Name: investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

Dette projekt har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram (tilskudsaftale nr. 803589), Israel Science Foundation (ISF-bevilling nr. 1815/18) og Canada-Israel-bevillingerne (CIHR-ISF, bevilling nr. 2591/18). Vi takker Nechama Novick for at kommentere hele manuskriptet.

Eksperimentelle protokoller blev godkendt af Hebrew University Animal Care and Use Committee og opfyldte retningslinjerne fra National Institute of Health Guide for care and Use of Laboratory Animals.
1. Viral vektortransduktion
BEMÆRK: Viral vektortransduktion bruges til at udtrykke fluoroforer i hjernen.
<ol><li>Brug et atlas (f.eks. Allen Brain Atlas) til at lokalisere den relevante koordinering af målområdet. BEMÆRK: 3D-atlasser kan fin...

<ol>
	<li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+astrocytes+process+and+control+synaptic+information.">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li><li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease.">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li><li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema,+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model.">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).</li><li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema.">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li><li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement.">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li><li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+in+memory+function:+pioneering+findings+and+future+directions.">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li><li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits.">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li><li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels.">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).</li><li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons.">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li><li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human.">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915 (2016).</li><li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development.">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus.">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuit-specialized+astrocytes:+transcriptomic,+proteomic,+morphological,+and+functional+evidence.">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex.">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval.">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo.">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li></ol>

Vævsrensningsmetoder præsenterer et revolutionerende værktøj inden for hjerneforskning, der inviterer til spørgsmål, der ikke tidligere kunne have været stillet. Fra at målrette mod egenskaberne for en lille gruppe celler, en enkelt celle eller endda en enkelt synaps muliggør CLARITY nu målretning af samlede cellepopulationer eller langtrækkende forbindelsesfunktioner ved hjælp af relevante fluoroforer.
Resultatet af kombinationen af fluoroforekspression og CLARITY-procedure er ikk...

I de senere år er kendskabet til astrocytfunktion og hvordan de interagerer med neuronale kredsløb steget dramatisk. Astrocytter kan påvirke plasticitet 1,2, hjælpe med neuronal genopretning efter mened 3,4 og endda inducere de novo neuronal potensering, med nylige undersøgelser, der udviser astrocytternes betydning i hukommelseserhvervelse og belønning, tidligere betragtet som rent neuronale funktioner 5,6,7 . Et træk af særlig interesse for astrocytforskning er cellernes rumlige arrangement, som opretholder unikke rumlige organisationer i hippocampus og andre hjernestrukturer 8,9,10. I modsætning til de neuronale dendritter, der fletter sig ind mellem celle somata, beboer hippocampale astrocytter visuelt skelnelige territorier med let overlapning mellem deres processer, hvilket skaber forskellige domæner 8,11,12,13. Beviserne til støtte for astrocytters deltagelse i neuronale kredsløb understøtter ikke manglen på detaljeret anatomisk beskrivelse af sådanne populationer og neuronerne i deres domæner14.
Virale vektortransduktionsprocedurer sammen med transgene dyr (TG) er blevet populariseret som et værktøjssæt til at undersøge hjernestrukturer, funktioner og celleinteraktioner15,16. Udnyttelsen af forskellige promotorer tillader målretning af specifikke celler i henhold til deres genetiske egenskaber, aktiveringsniveauer17,18 eller projektionsmål. Forskellige vira kan udtrykke forskellige farvede fluoroforer i forskellige populationer. En virus kan kombineres med den endogene ekspression af fluoroforer i TG, eller TG-dyr kan anvendes uden behov for vira. Disse teknikker anvendes i vid udstrækning til neuronal mærkning, og nogle laboratorier er begyndt at bruge dem med modifikationer, der er specialiserede til at målrette mod andre celletyper, såsom astrocytter 5,9,19.
CLARITY-teknikken, der først blev beskrevet i 201320,21, gør det muligt at studere tykke hjerneskiver ved at gøre hele hjernen gennemsigtig, samtidig med at de mikroskopiske strukturer forbliver intakte. Ved at kombinere de to metoder - viral vektortransduktion og vævsclearing - er muligheden for at undersøge de rumlige interaktioner mellem forskellige celletypepopulationer nu tilgængelig. De fleste astrocyt-neuron-interaktionsundersøgelser blev udført på tynde hjerneskiver, hvilket resulterede i billeder af ufuldstændige astrocytter på grund af deres store domæner, hvilket radikalt begrænsede antallet af analyserede celler. Anvendelsen af CLARITY-teknikken muliggør karakterisering af enkeltcelleopløsning af cellepopulationer i store mængder samtidigt. Billeddannelse fluorescerende mærkede cellepopulationer i klare hjerner leverer ikke synaptisk opløsning, men tillader grundig karakterisering af de rumlige interaktioner mellem astrocytter og en række neuronale celletyper.
Af den grund udnyttede vi disse state-of-the-art teknikker til at undersøge astrocytternes egenskaber i hele den dorsale CA1 og afbilde alle lamina (Stratum Radiatum, pyramidelag og Stratum Oriens). Vi målte titusinder af astrocytter (med viral penetrans på >96%5) og analyserede derved informationen om hele den astrocytiske befolkning omkring CA1. Med effektiv penetrans af neuronale markører kunne vi registrere interaktionerne mellem hele populationen af CA1-astrocytter og de fire typer neuronale celler-parvalbumin (PV), somatostatin (SST), VIP-hæmmende neuroner og excitatoriske pyramideceller9.
Flere eksperimenter blev udført ved anvendelse af en kombination af fluorescens fra TG-dyr og forskelligt farvede virale vektorer (alle hæmmende celler), mens andre (excitatoriske) anvendte to virale vektorer, der udtrykte forskellige fluoroforer under forskellige promotorer9. Dette papir præsenterer en detaljeret protokol, herunder mærkning af de ønskede celler i hjernen, hvilket gør hjernen gennemsigtig ved hjælp af en modificeret CLARITY-procedure samt billeddannelse og analyse af komplette hjernestrukturer ved hjælp af forskellige procedurer og software.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1-GFAP::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neuronal nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (40%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide (2%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#B7901</td>
			<td>Molecular weight - 61.83 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, scanning, FV1000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane, UK</td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 4%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>#15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RC147002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images using virtual reality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base 1 M</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#002009239100</td>
			<td>Molecular weight - 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>#sc-29112A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon microscope</td>
			<td>Neurolabware</td>
			<td></td>
			<td>Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044 Initiator</td>
			<td>Wako</td>
			<td>#011-19365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains

Ved at kombinere viral vektortransduktion og vævsclearing ved hjælp af CLARITY-metoden er det muligt samtidig at undersøge flere typer hjerneceller og deres interaktioner. Viral vektortransduktion muliggør mærkning af forskellige celletyper i forskellige fluorescensfarver inden for det samme væv. Celler kan identificeres genetisk ved aktivitet eller projektion. Ved hjælp af en modificeret CLARITY-protokol er den potentielle prøvestørrelse af astrocytter og neuroner vokset med 2-3 størrelsesordener. Brugen af CLARITY gør det muligt at afbilde komplette astrocytter, som er for store til at passe i deres helhed i skiver, og undersøgelse af somata med alle deres processer. Derudover giver det mulighed for at undersøge den rumlige interaktion mellem astrocytter og forskellige neuronale celletyper, nemlig antallet af pyramidale neuroner i hvert astrocytisk domæne eller nærheden mellem astrocytter og specifikke hæmmende neuronpopulationer. Dette papir beskriver i detaljer, hvordan disse metoder skal anvendes.

Vellykket rydning af tykke hjernevævsskiver resulterer i en ny række spørgsmål, der kan stilles vedrørende egenskaberne hos store cellepopulationer i modsætning til egenskaberne af enkeltceller eller nabogrupper af celler. For at opnå vellykkede resultater bør man nøje overholde CLARITY-protokollen, da der er en lang række parametre, der skal overvejes for at reducere variansen mellem prøver (f.eks. Procentdel af klarhed, fluorescensinformation, hævedehedsparametre).
<strong class=...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Kombination af viral vektortransduktion og hjernerydning ved hjælp af CLARITY-metoden muliggør undersøgelse af et stort antal neuroner og astrocytter samtidigt.

Undersøgelse af rumlig interaktion mellem astrocytter og neuroner i ryddede hjerner

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

Klarhedsteknikken, der først blev beskrevet i 2013, er en vævsclearingteknik, der muliggør prøveudtagning af større mængder celler, blodkar, så selv proteiner en enkeltcelleopløsning i tykke hjerneskiver. Denne teknik gør det muligt at studere intakte mikroskopiske strukturer ved at gøre hele hjernen gennemsigtig. Denne protokol er en simpel chip og ligetil pipeline til vævsklar.Denne teknik kan bruges til at rydde væv i andre systemer ud over hjernevæv. Til at begynde med skal du forsegle røret og hætten ved hjælp af parafilm og punktere to huller i hætten. Overfør derefter nitrogengas fra tanken ved hjælp af et fleksibelt rør med fem millimeter indvendig diameter og en 19 gauge nål forbundet i dens ende.Start afgasning ved at fastgøre røret til røret og tillade gasudveksling i 30 minutter ved stuetemperatur. Fjern røret og forsegl straks hullerne med modellervoks. Overfør derefter de afgasforseglede rør til et bad på 37 grader Celsius i 3 1/2 time for at polymerisere hydrogelopløsningen.Tag hjernen ud af røret. Ved hjælp af laboratorieservietter skal du fjerne den polymeriserede hydrogel omkring hjernen, hvilket sikrer, at ingen resterende gel forbliver fastgjort til hjernens overflade. Opdel hjernen i tykke skiver, der indeholder alle områder af interesse.Sæt skiverne i den første clearingopløsning og inkuber ved 37 grader Celsius med rotation ved 70 rpm i 24 timer. I mellemtiden skal du forberede et perforeret rør til at placere hjernen. Sæt det perforerede rør i et bægerglas fyldt med anden clearingopløsning på en omrøringsanordning.Anbring derefter hjernen i bægerglasset og forsegl den med aluminiumsfolie for at forhindre blegning. Når vævet bliver gennemsigtigt, overføres hjernen til PBST i inkubation ved 37 grader Celsius med rotation ved 70 RPM i 24 timer. Udskift opløsningen med frisk PBST og fortsæt inkubationen i yderligere 24 timer.Overfør derefter hjernen til PBS ved stuetemperatur i 24 timer. Efter 24 timer skal du fjerne hjernen fra PBS og overføre den til brydningsindeksmatchningsopløsning. Inkuber hjernen ved 37 grader Celsius natten over.Placer først prøven midt på diaset. Brug varm lim til at skabe vægge på kanterne af diaset, næsten lige så højt som vævet. Sørg for at efterlade et lille hul i et af hjørnerne.Når det varme limlag nærmer sig højden af hjerneskiven, påføres en til to dråber af brydningsindeksmatchningsopløsningen på prøven for at fugte den øvre overflade og forhindre bobledannelse. Mens den varme lim stadig er flydende, skal du forsegle toppen med en dækseddel, placere den så jævnt som muligt og derefter fylde kammeret med brydningsindeksmatchningsopløsningen. Luk hullet med varm lim.Hvis de varme limvægge strækker sig ud over diasets grænser, skal du skære de forlængende kanter. Hvis der anvendes et olienedsænkningsmål til billeddannelse, skal du tilføje yderligere to til tre millimeter lim til væggene over dækslet for at bevare nedsænkningsopløsningen. Efter denne protokol vil hjernevævet blive ryddet.Klare hjerneskiver blev fremstillet ved hjælp af denne protokol til at visualisere populationer af astrocytter og neuroner i CA1-regionen af museflodppocampus. Alle astrocytter udtrykt tdTomato og excitatoriske neuroner udtrykt H2B-GFP i deres kerner. Kammeret forberedt til det klarede væv var optimalt til billeddannelse under et to foton eller konfokal mikroskop.Ved hjælp af et mikroskop med to fotoner blev over 300 astrocytter observeret i en ryddet del af CA1-regionen i musens hippocampus. De hippocampale astrocytter i røde og pyramideformede celler, somata i grønt, var synlige og tykke, gennemsigtige væv, der repræsenterer den rumlige nærhed mellem disse to celletyper. Ved hjælp af et scanningslaserkonfokalmikroskop blev aksonale bundter fra excitatoriske neuroner sporet over en hel halvkugle.Grønne bundter blev sporet fra den dorsale hippocampus mod de supermamillære kroppe. De røde bundter blev sporet fra de mamillære kroppe mod deres oprindelse ved udluftningsflodhestcampus. Faktorer som temperatur, koncentrationer og inkubationstid påvirkede resultatet af klarhedsproceduren.Derfor er præcision i hvert trin i protokollen afgørende for succesen med at opnå klart væv. Ved hjælp af denne teknik måler vi afstandene mellem neuroner og astrocytter i flere hjernestrukturer. Denne protokol tillod analyse af to til tre størrelsesordener flere celler end i tidligere undersøgelser.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolering og Kultur Mouse Cortikale Astrocytes

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

Taktil Conditioning og bevægelse Analyse af Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

En engulfment Assay: En protokol til Vurdere Interaktioner mellem CNS Fagocytter og neuroner

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolation, Kultur og opretholdelse på lang sigt af Primary mesencephaliske dopaminerge neuroner af embryonale Gnavere Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokol til tredimensionel Konfokal Morfometrisk Analyse af Astrocytter

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolation og RNA udvinding af neuroner, makrofager og mikroglia fra larve zebrafisk hjerner

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

3D-billeddannelse i høj opløsning af rabies virus infektion i et solvent renset hjernevæv

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Visualisering og analyse af intracellulær transport af organelles og andre Cargos i astrocytter

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

Etablering af en elektrofysiologisk platform til modellering af ALS med regionalt specifikke humane pluripotente stamcelleafledte astrocytter og neuroner

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...