Name: investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

Dit project heeft financiering ontvangen van de European Research Council (ERC) in het kader van het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie (subsidieovereenkomst nr. 803589), de Israel Science Foundation (ISF-subsidie nr. 1815/18) en de Canada-Israël-subsidies (CIHR-ISF, subsidie nr. 2591/18). We bedanken Nechama Novick voor het becommentariëren van het hele manuscript.

Experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Hebrew University Animal Care and Use Committee en voldeden aan de richtlijnen van het National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Virale vectortransductie
OPMERKING: Virale vectortransductie wordt gebruikt om fluoroforen in de hersenen tot expressie te brengen.
<ol><li>Gebruik een atlas (bijv. Allen Brain Atlas) om de relevante coördinatie van het doelgebi...

<ol>
	<li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+astrocytes+process+and+control+synaptic+information.">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li><li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease.">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li><li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema,+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model.">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).</li><li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema.">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li><li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement.">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li><li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+in+memory+function:+pioneering+findings+and+future+directions.">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li><li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits.">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li><li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels.">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).</li><li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons.">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li><li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human.">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915 (2016).</li><li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development.">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus.">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuit-specialized+astrocytes:+transcriptomic,+proteomic,+morphological,+and+functional+evidence.">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex.">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval.">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo.">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li></ol>

Weefselverwijderingsmethoden vormen een revolutionair hulpmiddel in hersenonderzoek en nodigen vragen uit die voorheen niet konden worden gesteld. Van het richten op de eigenschappen van een kleine groep cellen, een enkele cel of zelfs een enkele synaps, maakt CLARITY nu het richten van totale celpopulaties of connectiviteitsfuncties op lange afstand mogelijk door relevante fluoroforen te gebruiken.
De uitkomst van de combinatie fluorofoorexpressie en CLARITY-procedure is niet binair; veel fac...

In de afgelopen jaren is de kennis van astrocytenfunctie en hoe ze interageren met neuronale circuits dramatisch toegenomen. Astrocyten kunnen de plasticiteitbeïnvloeden 1,2, helpen bij neuronaal postinjuryherstel 3,4 en zelfs de novo neuronale potentiëring induceren, waarbij recente studies het belang van astrocyten in geheugenverwerving en beloning aantonen, voorheen beschouwd als puur neuronale functies 5,6,7 . Een kenmerk van bijzonder belang in astrocytenonderzoek is de ruimtelijke ordening van de cellen, die unieke ruimtelijke organisaties in de hippocampus en andere hersenstructuren behouden 8,9,10. In tegenstelling tot de neuronale dendrieten die zich verstrengelen tussen cel somata, bewonen hippocampale astrocyten visueel te onderscheiden gebieden met lichte overlap tussen hun processen, waardoor verschillende domeinenontstaan 8,11,12,13. Het bewijs dat de deelname van astrocyten aan neuronale circuits ondersteunt niet het gebrek aan gedetailleerde anatomische beschrijving van dergelijke populaties en de neuronen in hun domeinen14.
Virale vectortransductieprocedures, samen met transgene dieren (TG), zijn gepopulariseerd als een toolset om hersenstructuren, functies en celinteracties te onderzoeken15,16. Het gebruik van verschillende promotors maakt het mogelijk om specifieke cellen te richten op basis van hun genetische eigenschappen, activeringsniveaus17,18 of projectiedoelen. Verschillende virussen kunnen verschillende gekleurde fluoroforen uitdrukken in verschillende populaties. Een virus kan worden gecombineerd met de endogene expressie van fluoroforen in TG, of TG-dieren kunnen worden gebruikt zonder dat er virussen nodig zijn. Deze technieken worden veel gebruikt voor neuronale markering en sommige laboratoria zijn ze gaan gebruiken met modificaties die gespecialiseerd zijn voor het richten op andere celtypen, zoals astrocyten 5,9,19.
De CLARITY-techniek, voor het eerst beschreven in 201320,21, maakt de studie van dikke hersenplakken mogelijk door de hele hersenen transparant te maken terwijl de microscopische structuren intact blijven. Door de combinatie van de twee methoden - virale vectortransductie en weefselverwijdering - is nu de mogelijkheid beschikbaar om de ruimtelijke interacties tussen verschillende celtypepopulaties te onderzoeken. De meeste astrocyten-neuron interactiestudies werden uitgevoerd op dunne hersenplakken, wat resulteerde in afbeeldingen van onvolledige astrocyten vanwege hun grote domeinen, waardoor het aantal geanalyseerde cellen radicaal werd beperkt. Het gebruik van de CLARITY-techniek maakt eencellige resolutiekarakterisering van celpopulaties in grootschalige volumes tegelijkertijd mogelijk. Het afbeelden van fluorescerend gelabelde celpopulaties in heldere hersenen levert geen synaptische resolutie op, maar maakt een grondige karakterisering van de ruimtelijke interacties tussen astrocyten en een verscheidenheid aan neuronale celtypen mogelijk.
Om die reden hebben we deze state-of-the-art technieken gebruikt om de eigenschappen van astrocyten in de dorsale CA1 te onderzoeken, waarbij we alle lamina (Stratum Radiatum, piramidale laag en Stratum Oriens) in beeld brengen. We hebben tienduizenden astrocyten gemeten (met virale penetrantie van >96%5), waarbij we de informatie van de hele astrocytische populatie rond CA1 hebben geanalyseerd. Met efficiënte penetrantie van de neuronale markers konden we de interacties registreren tussen de hele populatie van CA1-astrocyten en de vier soorten neuronale cellen- parvalbumine (PV), somatostatine (SST), VIP-remmende neuronen en exciterende piramidale cellen9.
Verschillende experimenten werden uitgevoerd met behulp van een combinatie van fluorescentie van TG-dieren en verschillend gekleurde virale vectoren (alle remmende cellen), terwijl anderen (exciterend) twee virale vectoren gebruikten die verschillende fluoroforen onder verschillende promotors tot expressie brachten9. Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol, inclusief het taggen van de gewenste cellen in de hersenen, het transparant maken van de hersenen met behulp van een aangepaste CLARITY-procedure, evenals beeldvorming en analyse van volledige hersenstructuren, met behulp van verschillende procedures en software.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1-GFAP::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neuronal nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (40%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide (2%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#B7901</td>
			<td>Molecular weight - 61.83 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, scanning, FV1000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane, UK</td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 4%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>#15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RC147002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images using virtual reality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base 1 M</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#002009239100</td>
			<td>Molecular weight - 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>#sc-29112A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon microscope</td>
			<td>Neurolabware</td>
			<td></td>
			<td>Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044 Initiator</td>
			<td>Wako</td>
			<td>#011-19365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains

Het combineren van virale vectortransductie en weefselzuivering met behulp van de CLARITY-methode maakt het mogelijk om tegelijkertijd verschillende soorten hersencellen en hun interacties te onderzoeken. Virale vectortransductie maakt het mogelijk om verschillende celtypen in verschillende fluorescentiekleuren binnen hetzelfde weefsel te markeren. Cellen kunnen genetisch worden geïdentificeerd door activiteit of projectie. Met behulp van een aangepast CLARITY-protocol is de potentiële steekproefomvang van astrocyten en neuronen met 2-3 ordes van grootte gegroeid. Het gebruik van CLARITY maakt het mogelijk om volledige astrocyten, die te groot zijn om in hun geheel in plakjes te passen, en het onderzoek van de somata met al hun processen mogelijk. Daarnaast biedt het de mogelijkheid om de ruimtelijke interactie tussen astrocyten en verschillende neuronale celtypen te onderzoeken, namelijk het aantal piramidale neuronen in elk astrocytisch domein of de nabijheid tussen astrocyten en specifieke remmende neuronpopulaties. Dit artikel beschrijft in detail hoe deze methoden moeten worden toegepast.

Succesvolle opruiming van dikke hersenweefselplakken resulteert in een nieuwe reeks vragen die kunnen worden gesteld met betrekking tot de eigenschappen van grote celpopulaties in tegenstelling tot de eigenschappen van afzonderlijke cellen of naburige groepen cellen. Om succesvolle resultaten te bereiken, moet men zich strikt houden aan het CLARITY-protocol, omdat er een breed scala aan parameters is waarmee rekening moet worden gehouden om de variantie tussen monsters te verminderen (bijv. Percentage van de helderheid, ...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Het combineren van virale vectortransductie en hersenzuivering met behulp van de CLARITY-methode maakt het mogelijk om tegelijkertijd een groot aantal neuronen en astrocyten te onderzoeken.

Onderzoek naar ruimtelijke interactie tussen astrocyten en neuronen in vrijgemaakte hersenen

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

De helderheidstechniek die voor het eerst werd beschreven in 2013 is een weefselverwijderingstechniek die de bemonstering van grotere hoeveelheden cellen, bloedvaten, dus zelfs eiwitten zoals een enkele celresolutie in dikke hersenplakken mogelijk maakt. Deze techniek maakt de studie van intacte microscopische structuren mogelijk door het hele brein transparant te maken. Dit protocol is een eenvoudige chip en een eenvoudige pijplijn voor het wissen van weefsel.Deze techniek kan worden gebruikt voor het opruimen van weefsels in andere systemen naast hersenweefsels. Om te beginnen sluit u de buis en dop af met parafilm en prikt u twee gaten in de dop. Breng vervolgens stikstofgas uit de tank over met behulp van een flexibele buis met een inwendige diameter van vijf millimeter en een naald van 19 gauge die aan het uiteinde is aangesloten.Begin met ontgassen door de buis aan de buis te bevestigen en gasuitwisseling gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur toe te staan. Maak de pijp los en sluit de gaten onmiddellijk af met modelleerklei. Breng vervolgens de ontgassingsgedichte buizen gedurende 3 1/2 uur over in een bad van 37 graden Celsius om de hydrogeloplossing te polymeriseren.Haal de hersenen uit de buis. Verwijder met behulp van laboratoriumdoekjes de gepolymeriseerde hydrogel rond de hersenen en zorg ervoor dat er geen resterende gel aan het oppervlak van de hersenen blijft vastzitten. Verdeel de hersenen in dikke plakken die alle interessegebieden bevatten.Doe de plakjes in de eerste opruimoplossing en incubeer bij 37 graden Celsius met rotatie bij 70 RPM gedurende 24 uur. Bereid ondertussen een geperforeerde buis voor om de hersenen te plaatsen. Doe de geperforeerde buis in een bekerglas gevuld met tweede reinigingsoplossing op een roerinrichting.Plaats vervolgens de hersenen in het bekerglas en sluit het af met aluminiumfolie om bleken te voorkomen. Nadat het weefsel transparant is geworden, brengen de hersenen over in PBST in incubaat bij 37 graden Celsius met rotatie bij 70 RPM gedurende 24 uur. Vervang de oplossing door verse PBST en zet de incubatie nog 24 uur voort.Breng vervolgens de hersenen over naar PBS bij kamertemperatuur gedurende 24 uur. Verwijder na 24 uur de hersenen van PBS en breng deze over naar een refractieve index matching oplossing. Incubeer de hersenen 's nachts bij 37 graden Celsius.Plaats het monster eerst in het midden van de dia. Maak met behulp van hete lijm muren aan de randen van de dia, bijna net zo hoog als het weefsel. Zorg ervoor dat je een kleine opening laat op een van de hoeken.Naarmate de hete lijmlaag de hoogte van de hersenschijf nadert, brengt u één tot twee druppels van de brekingsindex-overeenkomende oplossing op het monster aan om het bovenoppervlak te bevochtigen en bubbelvorming te voorkomen. Terwijl de hete lijm nog vloeibaar is, sluit u de bovenkant af met een afdekslip, plaatst u deze zo gelijkmatig mogelijk en vult u de kamer met de oplossing voor brekingsindex. Sluit de opening met hete lijm.Als de hete lijmwanden verder reiken dan de randen van de dia, snijdt u de uitschuivende randen. Als een olie-onderdompelingsobjectief wordt gebruikt voor beeldvorming, voegt u nog eens twee tot drie millimeter lijm toe aan de wanden boven de afdekslip om de dompeloplossing te behouden. Na dit protocol wordt het hersenweefsel opgeruimd.Duidelijke hersenplakken werden bereid met behulp van dit protocol om populaties van astrocyten en neuronen in het CA1-gebied van de hippocampus van muizen te visualiseren. Alle astrocyten drukten tdTomato uit en exciterende neuronen drukten H2B-GFP uit in hun kernen. De kamer die was voorbereid voor het geklaarde weefsel was optimaal voor beeldvorming onder een twee foton of confocale microscoop.Met behulp van een microscoop van twee fotonen werden meer dan 300 astrocyten waargenomen in een vrijgemaakt gedeelte van het CA1-gebied van de hippocampus van de muis. De hippocampale astrocyten in rode en piramidale cellen, somata in groen waren zichtbaar en dik, transparant weefsel dat de ruimtelijke nabijheid tussen deze twee celtypen vertegenwoordigde. Met behulp van een scanning laser confocale microscoop werden axonale bundels van exciterende neuronen over een hele hemisfeer getraceerd.Groene bundels werden getraceerd van de dorsale hippocampus naar de super mamillaire lichamen. De rode bundels werden getraceerd van de mamillaire lichamen naar hun oorsprong bij de vent hippocampus. Factoren, zoals temperatuur, concentraties en incubatietijd beïnvloedden de uitkomst van de duidelijkheidsprocedure.Daarom is nauwkeurigheid in elke stap van het protocol van vitaal belang voor het succes van het bereiken van helder weefsel. Met behulp van deze techniek meten we de afstanden tussen neuronen en astrocyten in verschillende hersenstructuren. Dit protocol maakte analyse van twee tot drie ordes van grootte meer cellen mogelijk dan in eerdere studies.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolatie en Cultuur van de Muis Corticale Astrocyten

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

Tactiele Conditioning En Movement Analyse Van antennaal bemonsteringsstrategieën In Honey Bees (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Een Engulfment Assay: Een protocol bij interacties tussen CNS Fagocyten en Neuronen Assess

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolatie, Cultuur en onderhoud op lange termijn van de Primary mesencefale dopaminerge neuronen uit embryonale knaagdieren Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protocol voor drie-dimensionale confocale Morfometrische Analyse van Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolatie en RNA extractie van neuronen, macrofagen en Microglia van larvale Zebrafish hersenen

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

Hoge-resolutie 3D-beeldvorming van rabiës virus infectie in solvent-geklaard hersenweefsel

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargo's in astrocyten

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

Oprichting van een elektrofysiologisch platform voor het modelleren van ALS met regionaal specifieke menselijke pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten en neuronen

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...