Name: investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

تلقى هذا المشروع تمويلا من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج أفق 2020 للبحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي (اتفاقية المنحة رقم 803589)، ومؤسسة العلوم الإسرائيلية (منحة ISF رقم 1815/18)، والمنح الكندية الإسرائيلية (CIHR-ISF، المنحة رقم 2591/18). نشكر نيشاما نوفيك على تعليقه على المخطوطة بأكملها.

تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في الجامعة العبرية وتلبية المبادئ التوجيهية للدليل الوطني للصحة لرعاية واستخدام المختبر.
1. نقل النواقل الفيروسية
ملاحظة: يستخدم نقل النواقل الفيروسية للتعبير عن الفلورو?...

<ol>
	<li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+astrocytes+process+and+control+synaptic+information.">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li><li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease.">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li><li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema,+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model.">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).</li><li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema.">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li><li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement.">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li><li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+in+memory+function:+pioneering+findings+and+future+directions.">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li><li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits.">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li><li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels.">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).</li><li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons.">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li><li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human.">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915 (2016).</li><li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development.">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus.">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuit-specialized+astrocytes:+transcriptomic,+proteomic,+morphological,+and+functional+evidence.">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex.">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval.">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo.">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li></ol>

تقدم طرق تطهير الأنسجة أداة ثورية في أبحاث الدماغ ، مما يدعو إلى أسئلة لم يكن من الممكن طرحها من قبل. من استهداف خصائص مجموعة صغيرة من الخلايا أو خلية واحدة أو حتى مشبك واحد ، يتيح CLARITY الآن استهداف إجمالي عدد الخلايا أو ميزات الاتصال بعيدة المدى باستخدام الفلوروفورات ذات الصلة.
<p class="jove_co...

في السنوات الأخيرة ، زادت معرفة وظيفة الخلايا النجمية وكيفية تفاعلها مع الدوائر العصبية بشكل كبير. يمكن للخلايا النجمية التأثير على اللدونة1,2 ، والمساعدة في استعادة الخلايا العصبية بعد الإصابة3,4 ، وحتى تحفيز التقوية العصبية الجديدة ، حيث أظهرت الدراسات الحديثة أهمية الخلايا النجمية في اكتساب الذاكرة ومكافأتها ، والتي كانت تعتبر سابقا وظائف عصبية بحتة 5,6,7 . ميزة ذات أهمية خاصة في أبحاث الخلايا النجمية هي الترتيب المكاني للخلايا ، والتي تحافظ على منظمات مكانية فريدة من نوعها في الحصين وهياكل الدماغ الأخرى8،9،10. على عكس التشعبات العصبية التي تتشابك بين سوماتا الخلية ، تعيش الخلايا النجمية الحصين في مناطق يمكن تمييزها بصريا مع تداخل طفيف بين عملياتها ، مما يخلق مجالات متميزة8،11،12،13. الأدلة التي تدعم مشاركة الخلايا النجمية في الدوائر العصبية لا تدعم عدم وجود وصف تشريحي مفصل لمثل هذه المجموعات والخلايا العصبية في مجالاتها14.
تم تعميم إجراءات نقل النواقل الفيروسية ، إلى جانب الحيوانات المعدلة وراثيا (TG) ، كمجموعة أدوات للتحقيق في هياكل الدماغ ووظائفه وتفاعلات الخلايا15,16. يسمح استخدام المروجين المختلفين باستهداف خلايا معينة وفقا لخصائصها الجينية أو مستويات التنشيط17,18 أو أهداف الإسقاط. يمكن للفيروسات المختلفة التعبير عن الفلوروفورات الملونة المختلفة في مجموعات سكانية مختلفة. يمكن الجمع بين الفيروس والتعبير الداخلي للفلوروفورات في TG ، أو يمكن استخدام TG دون الحاجة إلى الفيروسات. تستخدم هذه التقنيات على نطاق واسع لوضع العلامات العصبية ، وبدأت بعض المختبرات في استخدامها مع تعديلات متخصصة لاستهداف أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا النجمية5،9،19.
تمكن تقنية CLARITY ، التي تم وصفها لأول مرة في عام2013 20,21 ، من دراسة شرائح الدماغ السميكة عن طريق جعل الدماغ بأكمله شفافا مع ترك الهياكل المجهرية سليمة. من خلال الجمع بين الطريقتين - نقل النواقل الفيروسية وتطهير الأنسجة - يتوفر الآن خيار فحص التفاعلات المكانية بين مجموعات مختلفة من أنواع الخلايا. تم إجراء معظم دراسات التفاعل بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية على شرائح رقيقة من الدماغ ، مما أدى إلى صور للخلايا النجمية غير المكتملة بسبب مجالاتها الكبيرة ، مما أدى إلى تقييد عدد الخلايا التي تم تحليلها بشكل جذري. يسمح استخدام تقنية CLARITY بتوصيف دقة الخلية الواحدة لمجموعات الخلايا بكميات كبيرة في وقت واحد. لا يوفر تصوير مجموعات الخلايا الموسومة بالفلورسنت في أدمغة واضحة دقة متشابكة ولكنه يسمح بتوصيف شامل للتفاعلات المكانية بين الخلايا النجمية ومجموعة متنوعة من أنواع الخلايا العصبية.
لهذا السبب، قمنا بتسخير هذه التقنيات الحديثة للتحقيق في خصائص الخلايا النجمية في جميع أنحاء CA1 الظهرية، وتصوير جميع الصفيحات (Stratum Radiatum، الطبقة الهرمية، و Stratum Oriens). قمنا بقياس عشرات الآلاف من الخلايا النجمية (مع اختراق فيروسي بنسبة >96٪ 5) ، وبالتالي تحليل معلومات جميع سكان الخلايا النجمية حول CA1. مع الاختراق الفعال للعلامات العصبية ، يمكننا تسجيل التفاعلات بين جميع سكان الخلايا النجمية CA1 والأنواع الأربعة من الخلايا العصبية - بارفالبومين (PV) ، السوماتوستاتين (SST) ، الخلايا العصبية المثبطة VIP ، والخلايا الهرمية المثيرة9.
تم إجراء العديد من التجارب باستخدام مزيج من التألق من TG وناقلات فيروسية مختلفة الألوان (جميع الخلايا المثبطة) ، في حين استخدمت تجارب أخرى (مثيرة) ناقلين فيروسيين يعبران عن فلوروفورات مختلفة تحت مروجين مختلفين9. تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا ، بما في ذلك وضع علامات على الخلايا المرغوبة في الدماغ ، مما يجعل الدماغ شفافا باستخدام إجراء CLARITY المعدل ، بالإضافة إلى تصوير وتحليل هياكل الدماغ الكاملة ، باستخدام العديد من الإجراءات والبرمجيات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1-GFAP::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neuronal nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (40%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide (2%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#B7901</td>
			<td>Molecular weight - 61.83 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, scanning, FV1000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane, UK</td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 4%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>#15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RC147002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images using virtual reality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base 1 M</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#002009239100</td>
			<td>Molecular weight - 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>#sc-29112A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon microscope</td>
			<td>Neurolabware</td>
			<td></td>
			<td>Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044 Initiator</td>
			<td>Wako</td>
			<td>#011-19365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains

إن الجمع بين نقل النواقل الفيروسية وإزالة الأنسجة باستخدام طريقة CLARITY يجعل من الممكن التحقيق في وقت واحد في عدة أنواع من خلايا الدماغ وتفاعلاتها. يتيح نقل النواقل الفيروسية وضع علامات على أنواع الخلايا المتنوعة بألوان فلورية مختلفة داخل نفس الأنسجة. يمكن تحديد الخلايا وراثيا عن طريق النشاط أو الإسقاط. باستخدام بروتوكول CLARITY المعدل ، نما حجم العينة المحتملة للخلايا النجمية والخلايا العصبية بمقدار 2-3 أوامر من الحجم. يسمح استخدام CLARITY بتصوير الخلايا النجمية الكاملة ، والتي هي أكبر من أن تتناسب بالكامل مع شرائح ، وفحص somata بجميع عملياتها. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يوفر الفرصة للتحقيق في التفاعل المكاني بين الخلايا النجمية وأنواع الخلايا العصبية المختلفة ، أي عدد الخلايا العصبية الهرمية في كل مجال من مجالات الخلايا النجمية أو القرب بين الخلايا النجمية ومجموعات الخلايا العصبية المثبطة المحددة. تصف هذه الورقة بالتفصيل كيفية تطبيق هذه الأساليب.

يؤدي التطهير الناجح لشرائح أنسجة المخ السميكة إلى مجموعة جديدة من الأسئلة التي يمكن طرحها فيما يتعلق بخصائص مجموعات الخلايا الكبيرة بدلا من خصائص الخلايا المفردة أو المجموعات المجاورة من الخلايا. لتحقيق نتائج ناجحة ، يجب على المرء الالتزام الصارم ببروتوكول CLARITY ، حيث توجد مجموعة واسعة م?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

يسمح الجمع بين نقل النواقل الفيروسية وتطهير الدماغ باستخدام طريقة CLARITY بالتحقيق في عدد كبير من الخلايا العصبية والخلايا النجمية في وقت واحد.

التحقيق في التفاعل المكاني بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية في الأدمغة الواضحة

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

تقنية الوضوح التي تم وصفها لأول مرة في عام 2013 هي تقنية إزالة الأنسجة التي تمكن من أخذ عينات من كميات أكبر من الخلايا والأوعية الدموية ، لذلك حتى البروتينات مثل دقة الخلية الواحدة في شرائح الدماغ السميكة. تمكن هذه التقنية من دراسة الهياكل المجهرية السليمة عن طريق جعل الدماغ بأكمله شفافا. هذا البروتوكول عبارة عن شريحة بسيطة وخط أنابيب مباشر لتنظيف الأنسجة.يمكن استخدام هذه التقنية لتطهير الأنسجة في أنظمة أخرى بالإضافة إلى أنسجة المخ. للبدء ، قم بإغلاق الأنبوب والغطاء باستخدام parafilm وثقب ثقبين في الغطاء. ثم انقل غاز النيتروجين من الخزان باستخدام أنبوب مرن بقطر داخلي يبلغ خمسة ملليمترات وإبرة قياس 19 متصلة في نهايته.ابدأ في إزالة الغاز عن طريق توصيل الأنبوب بالأنبوب والسماح بتبادل الغاز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. افصل الأنبوب وأغلق الثقوب على الفور باستخدام طين النمذجة. ثم انقل الأنابيب المختومة بالديغا إلى حمام 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ونصف الساعة لبلمرة محلول الهيدروجيل.أخرج الدماغ من الأنبوب. باستخدام مناديل المختبر، قم بإزالة الهيدروجيل المبلمر حول الدماغ لضمان عدم بقاء أي جل متبقي ملتصقا بسطح الدماغ. قسم الدماغ إلى شرائح سميكة تحتوي على جميع مجالات الاهتمام.ضع الشرائح في محلول المقاصة الأول واحتضنها عند 37 درجة مئوية مع الدوران عند 70 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. في غضون ذلك ، قم بإعداد أنبوب مثقب لوضع الدماغ. ضع الأنبوب المثقب في كوب مملوء بمحلول إزالة ثان على جهاز تحريك.ثم ضع الدماغ في الكأس وختمه بورق الألومنيوم لمنع التبييض. بعد أن يصبح النسيج شفافا ، انقل الدماغ إلى PBST في حضانة عند 37 درجة مئوية مع دوران عند 70 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. استبدل المحلول ب PBST طازج واستمر في الحضانة لمدة 24 ساعة أخرى.ثم انقل الدماغ إلى PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الدماغ من PBS ونقله إلى محلول مطابقة معامل الانكسار. احتضان الدماغ عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.أولا، ضع العينة في منتصف الشريحة. باستخدام الغراء الساخن ، قم بإنشاء جدران على حواف الشريحة ، تقريبا مثل الأنسجة. تأكد من ترك فجوة صغيرة في أحد الزوايا.عندما تقترب طبقة الغراء الساخن من ارتفاع شريحة الدماغ ، ضع قطرة إلى قطرتين من محلول مطابقة معامل الانكسار على العينة لترطيب السطح العلوي ومنع تكوين الفقاعة. بينما لا يزال الغراء الساخن سائلا ، أغلق الجزء العلوي بزلة غطاء ، وضعه بالتساوي قدر الإمكان ثم املأ الغرفة بمحلول مطابقة معامل الانكسار. أغلق الفجوة بالغراء الساخن.إذا امتدت جدران الغراء الساخن خارج حدود الشريحة ، فقم بقطع الحواف الممتدة. إذا تم استخدام هدف غمر الزيت للتصوير ، فأضف من اثنين إلى ثلاثة ملليمترات أخرى من الغراء إلى الجدران فوق الغطاء للاحتفاظ بمحلول الغمر. بعد هذا البروتوكول ، سيتم مسح أنسجة المخ.تم إعداد شرائح دماغية واضحة باستخدام هذا البروتوكول لتصور مجموعات من الخلايا النجمية والخلايا العصبية في منطقة CA1 من الحصين الفأر. عبرت جميع الخلايا النجمية عن tdTomato وعبرت الخلايا العصبية المثيرة عن H2B-GFP في نواتها. كانت الغرفة المعدة للأنسجة المصفاة مثالية للتصوير تحت فوتون اثنين أو مجهر بؤري.باستخدام مجهرين فوتونيين ، تم رصد أكثر من 300 خلية نجمية في قسم واضح من منطقة CA1 من الحصين الفأر. كانت الخلايا النجمية الحصين في الخلايا الحمراء والهرمية ، والسوماتا باللون الأخضر مرئية وسميكة وشفافة تمثل القرب المكاني بين هذين النوعين من الخلايا. باستخدام المجهر البؤري بالليزر الماسح ، تم تتبع الحزم المحورية من الخلايا العصبية المثيرة عبر نصف الكرة الأرضية بأكمله.تم تتبع الحزم الخضراء من الحصين الظهري نحو الأجسام الثديية الفائقة. تم تتبع الحزم الحمراء من أجسام الثدييات نحو أصلها في الحصين تنفيس. أثرت العوامل ، مثل درجة الحرارة والتركيزات ووقت الحضانة على نتيجة إجراء الوضوح.لذلك ، فإن الدقة في كل خطوة من خطوات البروتوكول أمر حيوي لنجاح تحقيق أنسجة واضحة. باستخدام هذه التقنية ، نقيس المسافات بين الخلايا العصبية والخلايا النجمية في العديد من هياكل الدماغ. سمح هذا البروتوكول بتحليل اثنين إلى ثلاثة من الخلايا ذات الحجم أكثر مما كان عليه في الدراسات السابقة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

العزلة وثقافة الخلايا النجمية الماوس القشرية

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

عن طريق اللمس تكييف وتحليل حركة استراتيجيات أخذ العينات Antennal في نحل العسل (<em&gt; أبيس mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

على الإحاطة الفحص: بروتوكول لتقييم التفاعلات بين الخلايا العصبية والجهاز العصبي المركزي البالعات

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

العزلة والثقافة وطويل الأجل صيانة الابتدائية الدماغ المتوسط ​​الدوبامين العصبية من المخ الجنينية القوارض

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

بروتوكول للثلاثي الأبعاد متحد البؤر تحليل المظهرية من النجمية

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

العزلة واستخراج الحمض النووي الريبي للخلايا العصبية والضامة وميكروجليا من العقول الزرد اليرقات

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

التصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للعدوى بفيروس داء الكلب في أنسجة الدماغ التي تم تطهيرها من المذيبات

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

تصور وتحليل النقل داخل الخلايا من العضيات وغيرها من الشحنات في الخلايا النجمية

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

إنشاء منصة فيزيولوجية كهربية لنمذجة ALS مع الخلايا النجمية والخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات الخاصة بالمنطقة

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...