Name: direct comparison of hyperspectral stimulated raman scattering and coherent anti-stokes raman scattering microscopy for chemical imaging
Uploaded: 2022-04-28T13:20:00
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Esta pesquisa foi apoiada pelo fundo de startup do Departamento de Química da Universidade purdue.

1. Configuração instrumental para imagens de CRS hiperespectrais
NOTA: A geração de sinal CRS requer o uso de lasers de alta potência (ou seja, classe 3B ou classe 4). Os protocolos de segurança devem ser abordados e os equipamentos de proteção individual (EPI) adequados devem ser usados em todos os momentos quando se trabalha em potências de pico tão altas. Consulte a documentação adequada antes da experimentação. Este protocolo se concentra em projetar o caminho ...

O protocolo aqui apresentado descreve a construção de um microscópio CRS multimodal e a comparação direta entre carros e imagens SRS. Para a construção do microscópio, as etapas críticas são a sobreposição do feixe espacial e temporal e a otimização do tamanho do feixe. Recomenda-se o uso de uma amostra padrão como o DMSO antes da imagem biológica para otimizar o SNR e calibrar as mudanças de Raman. A comparação direta entre as imagens cars e srs revela que o CARS tem uma melhor resolução espacial, e...

O fenômeno de dispersão de Raman foi observado pela primeira vez em 1928 por C. V. Raman1. Quando um fóton incidente está interagindo com uma amostra, um evento de dispersão inelástica pode ocorrer espontaneamente, no qual a mudança de energia do fóton corresponde a uma transição vibracional das espécies químicas analisadas. Este processo não requer o uso de uma etiqueta química, tornando-a uma ferramenta versátil e livre de rótulos para análise química, minimizando a perturbação da amostra. Apesar de suas vantagens, a dispersão espontânea de Raman sofre de uma seção transversal de baixa dispersão (tipicamente 1011 menor que a seção transversal de absorção infravermelha [IR]), o que requer longos tempos de aquisição para análise2. Assim, a busca pelo aumento da sensibilidade do processo de dispersão de Raman é essencial para impulsionar as tecnologias Raman para imagens em tempo real.
Uma maneira eficaz de aumentar muito a sensibilidade da dispersão de Raman é através de processos coerentes de dispersão de Raman (CRS), para os quais dois pulsos de laser são tipicamente usados para excitar transições vibracionais moleculares 3,4. Quando a diferença de energia de fótons entre os dois lasers corresponde aos modos vibracionais das moléculas de amostra, fortes sinais raman serão gerados. Os dois processos de CRS mais usados para imagem são a dispersão coerente anti-Stokes Raman (CARS) e a dispersão de Raman estimulada (SRS)5. Nas últimas duas décadas, os desenvolvimentos tecnológicos avançaram nas técnicas de microscopia de CARROS e SRS para se tornarem ferramentas poderosas para quantificação sem rótulos e elucidação de alterações químicas em amostras biológicas.
A imagem química por microscopia CARS pode ser datada de 1982 quando a varredura a laser foi aplicada pela primeira vez para adquirir imagens CARS, demonstradas por Duncan et al6. A modernização da microscopia CARS foi bastante acelerada após as amplas aplicações da microscopia de fluorescência multifotona laser 7. Os primeiros trabalhos do grupo Xie usando lasers de alta taxa de repetição tornaram-se uma plataforma de imagem química de alta velocidade, sem rótulos, para a caracterização de moléculas em amostras biológicas 8,9,10. Um dos principais problemas para a imagem cars é a presença de um fundo não ressonante, que reduz o contraste da imagem e distorce o espectro Raman. Muitos esforços foram feitos para reduzir o fundo não ressonante 11,12,13,14,15 ou para extrair sinais raman ressonantes do espectro CARS 16,17. Outro avanço que tem avançado muito o campo é a imagem de CARS hiperespectral, que permite o mapeamento espectral em cada pixel de imagem com melhor seletividade química 18,19,20,21.
A dispersão de Raman Estimulada (SRS) é uma tecnologia de imagem mais jovem do que cars, embora tenha sido descoberta anteriormenteaos 22 anos. Em 2007, a microscopia SRS foi relatada usando uma baixa taxa de repetição da fonte laser23. Logo, vários grupos demonstraram imagens de SRS de alta velocidade usando lasers de alta taxa de repetição 24,25,26. Uma das principais vantagens da microscopia SRS sobre carros é a ausência do fundo não ressonante27, embora outros fundos como modulação transversal (XPM), absorção transitória (TA), absorção de dois fótons (TPA) e efeito fototermal (PT), possam ocorrer com o SRS28. Além disso, o sinal SRS e a concentração amostral têm relações lineares, ao contrário dos CARS, que tem uma dependência quadrática de concentração de sinal29. Isso simplifica a quantificação química e o descompramento espectral. A SRS multicolorida e hiperespectral evoluiu de diferentes formas 30,31,32,33,34,35,36, com foco espectral sendo uma das abordagens mais populares para a imagem química 37,38.
Tanto os CARROS quanto o SRS requerem o foco da bomba e os raios laser de Stokes na amostra para combinar com a transição vibracional das moléculas para excitação de sinal. Os microscópios CARS e SRS também compartilham muito em comum. No entanto, a física subjacente a esses dois processos, e as detecções de sinais envolvidas nessas tecnologias de microscopia têm disparidades 3,39. CARS é um processo paramétrico que não tem acoplamento de energia net fóton-molécula3. O SRS, no entanto, é um processo não paramétrico, e contribui para a transferência de energia entre fótons e sistemas moleculares27. Em CARS, um novo sinal na frequência anti-Stokes é gerado, enquanto o SRS se manifesta como a transferência de energia entre a bomba e os raios laser stokes.
O sinal CARS satisfaz eq (1)28.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq1v2.png" style="margin: auto;"> (1)
Enquanto isso, o sinal SRS pode ser escrito como Eq (2)28.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq2v2.png" style="margin: auto;">(2)
Aqui, eup, is, ICARS, e ΔISRS são as intensidades do feixe de bomba, feixe de Stokes, sinal CARS e sinais SRS, respectivamente. Χ(3) é a suscetibilidade óptica não linear de terceira ordem da amostra, e é um valor complexo composto de partes reais e imaginárias.
Essas equações expressam os perfis espectrais e a dependência de concentração de sinais de CARROS e SRS. Diferenças na física resultam em esquemas de detecção diferentes para essas duas tecnologias de microscopia. A detecção de sinal em CARROS geralmente envolve a separação espectral de fótons recém-gerados e a detecção usando um tubo fotomultiplier (PMT) ou dispositivo acoplado por carga (CCD); para SRS, a troca de energia entre a bomba e os feixes de Stokes é geralmente medida pela modulação de alta velocidade de intensidade usando um modulador óptico e desmodulação usando um fotodiodo (PD) emparelhado com um amplificador de travamento.
Embora muitos desenvolvimentos tecnológicos e aplicações tenham sido publicados nos últimos anos nos campos de CARROS e SRS, não foram realizadas comparações sistemáticas das duas técnicas de CRS na mesma plataforma, especialmente para carros hiperespectrais e microscopia SRS. Comparações diretas em sensibilidade, resolução espacial, resolução espectral e capacidades de separação química permitiriam aos biólogos selecionar a melhor modalidade de quantificação química. Neste protocolo, são fornecidas etapas detalhadas para a construção de uma plataforma de imagem multimodal com as modalidades CARROS hiperespectrais e SRS baseadas em um sistema laser femtosegundo e foco espectral. As duas técnicas foram comparadas na direção para resolução espectral, sensibilidade à detecção, resolução espacial e contrastes de imagem das células.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2D galvo scanner set</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acousto-optic modulator</td>
			<td>Isomet</td>
			<td>M1205-P80L-0.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AOM driver</td>
			<td>Isomet</td>
			<td>532B-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCle 6363</td>
			<td>Custom ordered filter (980 sp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delay stage</td>
			<td>Zaber</td>
			<td>X-LSM050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>151882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for beam combination</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DMLP1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for signal separation</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF776-Di01-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MiliporeSigma</td>
			<td>200-664-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIA PaCa 2 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtosecond laser system</td>
			<td>Spectral Physics</td>
			<td>InSightX3+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter for CARS</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>AT655/30m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter for SRS</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET980sp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>Rigol</td>
			<td>DG1022Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods</td>
			<td>Lattice Electro Optics</td>
			<td>SF-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half-wave plate</td>
			<td>Newport</td>
			<td>10RP02-51; 10RP02-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW 2020</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>This is the image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Zurich Instrument</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope housing</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin Pro 2019b</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>This is the spectral fitting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TBS2204B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>S3994-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT detector</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422P-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT voltage amplifier</td>
			<td>Advanced Research Instrument Corp.</td>
			<td>PMT4V3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing beamsplitter cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PBS255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal block</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>BNC-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct comparison of hyperspectral stimulated raman scattering and coherent anti-stokes raman scattering microscopy for chemical imaging

A dispersão estimulada de Raman (SRS) e a microscopia de dispersão anti-Stokes Raman (CARS) são as tecnologias de imagem de dispersão raman mais amplamente utilizadas. As imagens hiperespectrais SRS e CARS oferecem informações espectrais de Raman a cada pixel, o que permite uma melhor separação de diferentes composições químicas. Embora ambas as técnicas exijam dois lasers de excitação, seus esquemas de detecção de sinal e propriedades espectrais são bem diferentes. O objetivo deste protocolo é realizar imagens de SRS hiperespectrais e CARS em uma única plataforma e comparar as duas técnicas de microscopia para imagens de diferentes amostras biológicas. O método de foco espectral é empregado para adquirir informações espectrais usando lasers femtosegundos. Utilizando amostras químicas padrão, a sensibilidade, resolução espacial e resolução espectral de SRS e CARS nas mesmas condições de excitação (ou seja, energia na amostra, tempo de moradia dos pixels, lente objetiva, energia de pulso) são comparadas. Os contrastes de imagem de CARROS e SRS para amostras biológicas são justtaposed e comparados. A comparação direta dos desempenhos de CARROS e SRS permitiria a seleção ideal da modalidade para imagem química.

Comparações da resolução espectral A Figura 2 compara a resolução espectral da microscopia hiperespectral SRS (Figura 2A) e CARS (Figura 2B) utilizando uma amostra de DMSO. Para o espectro SRS, duas funções lorentzianas (ver protocolo passo 2.3) foram aplicadas para se adequar ao espectro, e uma resolução de 14,6 cm-1 foi obtida utilizando-se o pico de 2.913 cm-1 . Para carros, foi...

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Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging

Este artigo compara diretamente os contrastes de resolução, sensibilidade e imagem da dispersão estimulada de Raman (SRS) e da dispersão coerente anti-Stokes Raman (CARS) integrada à mesma plataforma de microscópio. Os resultados mostram que o CARS tem uma melhor resolução espacial, o SRS dá melhores contrastes e resolução espectral, e ambos os métodos têm sensibilidade semelhante.

Comparação direta da dispersão de Raman estimulada hiperespectral e microscopia de dispersão de Raman coerente para imagem química

Stimulated Raman scattering (SRS) and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy are the most widely used coherent Raman scattering imaging ...

Este protocolo compara as duas técnicas de dispersão raman hiperespectral mais utilizadas, incluindo a dispersão coerente anti-Stokes Raman e os processos estimulados de dispersão de Raman e isso permite que os biólogos escolham a melhor modalidade de imagem para suas aplicações biológicas. Usando as assinaturas vibracionais intrínsecas, a espectroscopia raman coerente é capaz de mapear informações químicas e amostras biológicas sem a necessidade de rotulagem exógena. A microscopia raman coerente expandiu nossa compreensão do metabolismo celular, mapeamento, distribuição de medicamentos, diagnósticos de doenças e quantificação de alterações químicas.Esta é uma técnica que requer treinamento suficiente tanto em óptica quanto em espectroscopia. Eu recomendaria ler alguns artigos de revisão e ser treinado por um especialista antes de usar essa técnica. Para começar, prepare os slides de imagem colocando um pedaço de fita dupla face em um deslizamento de tampa e corte uma pequena forma retangular da fita do meio da fita para criar uma área aberta para a amostra ser colocada.Pipeta 1 a 2 microliters de DMSO puro e dispense a gotícula no centro da vaga. Coloque cuidadosamente o deslizamento da tampa superior e coloque delicadamente as bordas dos deslizamentos de cobertura para selar a câmara, certificando-se de que a amostra DMSO não entre em contato com as bordas da fita. Para experimentos de sensibilidade, prepare diluições seriais de DMSO em óxido de deutério para dar uma faixa de concentração de 50 a 0%Pegue 1 a 2 microliters de cada solução e prepare amostras pressionadas como demonstrado anteriormente.Coloque a amostra no estágio do microscópio e adicione água ou óleo de imersão, se necessário, para a lente objetiva ou condensador. Mova corretamente a borda da gotícula DMSO no campo de visão e ajuste a lente objetiva para o melhor foco, em seguida, centralize o condensador usando o método de iluminação Kohler e abra totalmente o diafragma no condensador. Em seguida, sintonize o comprimento de onda do feixe de bomba para 800 nanômetros para atingir o pico ch3 de 2913 e ajuste a potência da bomba e do feixe de Stokes para aproximadamente 30 miliwatts antes do microscópio, ajustando a placa de meia onda.Para o SRS, defina o ganho do amplificador de travamento para aproximadamente 10 com uma constante de tempo de 7 microsegundos, garantindo que a constante de tempo seja menor do que o tempo de moradia dos pixels. Defina os parâmetros de aquisição de imagens e o software de aquisição usando um número de pixel de 200 até 200 com o tamanho de digitalização de aproximadamente 100 por 100 micrômetros quadrados, garantindo que a imagem contenha tanto a gotícula DMSO quanto uma área vazia, em seguida, digitalize a amostra e verifique a imagem na tela do computador. Em seguida, escaneie a imagem de atraso motorizada no feixe da bomba de Stokes enquanto monitora as imagens em tempo real e escaneie sobre o atraso até que o sinal seja maximizado.Mova a gota DMSO para cobrir todo o campo de visão e verifique se a máxima do sinal DC está centrada na imagem, pois o sinal é dependente do feixe de bomba. Ajuste a posição do feixe da bomba através de um espelho ou o deslocamento de tensão no software de imagem. Após a otimização do DC, ajuste os espelhos do feixe de Stokes até que o sinal CA seja maximizado ajustando o valor do limiar para exibir aproximadamente 50% de saturação, verificando se a saturação está centrada na imagem.Caso não, ajuste os espelhos apenas no feixe Stokes e monitore o sinal durante o alinhamento como feedback em tempo real sobre a qualidade do alinhamento. Para análise SNR, abra o software ImageJ e importe o arquivo de texto de amostra DMSO salvo clicando em Arquivo e, em seguida, Importe, seguido pelas opções Text Image e Open do menu suspenso. Uma vez que a imagem seja importada, pressione o Controle Shift C para trazer a função Brilho e Contraste e pressione o botão Automático na função Brilho e Contraste até que a região da amostra DMSO pareça saturada para encontrar o sinal máximo da amostra.Em seguida, clique na ferramenta de seleção Oval na interface ImageJ e destaque uma pequena área da região de DMSO saturada. Após o destaque, pressione M para medir a média e o desvio padrão da área selecionada. Para medir o fundo, ajuste as barras na função Brilho e Contraste até que o sinal da região vazia possa ser observado, clique na seleção oval e destaque uma região do fundo, garantindo que a região selecionada não contenha DMSO.Depois, pressione M para medir as estatísticas da área selecionada. Em seguida, calcule o SNR como demonstrado anteriormente medindo o valor médio de ruído e o valor médio do sinal, juntamente com o desvio padrão. Para processar as imagens CRS hiperespectrais, importe o arquivo de texto clicando em Arquivo, em seguida, Importe, Imagem de Texto e Abra opções do menu suspenso.Uma vez importado, clique em Imagem, em seguida, Stacks, seguido por opções Ferramentas e Montage para Stack para converter o arquivo em uma pilha de imagens e, em seguida, role através da montagem até que o primeiro pico DMSO seja visível. Selecione uma região no DMSO e clique em Imagem, seguido pelas opções De perfil do eixo Stack e do eixo Z para traçar o espectro de intensidade versus número de quadros. Em seguida, clique em Listar e copie os dados do perfil para extrair os dados espectrais brutos.Para converter o espectro recuperado em unidades de frequência, realize uma regressão linear utilizando o CH simétrico e assimétrico que se estende do DMSO e seus números de quadro correspondentes. A resolução espectral do DMSO foi medida utilizando-se uma microscopia hiperespectral SRS e CARS, que mostram uma resolução de 14,6 e 17,1 respectivamente, indicando que o SRS possui uma melhor resolução espectral. Os espectros DMSO SRS foram obtidos em concentrações de 0,1 e 0,01%, nas quais o pico de 2913 pode ser resolvido no primeiro, mas não no segundo, indicando que o limite de detecção está entre 0,1 e 0,01% DMSO.Os espectros de CARS recuperados em fase mostram que o pico de número de ondas DMSO 2913 pode ser claramente resolvido para o DMSO de 0,1%, mas não o 0,01% que indica um limite de detecção entre essas duas concentrações. Os perfis de intensidade srs e cars de uma célula MIA PaCA-2 demonstraram que o sinal SRS deu uma resolução de 398,6 nanômetros, enquanto o sinal CARS deu 1,2 vezes melhor resolução de 330,3 nanômetros. As imagens SRS e CARS das células MIA PaCa-2 em diferentes posições de atraso óptico mostram os sinais mais fortes com gotículas lipídicas como pontos brilhantes para SRS, enquanto os CARS têm contrastes muito reduzidos.No entanto, uma mudança vermelha de 37 ondas no foco espectral melhorou os contrastes lipídes para srs e CARS. Os espectros srs mostram um sinal muito mais forte em 2850 número de ondas para gotículas lipídicas do que outras organelas, enquanto os espectros CARS mostram uma pequena mudança vermelha. Para otimizar o sinal de dispersão raman coerente, primeiro encontre o foco da amostra, depois ajuste o atraso óptico e, finalmente, ajuste os espelhos até que um máximo seja alcançado.Outras tecnologias de sonda de bomba, como a absorção transitória, são inerentemente integradas à plataforma CRS. Esta tecnologia é muito poderosa para medir a cinética de absorção de luz forte absorvendo moléculas não fluorescentes. Essa técnica permite que os pesquisadores visualizem pequenas moléculas de forma livre de rótulos com alta atividade celular química.Também permite que os pesquisadores visualizem mudanças no metabolismo lipídico, dinâmica intracelular e distribuição de medicamentos.

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