Name: direct comparison of hyperspectral stimulated raman scattering and coherent anti-stokes raman scattering microscopy for chemical imaging
Uploaded: 2022-04-28T13:20:00
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Esta investigación fue apoyada por el fondo de inicio del Departamento de Química de la Universidad de Purdue.

1. Configuración instrumental para imágenes de CRS hiperespectrales
NOTA: La generación de señal CRS requiere el uso de láseres de alta potencia (es decir, clase 3B o clase 4). Se deben abordar los protocolos de seguridad y se debe usar el equipo de protección personal (EPP) adecuado en todo momento cuando se trabaja a potencias de pico tan altas. Consulte la documentación adecuada antes de la experimentación. Este protocolo se centra en el diseño de la trayectoria del ...

El protocolo presentado aquí describe la construcción de un microscopio CRS multimodal y la comparación directa entre CARS y SRS imaging. Para la construcción del microscopio, los pasos críticos son la superposición espacial y temporal del haz y la optimización del tamaño del haz. Se recomienda utilizar una muestra estándar como DMSO antes de la imagen biológica para optimizar el SNR y calibrar los turnos Raman. La comparación directa entre las imágenes CARS y SRS revela que CARS tiene una mejor resolución e...

El fenómeno de dispersión Raman fue observado por primera vez en 1928 por C. V. Raman1. Cuando un fotón incidente está interactuando con una muestra, puede ocurrir espontáneamente un evento de dispersión inelástica, en el que el cambio de energía del fotón coincide con una transición vibratoria de la especie química analizada. Este proceso no requiere el uso de una etiqueta química, por lo que es una herramienta versátil y sin etiquetas para el análisis químico al tiempo que minimiza la perturbación de la muestra. A pesar de sus ventajas, la dispersión Raman espontánea sufre de una sección transversal de dispersión baja (típicamente 1011 más baja que la sección transversal de absorción infrarroja [IR]), lo que requiere largos tiempos de adquisición para el análisis2. Por lo tanto, la búsqueda de aumentar la sensibilidad del proceso de dispersión Raman es esencial para impulsar las tecnologías Raman para obtener imágenes en tiempo real.
Una forma efectiva de mejorar en gran medida la sensibilidad de la dispersión Raman es a través de procesos coherentes de dispersión Raman (CRS), para los cuales generalmente se utilizan dos pulsos láser para excitar transiciones vibracionales moleculares 3,4. Cuando la diferencia de energía de fotones entre los dos láseres coincide con los modos vibratorios de las moléculas de muestra, se generarán fuertes señales Raman. Los dos procesos CRS más utilizados para la obtención de imágenes son la dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS) y la dispersión Raman estimulada (SRS)5. En las últimas dos décadas, los desarrollos tecnológicos han avanzado las técnicas de microscopía CARS y SRS para convertirse en herramientas poderosas para la cuantificación y elucidación sin etiquetas de los cambios químicos en muestras biológicas.
Las imágenes químicas por microscopía CARS se pueden fechar en 1982, cuando el escaneo láser se aplicó por primera vez para adquirir imágenes CARS, demostrado por Duncan et al6. La modernización de la microscopía CARS se aceleró enormemente después de las amplias aplicaciones de la microscopía de fluorescencia multifotónica de barrido láser7. Los primeros trabajos del grupo Xie utilizando láseres de alta tasa de repetición han hecho que CARS sea una plataforma de imágenes químicas de alta velocidad, sin etiquetas, para la caracterización de moléculas en muestras biológicas 8,9,10. Uno de los principales problemas para las imágenes CARS es la presencia de un fondo no resonante, lo que reduce el contraste de la imagen y distorsiona el espectro Raman. Se han hecho muchos esfuerzos para reducir el fondo no resonante 11,12,13,14,15 o para extraer señales Raman resonantes de los espectros CARS 16,17. Otro avance que ha avanzado mucho en el campo es la imagen hiperespectral CARS, que permite el mapeo espectral en cada píxel de imagen con una selectividad química mejorada 18,19,20,21.
La dispersión Raman estimulada (SRS) es una tecnología de imagen más joven que CARS, aunque se descubrió antes22. En 2007, se informó de microscopía SRS utilizando una fuente láser de baja tasa de repetición23. Pronto, varios grupos demostraron imágenes SRS de alta velocidad utilizando láseres de alta tasa de repetición 24,25,26. Una de las principales ventajas de la microscopía SRS sobre CARS es la ausencia del fondo no resonante27, aunque otros fondos como la modulación de fase cruzada (XPM), la absorción transitoria (TA), la absorción de dos fotones (TPA) y el efecto fototérmico (PT), pueden ocurrir con SRS28. Además, la señal SRS y la concentración de la muestra tienen relaciones lineales, a diferencia de CARS, que tiene una dependencia cuadrática de concentración de señal29. Esto simplifica la cuantificación química y la desmezcla espectral. El SRS multicolor e hiperespectral ha evolucionado en diferentes formas 30,31,32,33,34,35,36, siendo el enfoque espectral uno de los enfoques más populares para la obtención de imágenes químicas 37,38.
Tanto CARS como SRS requieren el enfoque de la bomba y los rayos láser Stokes en la muestra para que coincida con la transición vibratoria de las moléculas para la excitación de la señal. Los microscopios CARS y SRS también comparten mucho en común. Sin embargo, la física subyacente a estos dos procesos, y las detecciones de señales involucradas en estas tecnologías de microscopía tienen disparidades 3,39. CARS es un proceso paramétrico que no tiene acoplamiento neto de energía fotón-molécula3. SRS, sin embargo, es un proceso no paramétrico, y contribuye a la transferencia de energía entre fotones y sistemas moleculares27. En CARS, se genera una nueva señal a frecuencia anti-Stokes, mientras que SRS se manifiesta como la transferencia de energía entre la bomba y los rayos láser stokes.
La señal CARS satisface Eq (1)28.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq1v2.png" style="margin: auto;"> (1)
Mientras tanto, la señal SRS se puede escribir como Eq (2)28.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq2v2.png" style="margin: auto;">(2)
Aquí, Ip, Is, ICARS y ΔISRS son las intensidades del haz de la bomba, el haz de Stokes, la señal CARS y las señales SRS, respectivamente. χ(3) es la susceptibilidad óptica no lineal de tercer orden de la muestra, y es un valor complejo compuesto de partes reales e imaginarias.
Estas ecuaciones expresan los perfiles espectrales y la dependencia de la concentración de señal de CARS y SRS. Las diferencias en la física dan como resultado esquemas de detección dispares para estas dos tecnologías de microscopía. La detección de señales en CARS generalmente implica la separación espectral de fotones recién generados y la detección utilizando un tubo fotomultiplicador (PMT) o un dispositivo de carga acoplada (CCD); para SRS, el intercambio de energía entre la bomba y los haces de Stokes generalmente se mide mediante modulación de intensidad de alta velocidad utilizando un modulador óptico y demodulación utilizando un fotodiodo (PD) emparejado con un amplificador de bloqueo.
Aunque en los últimos años se han publicado muchos desarrollos y aplicaciones tecnológicas en los campos CARS y SRS, no se han realizado comparaciones sistemáticas de las dos técnicas CRS en la misma plataforma, especialmente para CARS hiperespectrales y microscopía SRS. Las comparaciones directas en sensibilidad, resolución espacial, resolución espectral y capacidades de separación química permitirían a los biólogos seleccionar la mejor modalidad para la cuantificación química. En este protocolo, se proporcionan pasos detallados para construir una plataforma de imágenes multimodales con modalidades hiperespectrales CARS y SRS basadas en un sistema láser de femtosegundo y enfoque espectral. Las dos técnicas se han comparado en la dirección hacia adelante para la resolución espectral, la sensibilidad de detección, la resolución espacial y los contrastes de imágenes de las células.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2D galvo scanner set</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acousto-optic modulator</td>
			<td>Isomet</td>
			<td>M1205-P80L-0.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AOM driver</td>
			<td>Isomet</td>
			<td>532B-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCle 6363</td>
			<td>Custom ordered filter (980 sp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delay stage</td>
			<td>Zaber</td>
			<td>X-LSM050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>151882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for beam combination</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DMLP1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for signal separation</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF776-Di01-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MiliporeSigma</td>
			<td>200-664-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIA PaCa 2 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtosecond laser system</td>
			<td>Spectral Physics</td>
			<td>InSightX3+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter for CARS</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>AT655/30m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter for SRS</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET980sp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>Rigol</td>
			<td>DG1022Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods</td>
			<td>Lattice Electro Optics</td>
			<td>SF-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half-wave plate</td>
			<td>Newport</td>
			<td>10RP02-51; 10RP02-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW 2020</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>This is the image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Zurich Instrument</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope housing</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin Pro 2019b</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>This is the spectral fitting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TBS2204B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>S3994-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT detector</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422P-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT voltage amplifier</td>
			<td>Advanced Research Instrument Corp.</td>
			<td>PMT4V3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing beamsplitter cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PBS255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal block</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>BNC-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct comparison of hyperspectral stimulated raman scattering and coherent anti-stokes raman scattering microscopy for chemical imaging

La dispersión Raman estimulada (SRS) y la microscopía coherente de dispersión Raman anti-Stokes (CARS) son las tecnologías de imágenes de dispersión Raman coherente más utilizadas. Las imágenes hiperespectrales SRS y CARS ofrecen información espectral Raman en cada píxel, lo que permite una mejor separación de las diferentes composiciones químicas. Aunque ambas técnicas requieren dos láseres de excitación, sus esquemas de detección de señales y propiedades espectrales son bastante diferentes. El objetivo de este protocolo es realizar imágenes hiperespectrales SRS y CARS en una sola plataforma y comparar las dos técnicas de microscopía para obtener imágenes de diferentes muestras biológicas. El método de enfoque espectral se emplea para adquirir información espectral utilizando láseres de femtosegundo. Mediante el uso de muestras químicas estándar, se comparan la sensibilidad, la resolución espacial y la resolución espectral de SRS y CARS en las mismas condiciones de excitación (es decir, potencia en la muestra, tiempo de permanencia de píxeles, lente objetivo, energía de pulso). Los contrastes de imagen de CARS y SRS para muestras biológicas se yuxtaponen y comparan. La comparación directa de los rendimientos de CARS y SRS permitiría una selección óptima de la modalidad de imagen química.

Comparaciones de la resolución espectral La Figura 2 compara la resolución espectral de la microscopía hiperespectral SRS (Figura 2A) y CARS (Figura 2B) utilizando una muestra DMSO. Para el espectro SRS, se aplicaron dos funciones lorentzianas (ver paso de protocolo 2.3) para ajustarse al espectro, y se obtuvo una resolución de 14,6 cm-1 utilizando el pico de 2.913 cm-1 . Para CARS, se u...

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Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging

Este artículo compara directamente la resolución, la sensibilidad y los contrastes de imagen de la dispersión Raman estimulada (SRS) y la dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS) integradas en la misma plataforma de microscopio. Los resultados muestran que CARS tiene una mejor resolución espacial, SRS da mejores contrastes y resolución espectral, y ambos métodos tienen una sensibilidad similar.

Comparación directa de la dispersión Raman estimulada hiperespectral y la microscopía de dispersión Raman antiespecial coherente para imágenes químicas

Stimulated Raman scattering (SRS) and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy are the most widely used coherent Raman scattering imaging ...

Este protocolo compara las dos técnicas de dispersión Raman coherentes hiperespectrales más utilizadas, incluida la dispersión Raman anti-Stokes coherente y los procesos de dispersión Raman estimulados, y esto permite a los biólogos elegir la mejor modalidad de imagen para sus aplicaciones biológicas. Utilizando las firmas vibratorias intrínsecas, la espectroscopia Raman coherente es capaz de mapear información química y muestras biológicas sin la necesidad de un etiquetado exógeno. La microscopía Raman coherente ha ampliado nuestra comprensión del metabolismo celular, el mapeo, la distribución de medicamentos, el diagnóstico de enfermedades y la cuantificación de cambios químicos.Esta es una técnica que requiere suficiente entrenamiento tanto en óptica como en espectroscopia. Recomendaría leer algunos artículos de revisión y ser entrenado por un experto antes de usar esta técnica. Para comenzar, prepare las diapositivas de imágenes colocando un trozo de cinta de doble cara en un resbalón de cubierta y recorte una pequeña forma rectangular de la cinta desde el centro de la cinta para crear un área abierta para que se coloque la muestra.Pipetee de 1 a 2 microlitros de DMSO puro y dispense la gota en el centro de la vacante. Coloque con cuidado el deslizamiento de la cubierta superior y coloque suavemente los bordes de los resbalones de la cubierta para sellar la cámara mientras se asegura de que la muestra DMSO no entre en contacto con los bordes de la cinta. Para experimentos de sensibilidad, prepare diluciones en serie de DMSO en óxido de deuterio para dar un rango de concentración de 50 a 0%Tome de 1 a 2 microlitros de cada solución y prepare muestras prensadas como se demostró anteriormente.Coloque la muestra en el escenario del microscopio y agregue agua o aceite de inmersión si es necesario para la lente o el condensador del objetivo. Mueva correctamente el borde de la gota DMSO en el campo de visión y ajuste la lente del objetivo para obtener el mejor enfoque, luego centre el condensador utilizando el método de iluminación Kohler y abra completamente el diafragma en el condensador. A continuación, ajuste la longitud de onda del haz de la bomba a 800 nanómetros para apuntar al pico CH3 del número de onda 2913 y ajuste la potencia tanto de la bomba como del haz stokes a aproximadamente 30 milivatios antes del microscopio ajustando la placa de media onda.Para SRS, establezca la ganancia del amplificador de bloqueo en aproximadamente 10 con una constante de tiempo de 7 microsegundos, lo que garantiza que la constante de tiempo sea menor que el tiempo de permanencia de píxeles. Establezca los parámetros de adquisición de imágenes y el software de adquisición utilizando un número de píxeles de 200 por 200 con el tamaño de escaneo de aproximadamente 100 por 100 micrómetros cuadrados, asegurándose de que la imagen contenga tanto la gota DMSO como un área vacía, luego escanee la muestra y verifique la imagen en la pantalla de la computadora. A continuación, escanee la imagen de retardo motorizado en el haz de la bomba Stokes mientras monitorea las imágenes en tiempo real y escanee sobre el retraso hasta que se maximice la señal.Mueva la gota DMSO para cubrir todo el campo de visión y compruebe si el máximo de señal de CC está centrado en la imagen, ya que la señal depende del haz de bombeo. Ajuste la posición del haz de la bomba a través de un espejo o el desplazamiento de voltaje en el software de imágenes. Después de la optimización de CC, ajuste los espejos de haz stokes hasta que se maximice la señal de CA ajustando el valor umbral para mostrar aproximadamente el 50% de saturación mientras verifica que la saturación esté centrada en la imagen.De lo contrario, ajuste los espejos solo en el haz de Stokes y monitoree la señal durante la alineación como retroalimentación en tiempo real sobre la calidad de la alineación. Para el análisis SNR, abra el software ImageJ e importe el archivo de texto de muestra DMSO guardado haciendo clic en Archivo, luego en Importar, seguido de las opciones Imagen de texto y Abrir del menú desplegable. Una vez importada la imagen, pulse Control Shift C para que aparezca la función Brillo y contraste, y, a continuación, pulse el botón Automático en la función Brillo y contraste hasta que la región de la muestra DMSO aparezca saturada para encontrar la señal de muestra máxima.A continuación, haga clic en la herramienta de selección Oval en la interfaz ImageJ y resalte un área pequeña de la región DMSO saturada. Después de resaltar, presione M para medir la media y la desviación estándar del área seleccionada. Para medir el fondo, ajuste las barras de la función Brillo y contraste hasta que se pueda observar la señal de la región vacía, luego haga clic en la selección Oval y resalte una región del fondo, asegurándose de que la región seleccionada no contenga DMSO.Después, presione M para medir las estadísticas del área seleccionada. A continuación, calcule el SNR como se demostró anteriormente midiendo el valor medio de ruido y el valor medio de la señal junto con la desviación estándar. Para procesar las imágenes CRS hiperespectrales, importe el archivo de texto haciendo clic en Archivo y, a continuación, en las opciones Importar, Imagen de texto y Abrir en el menú desplegable.Una vez importado, haga clic en Imagen, luego en Pilas, seguido de las opciones Herramientas y Montaje a Pila para convertir el archivo en una pila de imágenes, luego desplácese por el montaje hasta que el primer pico DMSO sea visible. Seleccione una región en el DMSO y haga clic en Imagen, seguido de las opciones Apilar y Trazar perfil de eje Z para trazar el espectro de intensidad versus número de fotograma. A continuación, haga clic en Lista y copie los datos del perfil para extraer los datos espectrales sin procesar.Para convertir el espectro recuperado en unidades de frecuencia, realice una regresión lineal utilizando el estiramiento CH simétrico y asimétrico de DMSO y sus correspondientes números de trama. La resolución espectral del DMSO se midió utilizando una microscopía hiperespectral SRS y CARS, que muestran una resolución de 14.6 y 17.1 números de onda respectivamente, lo que indica que SRS tiene una mejor resolución espectral. Los espectros DMSO SRS se obtuvieron a concentraciones de 0.1 y 0.01% en las que el pico en el número de onda 2913 se puede resolver en el primero, pero no en el segundo, lo que indica que el límite de detección está entre 0.1 y 0.01% DMSO.Los espectros CARS recuperados en fase muestran que el pico de número de onda DMSO 2913 se puede resolver claramente para el 0.1% DMSO, pero no el 0.01%que indica un límite de detección entre estas dos concentraciones. Los perfiles de intensidad SRS y CARS de una célula MIA PaCA-2 demostraron que la señal SRS dio una resolución de 398,6 nanómetros, mientras que la señal CARS dio una resolución 1,2 veces mejor de 330,3 nanómetros. Las imágenes SRS y CARS de las células MIA PaCa-2 en diferentes posiciones de retardo óptico muestran las señales más fuertes con gotas de lípidos como puntos brillantes para SRS, mientras que CARS tiene contrastes muy reducidos.Sin embargo, un cambio al rojo de 37 números de onda en el enfoque espectral mejoró los contrastes de lípidos tanto para SRS como para CARS. Los espectros SRS muestran una señal mucho más fuerte en un número de onda de 2850 para las gotas de lípidos que otros orgánulos, mientras que los espectros CARS muestran un pequeño desplazamiento al rojo. Para optimizar la señal de dispersión Raman coherente, primero busque el enfoque de la muestra, luego ajuste el retardo óptico y, finalmente, ajuste los espejos hasta que se logre un máximo.Otras tecnologías de bomba-sonda, como la absorción transitoria, están inherentemente integradas en la plataforma CRS. Esta tecnología es muy potente para medir la cinética de absorción de moléculas no fluorescentes que absorben luz fuerte. Esta técnica permite a los investigadores ver moléculas pequeñas de una manera libre de etiquetas con alta actividad química celular.También permite a los investigadores ver los cambios en el metabolismo de los lípidos, la dinámica intracelular y la distribución de fármacos.

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