lipidico, nelle dinamiche intracellulari e nelle distribuzioni dei farmaci.

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